Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.

Zusammenfassung

Der Kometentest gewinnt an Popularität als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben, insbesondere nach der Exposition gegenüber Chemikalien oder anderen Umweltstressoren. Die Verwendung des Kometentests bei regulatorischen Tests auf genotoxisches Potenzial bei Nagetieren wurde durch die Annahme einer Testrichtlinie der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) im Jahr 2014 vorangetrieben. Kometen-Assay-Dias werden in der Regel aus frischem Gewebe zum Zeitpunkt der Nekropsie zubereitet; Das Einfrieren von Gewebeproben kann jedoch logistische Herausforderungen vermeiden, die mit der gleichzeitigen Vorbereitung von Dias aus mehreren Organen pro Tier und von vielen Tieren pro Studie verbunden sind. Das Einfrieren ermöglicht auch den Versand von Proben aus der Expositionseinrichtung an ein anderes Labor zur Analyse, und die Lagerung von gefrorenem Gewebe erleichtert das Aufschieben einer Entscheidung über die Generierung von DNA-Schadensdaten für ein bestimmtes Organ. Der alkalische Kometentest ist nützlich, um expositionsbedingte DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und Strangbrüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Exzisionsreparatur zu erkennen. DNA-Schäden können jedoch auch durch mechanischescheren oder unsachgemäße Probenverarbeitungsverfahren entstehen, was die Ergebnisse des Tests verwirrt. Die Reproduzierbarkeit bei der Entnahme und Verarbeitung von Gewebeproben während der Nekropsien kann aufgrund schwankender Labormitarbeiter mit unterschiedlicher Erfahrung bei der Ernte von Geweben für den Kometentest schwer zu kontrollieren sein. Die Verbesserung der Konsistenz durch Auffrischungsschulungen oder den Einsatz mobiler Einheiten, die mit erfahrenem Laborpersonal besetzt sind, ist kostspielig und möglicherweise nicht immer machbar. Um die konsistente Erzeugung hochwertiger Proben für die Kometen-Assay-Analyse zu optimieren, wurde eine Methode zur Homogenisierung von flashgefrorenen Gewebewürfeln mit einem kundenspezifischen Gewebeminziergerät evaluiert. Proben, die nach dieser Methode für den Kometentest hergestellt wurden, verglichen in der Qualität günstig in der Qualität mit frischen und gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken während der Nekropsie hergestellt wurden. Darüber hinaus wurden niedrige Basis-DNA-Schäden in Zellen aus gefrorenen Gewebewürfeln nach längerer Lagerung gemessen.

Einleitung

Der Kometentest wird zunehmend als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben verwendet, die Chemikalien oder anderen Umweltstressoren ausgesetzt sind¹. Der Test kann DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und einsträngige Brüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Reparatur erkennen. Der International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) empfiehlt einen DNA-Strangbruchtest wie den Kometentest als zweiten Test zur Ergänzung des Nagetier-Erythrozyten-Mikrokern-Assays zur Beurteilung der In-vivo-Genotoxizität und als Folgetest zur Beurteilung der Wirkungsweise in Zielorganen der Tumorinduktion². Die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) empfiehlt den In-vivo-Kometentest als geeigneten Folgetest zur Untersuchung der Relevanz eines positiven Ergebnisses in einem In-vitro-Genotoxizitätstest³. Im Jahr 2014 wurde eine OECD-Testrichtlinie für den Nagetierkometentest genehmigt, wodurch die Akzeptanz des Assays für die Anwendung bei regulatorischen Tests des genotoxischen Potenzials erhöht wurde. Der Test basiert auf der elektrophoretischen Trennung von entspannten DNA-Schleifen und Fragmenten, die aus Nukleoiden von lysierten Zellen wandern. Grundsätzlich sind einzelne Zellen in Agarose eingebettet, die auf Mikroskopschlitten geschichtet wurde. Die Dias werden dann in den Lysepuffer eingetaucht, gefolgt von einer alkalischen (pH > 13) Lösung, die es der fest gewickelten Kern-DNA ermöglicht, sich zu entspannen und zu entspannen. Dias werden dann in ein elektrisches Feld gelegt, das die Migration negativ geladener DNA zur Anode stimuliert und Bilder erzeugt, die Kometen ähneln; die relative MENGE der DNA im Kometenschweif im Vergleich zum Kometenkopf ist direkt proportional zur Menge der DNA-Schäden; DER DNA-Gehalt im Schwanz wird in der Regel mit hilfe digitaler Bildgebungssoftware quantifiziert.

Da der Kometentest fragmentierte DNA erkennt, kann eine genaue Quantifizierung von expositionsinduzierten DNA-Schäden durch Chromatinfragmentierung im Zusammenhang mit Nekrose oder Apoptose infolge behandlungsinduzierter Zytotoxizität oder Stress verwirrt werden. Darüber hinaus kann eine DNA-Schädigung durch mechanisches Scheren oder unsachgemäße Probenbearbeitung auftreten⁴. Die Bedeutung der Aufrechterhaltung des vor der Folienvorbereitung gekühlten Erntegewebes zur Minimierung des Ausgangsniveaus der DNA-Schäden wurde bereits^5,6gezeigt. Viele Laboratorien bereiten Kometenasssay-Dias aus frischem Gewebe vor; Dies kann jedoch logistisch eine Herausforderung darstellen, wenn diaginen von mehreren Gewebetypen pro Tier in einer Studie mit einer großen Anzahl von Tieren vorbereitet werden. Darüber hinaus stellt dies ein Problem dar, wenn die Vorbereitung und Analyse von Dias in einem entfernten Labor erfolgen soll, was den Versand von Proben erforderlich macht. Zum Beispiel umfasst das U.S. National Toxicology Program den Kometentest als Bestandteil seines genetischen toxikologischen Testprogramms (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) und nimmt den Assay manchmal in 28 oder 90-Tage-Studien zur Toxizität bei wiederholter Totdosis auf; dies erfordert die Entnahme von Gewebe durch das Labor im Leben und die Übertragung von Proben in ein anderes Labor zur Analyse. Um dies zu erreichen, werden Gewebeteile gehackt und/oder Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes abgekratzt und Zellsuspensionen werden eingefroren und in einem Gefrierschrank für die nachfolgende Verbringung und Lagerung durch das empfangende Labor bis zur Analyse⁷gelagert. Die ordnungsgemäße Handhabung von Proben ist entscheidend für die Beschaffung hochwertiger Daten mit gefrorenem Gewebe; Reproduzierbare Manipulation von Gewebeproben während Nekropsien, die von ständig wechselndem Personal durchgeführt werden, ist jedoch schwer zu kontrollieren, insbesondere in Labors, die nicht routinemäßig Gewebe für den Kometentest ernten. Die Auffrischung des Nekropsiepersonals oder die Nutzung einer mobilen Einheit, die von erfahrenem Laborpersonal besetzt ist, um frische oder gefrorene Gewebeproben zu sammeln, ist oft zu kostspielig, nicht durchführbar oder einfach unterbewertet.

Um eine konsistente Generierung hochwertiger Gewebeproben für die Übertragung an einen entfernten Ort für kometenassatoume Analysen zu gewährleisten, wurde der Nutzen einer veröffentlichten Methode⁶ der Gewebekonservierung aus eingefrorenen Flash-Gewebewürfeln untersucht. Bei dieser Methode werden gefrorene Gewebewürfel in eine Gewebeminkvorrichtung aus Edelstahl(Abbildung 1) geladen, die in ein Mikrozentrifugenrohr mit Kaltpuffer gelegt wird. Der Gewebewürfel wird dann durch ein kleines Messnetz am Ende des Geräts geschoben. Das wiederholte Zwingen der Gewebesuspension durch das Netzsieb in beide Richtungen führt zu einer relativ gleichmäßigen einzelzelligen Suspension. Proben, die mit dieser Methode hergestellt wurden, verglichen in der Qualität sowohl mit frischen als auch gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken hergestellt wurden. Als zusätzlichen Vorteil, im Gegensatz zu Hackfleischproben, Gewebewürfel können gefroren für längere Zeit gelagert werden und dennoch qualitativ hochwertige Ergebnisse in der Kometen-Assay liefern.

Protokoll

Gewebe wurden während der Durchführung von Studien in AAALAC-akkreditierten Einrichtungen in NTP-Vertragslaboratorien gemäß den Vorschriften für gute Laborpraxis (21 CFR Part 58) und den von der Institutionellen Tierhaltung genehmigten Tierverwendungsprotokollen geerntet. Care and Use Committee (IACUC) in jedem Labor.

1. Gewebeernte und -verarbeitung

HINWEIS: Es ist sinnvoll, doppelte Probenröhrchen (z. B. Leber) zuzubereiten oder etwa die Hälfte einer Probe in ein anderes Speicherröhrchen (z. B. Zwölffingerdarm, Magen) zu übertragen, um bei Bedarf eine erneute Analyse zu ermöglichen. Um die potenzielle Variabilität von Probe zu Probe für Gewebe des Darmtraktes zu minimieren, wird empfohlen, für jedes Tier die gleiche Geweberegion relativ zum Magen zu beproben und eine Probe zu teilen, um doppelte Proben zu erzeugen. Kunststoffzange werden für die Übertragung von klebrigen Geweben wie Gehirn empfohlen. Optional können gehackte, abgekratzte oder homogenisierte Gewebepräparate gefiltert werden, um homogene einzellige Suspensionen zu erzielen, indem ein 40 m großes Zellsieb verwendet wird, das an einem konischen Rohr befestigt ist.

1. Entfernen Sie alle angeschlossenen Verbindungsgewebe, Organe und Schmutz von Organen von Interesse. Unmittelbar nach der Entfernung das Organ kräftig in einem mittelgroßen Wägeboot mit einer kalten, frisch zubereiteten Hacklösung (Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ und phenolrot-frei Hankes Balanced Salt Solution, 10% v/v DMSO und 20 mM EDTA pH 7.5) kräftig schwenken, um Restblut und Schmutz zu entfernen.
2. Übertragen Sie jedes Organ auf ein anderes sauberes Wägeboot, das eine ausreichende Kaltschnittlösung enthält, um das Gewebe bis zur Weiterenverarbeitung auf Eis unter Wasser zu halten.
3. Entfernen Sie einen Abschnitt jedes organischen Interesses und legen Sie ihn in eine Einbettkassette. Fix in 10% neutral gepuffertes Formalin, Trimmund und Paraffin einbetten nach den Standardverfahren des Labors für eine mögliche zukünftige histopathologische Bewertung.
4. Für die Leber einen 5 mm Längsschnitt des linken Lappens schneiden und vorsichtig in 7 ml Kaltschnittlösung schwenken. Den Gewebestreifen in ein sauberes mittelgroßes Wägeboot mit einer Kaltschnittlösung von 7 ml legen und auf Eis halten, bis er weiterverarbeitet werden kann (Schritt 1.8 oder 1.11).
5. Für das Zwölffingerdarm einen 10 mm Anteil des Zwölffingerdarms proximal in den Magen schneiden. Mit einer 21–25 G Nadel, spülen, um Schmutz und Bakterien zu entfernen.
   1. Nadel in ein Ende des Zwölffingerdarms geben und mit 1 ml Kaltschnittlösung bündig einspülen.
   2. Spülen Sie die andere Richtung, indem Sie das Zwölffingerdarm umdrehen und sich mit weiteren 1 ml Hacklösung wiederholen. Entsorgen Sie die Nadel.
   3. Das Zwölffingerdarm aufschneiden und in einer Zerkleinerungslösung von 7 ml abspülen, bevor man es in ein mittelgroßes Wägeboot mit einer sauberen Hacklösung von 7 ml legt; bis zur weiterverarbeitung auf Eis bleiben (Schritt 1.8 oder 1.11).
6. Für das Gehirn kann es nützlich sein, zuerst das Gehirn in zwei Hemisphären zu teilen; eine Hemisphäre kann für eine mögliche Histopathologie gespeichert werden (siehe Schritt 1.2).
   1. Sezieren Sie die Hirnregion(n) von Interesse und schwenken Sie sanft in 7 ml Kaltschnittlösung.
   2. Gewebe auf ein sauberes mittelgroßes Wägeboot mit einer Kaltschnittlösung von 7 ml übertragen und auf Eis halten, bis es weiterverarbeitet werden kann (Schritt 1.8 oder 1.11; beachten Sie, dass kleine Regionen wie Kleinhirn und Hippocampus keine weitere Beschneidung erfordern).
7. Für den Magen
   1. Entfernen und entsorgen Sie den Vordermagen. Den Drüsenmagen aufschneiden und mit einem kalten Hackpuffer in einem mittelgroßen Wägeboot von Lebensmitteln frei waschen.
   2. Entfernen Sie einen 5 mm Streifen Drüsenmagen proximal zum Zwölffingerdarm zur Fixierung für eine mögliche histopathologische Bewertung (siehe Schritt 1.2).
   3. Den restlichen Magen in einen kalten Hackpuffer von 7 ml in ein mittelgroßes Wägeboot geben und 15–30 min auf Eis bebrüten.
      HINWEIS: Dieser Inkubationsschritt ist möglicherweise nicht erforderlich. Dieser Schritt wurde in das JaCVAM-Validierungsprotokoll aufgenommen, wird aber in der OECD-Testrichtlinie^8,9nicht erwähnt.
   4. Übertragen Sie den Magen auf ein sauberes Stück Paraffin (oder Petrischale oder Wiegenboot) und kratzen Sie das Oberflächenepithel zwei oder mehr Mal mit einem Skalpellblatt oder einem Polytetrafluorethen (PTFE) Schaber vorsichtig, um Schmutz zu entfernen. Die Magenschleimhaut mit Zangen aufnehmen und mit 1 ml Kaltschnittpuffer mit einer Pipette abspülen. Übertragen Sie das Magengewebe auf eine saubere Oberfläche oder Schale.
   5. Das Magenepithel 4-5-mal (ggf. mehr) in Derinzlösung (typischerweise 250 l/Maus oder 500-1.000 l/Ratte) mit der Rückseite eines Skalpellmessers oder PTFE-Schabers vorsichtig mit der Rückseite eines Skalpellmessers oder PTFE-Schabers zerkleinern, um die Zellen freizusetzen. Optional spülen Sie Gewebe mit einem ungefähr gleichen Volumen von Hacklösung, um mehr Zellen zu erholen. Sammeln Sie die Hacklösung, die freigesetzte Zellen enthält, mit einer Pipette und übertragen Sie sie auf Eis in ein Mikrozentrifugenrohr.
8. Zum Zerschneiden von Gewebeproben einen 3–4 mm Abschnitt des Leber- oder Hirngewebes oder 5 mm Zwölffingerdarm schneiden und in ein beschriftetes 1,5 oder 2,0 ml Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml Kaltzerlegungslösung übertragen. Schnell Hackfleisch (ca. 30 s) mit Schneidschere, bis fein dispergiert, während die Probe kalt. Das Beispiel sollte leicht bewölkt aussehen; es ist jedoch üblich, dass einige Stücke bleiben, die sich an der Unterseite des Rohres absetzen.
9. Um das Gewebe frisch zu verwenden, pflegen Sie Rohre mit Hackfleisch oder zerkratzten Epithelzellen auf Eis; verwenden Sie das Gewebe, um Kometenrutschen innerhalb von etwa 1 h der Ernte vorzubereiten (in Abschnitt 2 beschrieben).
10. Zum Einfrieren der Gewebeproben, unmittelbar nach dem Hacken oder Sammeln von abgekratzten Epithelzellen
    1. Sichern Sie den Rohrdeckel und tropfen Sie Rohr in einem Dewar-Kolben mit flüssigem Stickstoff; Rohre können für die Dauer der Nekropsie in flüssigem Stickstoff gehalten werden ( 3 h).
    2. Holen Sie Rohre mit einer Pfanne und legen Sie auf Trockeneis zu sortieren. Rohre auf Trockeneis und Lagerbox in einem Gefrierschrank von -80 °C in eine Gefrierbox überführen.
11. Zur Herstellung von gefrorenen Gewebewürfeln mehrere kleine Gewebestücke (Durchmesser 4 mm und 6 mm Länge) schneiden; Abbildung 1).
    1. Legen Sie sie einzeln direkt in ein mittelgroßes Wägeboot oder ein anderes geeignetes Gefäß mit flüssigem Stickstoff.
    2. Warten Sie einige Sekunden, bis die Stücke vollständig einfrieren und übertragen Sie einzelne gefrorene Gewebewürfel in ein beschriftetes Mikrozentrifugenrohr oder Kryotube, das auf Trockeneis aufbewahrt wird; lassen Sie die Teile während des Gefriervorgangs nicht verklumpen.
    3. Rohre auf Trockeneis und Lagerbox in einem Gefrierschrank von -80 °C in eine Gefrierbox überführen.

2. Folienvorbereitung

1. Für gehacktes/geschlresttes Gewebe
   1. Rohren mit frischem Gewebe auf nassem Eis pflegen.
   2. Legen Sie Rohre aus gefrorenem Gewebe in ein Raumtemperatur-Wasserbad, bis die Proben vollständig aufgetaut sind, während Sie sicherstellen, dass sie kalt gehalten werden. Übertragen Sie die Rohre sofort auf Eis.
   3. Unmittelbar vor dem Zurückziehen der Zellen für die Übertragung auf Agarose (Schritt 2.3), mischen Sie jede Zellsuspension sanft; bei nicht gefilterten Proben große Stücke an der Unterseite des Rohres absetzen lassen. Halten Sie alle Rohre auf Eis, bis die Dias für alle Proben vorbereitet wurden.
2. Für würfelförmiges Gewebe
   1. Rohre mit Gewebewürfeln aus dem 80 °C-Gefrierschrank holen und auf Trockeneis bis zur Gleitvorbereitung pflegen.
   2. Aliquot 1 ml Handelsmedium (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaEDTA, pH 7,4) oder Mincing-Lösung in ein markiertes 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr für jede Probe und auf Eis wartend.
   3. Arbeiten Sie schnell, um das Auftauen des Gewebes zu vermeiden, legen Sie einen Würfel aus Gewebe in das offene Ende eines Raumtemperatur-Gewebezerschneidegeräts (Abbildung 1). Mehrere Gewebestücke können verwendet werden; bei Bedarf kann das gefrorene Gewebe mit einem kalten Mörtel und Stößel in kleinere Stücke geschnitten oder geknackt werden, um die Würfelgröße zu reduzieren, um in das Gerät zu passen.
   4. Legen Sie schnell einen größenangepassten Spritzenkolben in das Gerät ein, um das Gewebe an das Netzende zu schieben, das dann in das Mikrozentrifugenrohr mit Kaltzerkleinerungslösung gelegt werden sollte; vermeiden Sie, dass die Flüssigkeit das Rohr überläuft. Tauchen Sie das Netzende des Geräts für ca. 5-10 s in die Kaltschnittlösung ein, damit das Gewebe vollständig auftauen kann.
   5. Drücken Sie den Kolben vollständig, bis Zellen durch die Netzporen extrudieren. Ziehen Sie dann den Kolben ca. 2,5 cm nach oben und drücken Sie wieder vollständig nach unten; wiederholen Sie den Vorgang mehrmals, bis die Hacklösung trüb wird.
   6. Bei Bedarf kann die Probe konzentriert werden, um die Zelldichte durch gekühlte Zentrifugation für 5 min bei 1100 U/min und Entfernung eines Teils des Überstandes zu erhöhen.
   7. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Proben mit einem sauberen Gewebe-Mincing-Gerät für jede Probe.
3. Übertragen Sie 50 l Zellsuspension in ein Rohr, das 450 l 0,5 % Niedrigschmelzpunkt-Agarose bei 37 °C enthält.
   HINWEIS: Die Mengen können angepasst werden, aber die Menge an Agarose sollte 1 % betragen.
4. Vorbereiten und Bewerten von Folien wie zuvor beschrieben^10,11.

Ergebnisse

Studie 1
Leber wurde aus zwei Kohorten von männlichen Sprague Dawley Ratten geerntet, die 4 Tage lang Maisöl verabreichten, gestaffelt um eine Woche. Die Dias wurden aus frisch gehacktem Gewebe, gefrorenem Hackfleisch und gefrorenem Würfelgewebe hergestellt, das in Merchants Medium oder Der Hacklösung mit dem Gewebezerkleinerungsgerät verarbeitet wurde. Gefrorenegewebe, die von Tieren aus der ersten Kohorte gewonnen wurden, wurden nach der Tiefkühllagerung für 3,5 Monate bewertet. Gefrorenegewe...

Diskussion

Wie bereits gezeigt^7,12,13, richtig behandelt Flash gefrorenes Hackfleisch liefert gute Ergebnisse in der Kometen-Assay. Tatsächlich liegen die in unserem Labor hergestellten Basiswerte für gefrorene gehackte Ratten- und Mausleber in der Regel bei 6 %, wie in der OECD-Testrichtlinie⁹ für frisch gehackte Leberproben von Ratten empfohlen. Gute Ergebnisse wurden von mehreren Laboratorien mit einer Vielzah...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL)	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL)	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B