Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

Resumen

Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.

Resumen

El ensayo del cometa está ganando popularidad como un medio para evaluar el daño del ADN en las células y tejidos cultivados, particularmente después de la exposición a productos químicos u otros factores estresantes ambientales. El uso del ensayo de cometas en pruebas reglamentarias del potencial genotóxico en roedores ha sido impulsado por la adopción de una directriz de prueba de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) en 2014. Los portaobjetos de ensayo de cometas se preparan típicamente a partir de tejido fresco en el momento de la necropsia; sin embargo, la congelación de muestras de tejido puede evitar desafíos logísticos asociados con la preparación simultánea de diapositivas de múltiples órganos por animal y de muchos animales por estudio. La congelación también permite enviar muestras desde la instalación de exposición a un laboratorio diferente para su análisis, y el almacenamiento de tejido congelado facilita el aplazamiento de la decisión de generar datos de daño de ADN para un órgano determinado. El ensayo del cometa alcalino es útil para detectar roturas de doble y una sola cadena de ADN relacionadas con la exposición, lesiones alcalinas-lábiles y roturas de hebras asociadas con la reparación incompleta de escisión del ADN. Sin embargo, el daño del ADN también puede ser el resultado de cizallamiento mecánico o procedimientos de procesamiento de muestras inadecuados, confundiendo los resultados del ensayo. La reproducibilidad en la recolección y procesamiento de muestras de tejido durante las necropsias puede ser difícil de controlar debido a la fluctuación del personal de laboratorio con diferentes niveles de experiencia en la recolección de tejidos para el ensayo del cometa. Mejorar la coherencia a través de la capacitación de actualización o el despliegue de unidades móviles con personal de laboratorio experimentado es costoso y puede no ser siempre factible. Para optimizar la generación constante de muestras de alta calidad para el análisis de ensayos de cometas, se evaluó un método para homogeneizar cubos de tejido congelados con flash utilizando un dispositivo de picado de tejido personalizado. Las muestras preparadas para el ensayo del cometa por este método se compararon favorablemente en calidad con las muestras de tejido fresco y congelado preparadas por picado durante la necropsia. Además, se midió el daño basal bajo en el ADN en las células de cubos congelados de tejido después de un almacenamiento prolongado.

Introducción

El ensayo del cometa se utiliza cada vez más como un medio para evaluar el daño del ADN en células cultivadas y tejidos expuestos a productos químicos u otros factores de estrés ambientales¹. El ensayo puede detectar roturas de doble y una sola cadena de ADN, lesiones alcalinas-lábiles y roturas de una sola cadena asociadas con la reparación incompleta del ADN. La directriz del Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos de Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) para ensayos farmacéuticos recomienda un ensayo de rotura de hebras de ADN, como el ensayo del cometa como una segunda prueba para complementar el ensayo de micronúcleos de eritrocitos para evaluar la genotoxicidad in vivo y como prueba de seguimiento para evaluar el modo de acción en los órganos diana de la inducción tumoral². La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) recomienda el ensayo in vivo del cometa como una prueba de seguimiento adecuada para investigar la pertinencia de un resultado positivo en una prueba de genotoxicidad in vitro³. En 2014, se aprobó una directriz de ensayo de la OCDE para el ensayo de cometas de roedores, aumentando así la aceptabilidad del ensayo para su uso en pruebas reglamentarias del potencial genotóxico. El ensayo se basa en la separación electroforética de bucles de ADN relajados y fragmentos que migran de nucleoides de células lysed. Básicamente, las células individuales están incrustadas en agarosa que se ha en capas en las diapositivas del microscopio. Las diapositivas se sumergen en el tampón de lisis seguido de una solución alcalina (pH > 13), que permite que el ADN nuclear estrechamente enrollado se relaje y se relaje. Las diapositivas se colocan en un campo eléctrico, que estimula la migración del ADN cargado negativamente hacia el ánodo, creando imágenes que se asemejan a los cometas; la cantidad relativa de ADN en la cola del cometa en comparación con la cabeza del cometa es directamente proporcional a la cantidad de daño del ADN; El contenido de ADN en la cola se cuantifica típicamente mediante un software de imágenes digitales.

Debido a que el ensayo del cometa detecta ADN fragmentado, la cuantificación precisa del daño del ADN inducido por la exposición puede confundirse por la fragmentación de la cromatina asociada con la necrosis o la apoptosis resultante de la citotoxicidad o el estrés inducidos por el tratamiento. Además, el daño del ADN puede ocurrir como resultado de un cizallamiento mecánico o un procesamiento inadecuado de muestras^4. La importancia de mantener el tejido cosechado refrigerado antes de la preparación de la diapositiva para minimizar el nivel basal de daño en el ADN se ha demostrado previamente^5,6. Muchos laboratorios preparan diapositivas de ensayo de cometas a partir de tejido fresco; sin embargo, esto puede ser logísticamente difícil al preparar diapositivas de múltiples tipos de tejidos por animal en un estudio con un gran número de animales. Además, esto presenta un problema cuando la preparación y el análisis de diapositivas se producen en un laboratorio remoto, lo que requiere el envío de muestras. Por ejemplo, el Programa Nacional de Toxicología de los Estados Unidos incluye el ensayo del cometa como un componente de su programa de pruebas de toxicología genética (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) y a veces incorpora el ensayo en estudios de toxicidad por dosis repetidas de 28 o 90 días; esto requiere la recolección de tejido por el laboratorio en la vida y la transferencia de muestras a otro laboratorio para su análisis. Para lograr esto, las piezas de tejido se pican, y / o células epiteliales del tracto gastrointestinal se raspan y las suspensiones celulares se congelan y se almacenan en un congelador para su posterior envío y almacenamiento por el laboratorio receptor hasta el análisis⁷. El manejo adecuado de las muestras es crucial para obtener datos de alta calidad utilizando tejido congelado; sin embargo, la manipulación reproducible de muestras de tejidos durante las necropsias realizadas por personal en constante cambio es difícil de controlar, especialmente en laboratorios de la vida que no cosechan rutinariamente tejidos para el ensayo del cometa. La capacitación más actualizada del personal de necropsia o el uso de una unidad móvil atendida por personal de laboratorio experimentado para recoger muestras de tejido fresco o congelado es a menudo demasiado costosa, no factible, o simplemente infravalorada.

Para asegurar mejor la generación constante de muestras de tejido de alta calidad para su transferencia a un sitio remoto para el análisis de ensayos de cometas, se exploró la utilidad de un método publicado⁶ de preservación de tejidos a partir de cubos de tejido congelados. En este método, los cubos congelados de tejido se cargan en un dispositivo de picado de tejido de acero inoxidable(Figura 1) que se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene tampón frío. El cubo de tejido se empuja a través de una pequeña malla de calibre al final del dispositivo. Forzando repetidamente la suspensión de tejido a través del tamiz de malla en ambas direcciones varias veces resulta en una suspensión de una sola célula relativamente uniforme. Las muestras preparadas por este método se compararon favorablemente en calidad con muestras de tejido fresco y congelado preparadas por picado. Como beneficio adicional, a diferencia de las muestras picadas, los cubos de tejido se pueden almacenar congelados durante períodos prolongados de tiempo y todavía producen resultados de alta calidad en el ensayo del cometa.

Protocolo

Los tejidos fueron cosechados durante la realización de estudios realizados en instalaciones acreditadas por la AAALAC en laboratorios contractuales NTP de acuerdo con las regulaciones de Buenas Prácticas de Laboratorio (21 CFR Parte 58) y protocolos de uso animal aprobados por el Animal Institucional Comité de Cuidado y Uso (IACUC) en cada laboratorio.

1. Cosecha y procesamiento de tejidos

NOTA: Es útil preparar tubos de muestra duplicados (por ejemplo, hígado) o transferir aproximadamente la mitad de una muestra a otro tubo de almacenamiento (por ejemplo, duodeno, estómago) para permitir el reanálisis, si es necesario. Para minimizar la posible variabilidad de muestra a muestra para los tejidos del tracto intestinal, se recomienda tener cuidado de tomar muestras de la misma región de tejido en relación con el estómago para cada animal, y una muestra se divide para generar muestras duplicadas. Los fórceps plásticos se recomiendan para transferir tejidos pegajosos como el cerebro. Como opción, las preparaciones de tejido picado, raspado o homogeneizado pueden filtrarse para lograr suspensiones homogéneas de una sola célula utilizando un colador celular de 40 m unido a un tubo cónico.

1. Retire los tejidos, órganos y desechos de conexión adheridos de los órganos de interés. Inmediatamente después de la extracción, swish el órgano vigorosamente en una lancha de pesaje de tamaño medio que contiene 7 ml de solución de picado en frío recién preparado (Mg^++,Ca^{+ +} y fenol rojo solución de sal equilibrada de Hank, 10% v / v DMSO, y 20 mM EDTA pH 7.5) para eliminar la sangre residual y los desechos.
2. Transfiera cada órgano a otra bote de pesaje limpia que contenga suficiente solución de picado en frío (7 ml) para mantener el tejido sumergido, sobre hielo, hasta su posterior procesamiento.
3. Retire una sección de cada órgano de interés y colóquela en un casete de incrustación. Arreglo en 10% de formalina tamponada neutra, guarnición, e incrustación de parafina de acuerdo con los procedimientos estándar del laboratorio para una posible evaluación de histopatología futura.
4. Para el hígado, corte una sección longitudinal de 5 mm del lóbulo izquierdo y abotee suavemente en 7 ml de solución de picado en frío. Coloque la tira de tejido en un bote de pesaje de tamaño medio limpio que contenga 7 ml de solución de picado en frío y manténgala sobre hielo hasta que esté lista para procesarse más (paso 1.8 o 1.11).
5. Para el duodeno, corte una porción de 10 mm del duodeno proximal al estómago. Con una aguja de 21–25 G, enjuague para eliminar los desechos y bacterias.
   1. Inserte la aguja en un extremo del duodeno y enjuague con 1 ml de solución de picado en frío.
   2. Enjuague la otra dirección volteando el duodeno y repitiendo con otra solución de 1 ml de picado. Deseche la aguja.
   3. Cortar el duodeno y enjuagar en 7 ml de solución de picado antes de ponerlo en una embarcación de pesaje de tamaño medio que contenga 7 ml de solución de picado limpio; mantener en hielo hasta que esté listo para procesarmás (paso 1.8 o 1.11).
6. Para el cerebro, puede ser útil para dividir primero el cerebro en dos hemisferios; un hemisferio se puede guardar para una posible histopatología (ver paso 1.2).
   1. Diseccionar la(s) región(s) cerebral(es) de interés y suavemente swish en 7 ml de solución de picado en frío.
   2. Transfiera los tejidos a un bote de pesaje de tamaño mediano limpio que contenga 7 ml de solución de picado en frío y manténgalos sobre hielo hasta que estén listos para procesarse más (paso 1.8 o 1.11; tenga en cuenta que las regiones pequeñas como el cerebelo y el hipocampo pueden no requerir más recortes).
7. Para el estómago
   1. Retire y deseche el forestomach. Abra el estómago glandular y lave libre de alimentos usando 7 ml de tampón de picado frío en un bote de pesaje de tamaño mediano.
   2. Retire una tira de 5 mm de estómago glandular proximal al duodeno para la fijación para una posible evaluación histopatología (ver paso 1.2).
   3. Coloque el estómago restante en 7 ml de tampón de picado frío en un bote de pesaje de tamaño mediano e incubar sobre hielo durante 15-30 min.
      NOTA: Este paso de incubación puede no ser necesario; este paso se incluyó en el protocolo de validación JaCVAM, pero no se menciona en la directriz de prueba de la OCDE^8,9.
   4. Transfiera el estómago a una pieza limpia de parafina (o plato de Petri o bote de pesaje) y raspe suavemente el epitelio superficial dos o más veces usando una hoja de bisturí o un rascador de politefluoroeteno (PTFE) para eliminar los desechos. Recoger la mucosa gástrica con fórceps y enjuagar con 1 ml de tampón de picado frío utilizando un pipeta. Transfiera el tejido estomacal a una superficie o plato limpio.
   5. Raspar cuidadosamente el epitelio estomacal 4–5 veces (más, si es necesario) en la solución de picado (típicamente 250 l/ratón o 500-1.000 l/rata) con la parte posterior de una cuchilla de bisturí o un rascador de PTFE para liberar las células. Opcionalmente, enjuague el tejido con un volumen aproximadamente igual de solución de picado para recuperar más células. Recoger la solución de picado que contiene las células liberadas utilizando un pipeta y transferir a un tubo de microcentrífuga en el hielo.
8. Para muestras de tejido de picado, corte una sección de 3-4 mm de tejido hepático o cerebral o 5 mm de duodeno y transfiera a un tubo de microcentrífuga etiquetado de 1,5 o 2,0 ml que contenga 1 ml de solución de picado en frío. Picado rápidamente (30 s) con tijeras de picado hasta que se disperse finamente, manteniendo la muestra fría. La muestra debe verse ligeramente turbia; sin embargo, es común que queden algunas piezas que se asienten en la parte inferior del tubo.
9. Para utilizar el tejido fresco, mantenga los tubos que contienen tejido picado o células epiteliales raspadas sobre hielo; utilizar el tejido para preparar los portaobjetos dentro de aproximadamente 1 h de la cosecha (delineado en la sección 2).
10. Para congelar las muestras de tejido, inmediatamente después de la picadura o recolección de células epiteliales raspadas
    1. Fije la tapa del tubo y el tubo de caída en un matraz Dewar que contenga nitrógeno líquido; pueden mantenerse en nitrógeno líquido durante la duración de la necropsia (3 h).
    2. Recuperar tubos usando un cordón y colocar en hielo seco para ordenar. Transfiera los tubos a una caja de congelador sobre hielo seco y almacene la caja en un congelador de -80 oC.
11. Para preparar cubos congelados de tejido, corte varios trozos pequeños de tejido (4 mm de diámetro y 6 mm de longitud; Figura 1).
    1. Colócalos individualmente directamente en un bote de pesaje mediano u otro recipiente adecuado que contenga nitrógeno líquido.
    2. Espere unos segundos hasta que las piezas se congelen por completo y transfiera cubos de tejido congelado individuales a un tubo de microcentrífuga etiquetado o criotubo mantenido en hielo seco; no permita que las piezas se agrupen durante el proceso de congelación.
    3. Transfiera los tubos a una caja de congelador sobre hielo seco y almacene la caja en un congelador de -80 oC.

2. Preparación de diapositivas

1. Para tejido picado/raspado
   1. Mantenga los tubos que contienen tejidos frescos sobre hielo húmedo.
   2. Coloque los tubos de tejido congelado en un baño de agua a temperatura ambiente hasta que las muestras estén completamente descongeladas, a la vez que se asegura de que se mantengan frías. Transfiera inmediatamente los tubos al hielo.
   3. Inmediatamente antes de retirar las células para su transferencia a agarosa (paso 2.3), mezcle cada suspensión celular suavemente; para muestras no filtradas, permita que trozos grandes se asienten en la parte inferior del tubo. Mantenga todos los tubos en hielo hasta que se hayan preparado diapositivas para todas las muestras.
2. Para tejido en cubos
   1. Recuperar los tubos que contienen cubos de tejido del congelador de 80 oC y mantener en hielo seco hasta la preparación del deslizamiento.
   2. Aliquot 1 mL del medio del comerciante (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) o solución de picado en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL etiquetado para cada muestra y mantener en hielo.
   3. Trabajando rápidamente para evitar la descongelación de tejidos, coloque un cubo de tejido en el extremo abierto de un dispositivo de picado de tejido a temperatura ambiente(Figura 1). Se pueden utilizar varias piezas de tejido; si es necesario, el tejido congelado se puede cortar o agrietar en trozos más pequeños utilizando un mortero frío y un pestillo para reducir el tamaño del cubo para caber en el dispositivo.
   4. Inserte rápidamente un émbolo de jeringa que coincida con el tamaño en el dispositivo para empujar el tejido hacia el extremo de la malla que luego debe colocarse en el tubo de microcentrífuga que contiene una solución de picado en frío; evitar forzar el líquido a desbordar el tubo. Sumerja el extremo de malla del dispositivo durante aproximadamente 5-10 s en la solución de picado en frío para permitir que el tejido se descontezcan por completo.
   5. Presione completamente el émbolo hasta que las células se ven extruyendo a través de los poros de malla. A continuación, tire del émbolo hacia arriba aproximadamente 2,5 cm y presione hacia abajo completamente; repetir el proceso varias veces hasta que la solución de picado se vuelva turbia.
   6. Si es necesario, la muestra puede concentrarse para aumentar la densidad celular mediante centrifugación refrigerada durante 5 min a 1100 rpm y eliminación de una porción del sobrenadante.
   7. Repita el proceso para todas las muestras utilizando un dispositivo de picado de tejido limpio para cada muestra.
3. Transfiera 50 ml de suspensión celular a un tubo que contenga 450 ml de agarosa de punto de fusión bajo al 0,5% a 37 oC.
   NOTA: Los volúmenes se pueden ajustar, pero la cantidad de agarosa debe ser del 1%.
4. Preparar y puntuar diapositivas como se describió anteriormente^10,11.

Resultados

Estudio 1
El hígado fue cosechado de dos cohortes de ratas macho Sprague Dawley administradas aceite de maíz durante 4 días, escalonadas por una semana. Se prepararon diapositivas a partir de tejido recién picado, tejido picado congelado y tejido en cubo congelado procesado en la solución de cintura o medio de Merchant utilizando el dispositivo de picado de tejido. Los tejidos congelados obtenidos de animales de la primera cohorte se evaluaron después del almacenamiento del congelador durante 3,...

Discusión

Como se demostró anteriormente^7,12,13, tejido picado congelado con flash correctamente manejado proporciona buenos resultados en el ensayo del cometa. De hecho, los valores basales de ADN de cola porcentual para el hígado de rata y ratón picado congelado según lo normal son del 6 %, como se recomienda en la directriz de prueba⁹ de la OCDE para muestras de hígado de rata recién picada. Se han obtenid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL)	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL)	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B