Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК

Этот протокол описывает несколько процедур для подготовки высококачественных образцов замороженных тканей во время некропсии для использования в анализе кометы для оценки повреждения ДНК: 1) рубленая ткань, 2) Царапины эпителиальных клеток из желудочно-кишечного тракта, и 3) кубических тканей образцы, требующие гомогенизации с помощью устройства для измельчения тканей.

Аннотация

Анализ кометы набирает популярность как средство оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, особенно после воздействия химических веществ или других экологических стрессоров. Использование анализа кометы в регулятивном тестировании генотоксического потенциала у грызунов было обусловлено принятием в 2014 году директивы Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Комета асссея слайды, как правило, готовятся из свежей ткани во время некропсии; однако, замораживание образцов тканей может избежать логистических проблем, связанных с одновременной подготовкой слайдов из нескольких органов на животное и от многих животных в исследовании. Замораживание также позволяет отгружать образцы из объекта воздействия в другую лабораторию для анализа, а хранение замороженных тканей облегчает отсрочку принятия решения о генерации данных о повреждении ДНК для данного органа. Анализ щелочной кометы полезен для обнаружения двух- и однострочных разрывов ДНК, щелочных лабильных поражений и разрывов нитей, связанных с неполным восстановлением иссечения ДНК. Тем не менее, повреждение ДНК может также в результате механических стрижки или неправильной обработки образцов процедур, смешивая результаты анализа. Воспроизводимость в сборе и обработке образцов тканей во время некропсии может быть трудно контролировать из-за колебания лабораторного персонала с различным уровнем опыта в сборе тканей для проверки кометы. Повышение согласованности путем повышения квалификации или развертывания мобильных подразделений, укомплектованных опытным лабораторным персоналом, сопряжено с большими расходами и не всегда может быть осуществимо. Для оптимизации последовательного поколения высококачественных образцов для анализа анализа анализа комет был оценен метод гомогенизации флэш-замороженных кубов ткани с помощью настраиваемого устройства для рубки тканей. Образцы, подготовленные для анализа кометы этим методом, по сравнению по качеству с образцами свежих и замороженных тканей, подготовленными путем измельчения во время некропсии. Кроме того, низкий базовый ущерб ДНК измерялся в клетках из замороженных кубов ткани после длительного хранения.

Введение

Анализ кометы все чаще используется в качестве средства оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, подвергающихся воздействию химических веществ или других экологических стрессоров^1. Анализ может обнаружить ДНК двух- и однострочных разрывов, щелочных лабильных поражений, и однострочные перерывы, связанные с неполным ремонтом ДНК. Международный совет по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для использования человека (ICH) руководство для фармацевтического тестирования рекомендует ДНК нити асссе, такие как анализ кометы в качестве второго теста в дополнение к грызунов эритроцита микронуклета анализа для оценки виво генотоксичности и в качестве последующего теста для оценки режима действия в целевых органов опухоли^{опухоли 2}. Европейское управление по безопасности пищевых продуктов (EFSA) рекомендует анализ кометы in vivo в качестве подходящего последующего теста для исследования актуальности положительного результата в тесте по генококсикности in vitro^3. В 2014 году было утверждено руководство ОЭСР по тестированию кометы грызунов, что увеличило приемлемость анализа для использования в регулятивном тестировании генотоксического потенциала. Анализ основан на электрофоретической разделении расслабленных циклов ДНК и фрагментов, которые мигрируют из нуклеоидов лизированных клеток. В основном, одиночные клетки встроены в агарозу, которая была слоистых на микроскоп слайды. Слайды затем погружаются в буфер лизиса, а затем щелочной (pH ) решение, которое позволяет плотно смоченной ядерной ДНК, чтобы расслабиться и расслабиться. Слайды затем помещаются в электрическое поле, которое стимулирует миграцию отрицательно заряженной ДНК к аноду, создавая изображения, напоминающие кометы; относительное количество ДНК в хвосте кометы по сравнению с головкой кометы прямо пропорционально количеству повреждений ДНК; Содержание ДНК в хвосте, как правило, количественно с помощью цифрового программного обеспечения изображений.

Поскольку анализ кометы обнаруживает фрагментированную ДНК, точная количественная количественная оценка повреждения ДНК, вызванного воздействием, может быть сбита с толку фрагментацией хроматина, связанной с некрозом или апоптозом в результате вызванной лечением цитотоксичности или стресса. Кроме того, повреждение ДНК может произойти в результате механической стрижки или неправильной обработки образцов^4. Важность поддержания собранной ткани охлажденной до слайд-подготовки, чтобы свести к минимуму базовый уровень повреждения ДНК, ранее было продемонстрировано^5,^,^6. Многие лаборатории готовят кометные асссивы слайдов из свежей ткани; однако, это может быть логистически сложной при подготовке слайдов из нескольких типов тканей на животное в исследовании с большим количеством животных. Кроме того, это создает проблему, когда подготовка и анализ слайдов должны происходить в удаленной лаборатории, что требует отгрузки образцов. Например, Национальная программа токсикологии США включает анализ кометы в качестве компонента своей программы тестирования на генетическую токсикологию (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html), а иногда включает анализ в 28 или 90 дней повторных исследований токсичности дозы; это требует сбора тканей лабораторией в течение всей жизни и передачи образцов в другую лабораторию для анализа. Для достижения этой цели, части ткани измельчаются, и / или эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта Царапины и клеточной суспензии флэш-заморожены и хранятся в морозильной камере для последующей отгрузки и хранения в приемной лаборатории до анализа⁷. Правильная обработка образцов имеет решающее значение для получения высококачественных данных с использованием замороженных тканей; однако, воспроизводимые манипуляции образцов тканей во время некропсии, выполняемые постоянно меняющимся персоналом, трудно контролировать, особенно в лабораториях в жизни, которые обычно не собирают ткани для анализа кометы. Освежающее обучение персонала по некропсии или использование мобильного подразделения, укомплектованного опытным лабораторным персоналом для сбора образцов свежих или замороженных тканей, зачастую является слишком дорогостоящим, неосуществимым или просто недооцененным.

Для лучшего обеспечения последовательного генерации высококачественных образцов тканей для переноса в удаленный участок для анализа анализа кометы была изучена полезность опубликованного метода⁶ сохранения тканей из флэш-замороженных кубов ткани. В этом методе замороженные кубики ткани загружаются в устройство для измельчения тканей из нержавеющей стали(рисунок 1), которое помещается в микроцентрифугную трубку, содержащую холодный буфер. Куб ткани затем проталкивается через небольшую калибровочная сетка в конце устройства. Неоднократное принуждение ткани суспензии через сеточное сито в обоих направлениях несколько раз приводит к относительно равномерной одноклеточной суспензии. Образцы, подготовленные этим методом, по качеству сравнивали как со свежими, так и с замороженными образцами тканей, подготовленными путем измельчения. В качестве дополнительного преимущества, в отличие от фарша, кубики тканей могут храниться замороженными в течение длительных периодов времени и по-прежнему дают высокие результаты качества в анализе кометы.

протокол

Ткани были собраны в ходе проведения исследований, проведенных на аккредитованных AAALAC объектах в контрактных лабораториях NTP в соответствии с правилами хорошей лабораторной практики (21 CFR Part 58) и протоколами использования животных, утвержденными Институциональным Животным Комитет по уходу и использованию (IACUC) в каждой лаборатории.

1. Урожай и обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно подготовить дубликаты пробных трубок (например, печень) или перенести примерно половину образца в другую трубку для хранения (например, двенадцатиперстной кишки, желудок), чтобы при необходимости провести повторанализа. Чтобы свести к минимуму потенциальную изменчивость образца к образцу для тканей желудочно-кишечного тракта, рекомендуется, чтобы провести пробы той же области ткани по отношению к желудку для каждого животного, и образец будет разделен для создания дублирующих образцов. Пластиковые щипцвы рекомендуется для передачи липких тканей, таких как мозг. В качестве опции, фарш, Царапины или гомогенизированные ткани препараты могут быть отфильтрованы для достижения однородных одноклеточных суспензий с помощью 40 мкм ячейки ситечко прилагается к конической трубки.

Удалите любые прикрепленные соединительные ткани, органы и мусор из органа (ы) интерес. Сразу же после удаления, свист органа энергично в средних вес лодки, содержащей 7 мл холодного свежеприготовленного раствора измельчения (Mg^,Ca^и фенол красно-свободного Хэнка сбалансированное решение соли, 10% V / V DMSO, и 20 мМ EDTA pH 7.5) для удаления остаточной крови и мусора.
Перенесите каждый орган на другую чистую лодку, содержащую достаточное (7 мл) раствор холодного рубки для поддержания ткани погруженной на лед, до дальнейшей обработки.
Удалите часть каждого интересующего органа и поместите его в встраивающую кассету. Исправить в 10% нейтральных буферизированных формалин, отделка, и парафин встраивается в соответствии со стандартными процедурами лаборатории для возможной будущей оценки гистопатологии.
Для печени, вырезать 5 мм продольного раздела левой доли и осторожно свист в 7 мл холодного раствора измельчения. Поместите полосу ткани в чистую лодку среднего размера, содержащую 7 мл холодного раствора для рубки, и поддерживайте на льду до готовности к дальнейшей обработке (шаг 1.8 или 1.11).
Для двенадцатиперстной кишки, вырезать 10 мм часть двенадцатиперстной кишки в живот. Использование 21-25 G иглы, флеш для удаления мусора и бактерий.
1. Вставьте иглу в один конец двенадцатиперстной кишки и завить 1 мл холодного раствора для измельчения.
2. Промыть другое направление, перевернув двенадцатиперстную кишу и повторяя еще 1 мл раствора для измельчения. Отбросьте иглу.
3. Нарежьте двенадцатиперстную кистаю открыть и промыть его в 7 мл раствора измельчения, прежде чем положить его в средний вес лодки, содержащей 7 мл чистого раствора измельчения; поддерживать на льду до готовности к дальнейшей обработке (шаг 1.8 или 1.11).
Для мозга, это может быть полезно сначала разделить мозг на два полушария; одно полушарие может быть сохранено для возможной гистопатологии (см. шаг 1.2).
1. Вскрыть область мозга (ы) интерес и осторожно свист в 7 мл холодного раствора измельчения.
2. Передача ткани (ы) на чистую лодку среднего размера, содержащую 7 мл раствора холодного рубки, и поддерживать на льду до тех пор, пока не будет готова к дальнейшей обработке (шаг 1.8 или 1.11; обратите внимание, что небольшие регионы, такие как мозжечок и гиппокамп, могут не требовать дальнейшей обрезки).
Для желудка
1. Удалите и отбросьте предыки. Отрежьте железистую животик и вымойте без пищи, используя 7 мл холодного буфера для рубки в среднеразмерной лодке.
2. Удалите 5 мм полоску железистой желудочно-посадочной полосы проксимальной к двенадцатиперстной кишки для фиксации для возможной оценки гистопатологии (см. шаг 1.2).
3. Поместите оставшийся желудок в буфер холодного рубки в среднеразмерную лодку и инкубировать на льду в течение 15-30 минут.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инкубационный шаг может и не потребоваться; этот шаг был включен в протокол проверки JaCVAM, но не упоминается в руководстве ОЭСР по тестированию^8,^,⁹.
4. Перенесите желудок в чистый кусок парафина (или чашку Петри или взвесить лодку) и аккуратно соскребите эпителия поверхности два или более раз с помощью скальпеля лезвия или скребка по политетрафторотена (PTFE) для удаления мусора. Возьмите слизистую оболочку желудка с щипками и промыть 1 мл холодного буфера рубки с помощью пифета. Перенесите ткани желудка на чистую поверхность или блюдо.
5. Тщательно соскребите эпителия желудка 4-5 раз (больше, при необходимости) в растворе измельчения (обычно 250 л/мышь или 500-1000 л/крыса) с задней части скальпеля лезвия или PTFE скребок, чтобы освободить клетки. Дополнительно промыть ткань примерно равным объемом раствора для восстановления большего количества клеток. Соберите раствор для измельчения, содержащий высвобожденые клетки с помощью трубки и перенесите в микроцентрифугую трубку на льду.
Для измельчения образцов тканей вырежьте 3-4 мм секции печени или ткани головного мозга или 5 мм двенадцатиперстной кишки и перенесите на помеченную 1,5 или 2,0 мл микроцентрифуговой трубки, содержащей 1 мл холодного раствора для рубки. Быстро фарш (30 с) с ножницами до тонкого рассечения, сохраняя при этом образец холодным. Образец должен выглядеть слегка облачно; однако, оно общее для некоторых частей, котор нужно остать, то которое уляжется к дну пробки.
Для использования ткани свежей, поддерживать трубки, содержащие фарш ткани или Царапины эпителиальных клеток на льду; использовать ткани для подготовки кометных слайдов в пределах примерно 1 ч урожая (изложены в разделе 2).
Для замораживания образцов тканей, сразу же после измельчения или сбора Царапины эпителиальных клеток
1. Закрепите крышку трубки и опустите трубку в колбу Dewar, содержащую жидкий азот; трубки могут поддерживаться в жидком азоте в течение всего периода некропсии (3 ч).
2. Извлекать трубки с помощью ковша и место на сухой лед для сортировки. Перенесите трубки в морозильную камеру на сухой лед и храните коробку в морозильной камере -80 градусов.
Для приготовления замороженных кубиков ткани, вырезать несколько небольших кусочков ткани (4 мм в диаметре и 6 мм в длину; Рисунок 1).
1. Индивидуально сбросьте их непосредственно в лодку среднего размера или другой подходящий сосуд, содержащий жидкий азот.
2. Подождите несколько секунд, пока кусочки полностью замерзнут и переведут отдельные замороженные кубики ткани в маркированную микроцентрифугную трубку или криотубеб, поддерживаемый на сухом льду; не допускайте, чтобы кусочки слипались во время процесса замораживания.
3. Перенесите трубки в морозильную камеру на сухой лед и храните коробку в морозильной камере -80 градусов.

2. Подготовка слайдов

Для рубленой/царапинной ткани
1. Поддерживайте трубки, содержащие свежие ткани на мокром льду.
2. Поместите трубки из замороженной ткани в водяную ванну комнатной температуры до тех пор, пока образцы полностью не разморозятся, обеспечивая при этом, что они остаются холодными. Немедленно перенесите трубки на лед.
3. Непосредственно перед снятием клеток для переноса в агарозу (шаг 2.3) аккуратно перемешайте каждую клеточную суспензию; для нефильтрованных образцов, позволяют большие куски, чтобы осесть на дно трубки. Поддерживайте все трубы на льду до тех пор, пока не будут подготовлены горки для всех образцов.
Для кубисто-излёк
1. Извлекайте трубки, содержащие кубики ткани из морозильной камеры 80 градусов по Цельсию и поддерживайте сухой лед до подготовки слайда.
2. Aliquot 1 мл среднего торгового (0,14 M NaCl, 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,7 мм KCl, 8,1 мм Na₂HPO₄, 10 мм NaEDTA, pH 7.4) или фарш раствор в помечены 1,7 мл микроцентрифуги трубки для каждого образца и поддерживать на льду.
3. Работая быстро, чтобы избежать таяния тканей, поместите куб ткани в открытый конец комнатной температуры ткани рубки устройства(рисунок 1). Несколько частей ткани могут быть использованы; при необходимости, замороженные ткани могут быть разрезаны или трещины на более мелкие кусочки с помощью холодного раствора и пестика, чтобы уменьшить размер куба, чтобы вписаться в устройство.
4. Быстро вставьте размер подобранных шприц поршень в устройство, чтобы подтолкнуть ткани к концу сетки, которые затем должны быть помещены в микроцентрифуг трубку, содержащую холодный раствор измельчения; не заставляя жидкость переполнения трубки. Погрузите конец сетки устройства примерно на 5-10 с в холодный раствор для измельчения, чтобы ткань полностью оттаивалась.
5. Полностью угнетает поршень до тех пор, пока клетки не будут видны экструдируя через поры сетки. Затем потяните поршень примерно на 2,5 см и нажмите вниз снова полностью; повторить процесс несколько раз, пока раствор измельчения становится мутным.
6. При необходимости образец может быть сконцентрирован для увеличения плотности клеток путем охлаждения центрифугирования в течение 5 мин при 1100 об/мин и удаления части супернатанта.
7. Повторите процесс для всех образцов с помощью чистого устройства для сжигания тканей для каждого образца.
Передача 50 зликат клеточной суспензии в трубку, содержащую 450 л 0,5% низкой точки плавления агарозы при температуре 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы могут быть скорректированы, но сумма агарозы должна быть 1%.
Подготовка и оценка слайдов, как описано ранее¹⁰^,¹¹.

Результаты

Исследование 1
Печень была собрана из двух когорт ясам Sprague Dawley крыс вводили кукурузное масло в течение 4 дней, пошатнулся на одну неделю. Слайды были подготовлены из свежеизмельченной ткани, замороженных фаршовых тканей и замороженных кубиковых тканей, обработанных в средне?...

Обсуждение

Как было продемонстрировано ранее⁷^,¹²^,¹³, правильно обрабатываются флэш замороженных фарш ткани обеспечивает хорошие результаты в анализе кометы. В самом деле, базовые % хвост днк значения для замороженных фарш крысиной и мышиной печени,...

Раскрытие информации

Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований NIH, Национальным институтом экологических наук (NIEHS) по контракту HHSN273201300009C; однако содержащиеся в них заявления, мнения или выводы не обязательно отражают заявления, мнения или выводы NIEHS, NIH или правительства Соединенных Штатов.

Благодарности

Авторы в долгу перед Линкольном Мартином и Келли Оуэнсом за экспертную техническую помощь в подготовке и скоринге кометных слайдов и доктору Кэрол Шварц за выполнение статистического анализа. Авторы также признают поддержку вклада членов генетической токсикологии, исследования токсикологии и некропсии программ в ILS.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL)	Corning	3207
Na₂EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na₂HPO₄	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL)	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B