Radiosensibilidad de las células madre del cáncer en las líneas celulares de cáncer de pulmón

Resumen

La presencia de células madre cancerosas se ha asociado con recaídas o malos resultados después de la radioterapia. Este manuscrito describe los métodos para estudiar la radiosensibilidad de las células madre cancerosas en las líneas celulares de cáncer de pulmón.

Resumen

La presencia de células madre cancerosas (CSC) se ha asociado con recaídas o malos resultados después de la radioterapia. El estudio de las CCS radiorresistentes puede proporcionar pistas para superar la radiorresistencia. Se ha notificado la isoforma 5 del canal de calcio cerrado por voltaje n.o 21 como un marcador para los CCS radiorresistentes en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Utilizando la subunidad del canal de calcio 2-1 como ejemplo de un marcador CSC, se presentan métodos para estudiar la radicalidad de los CSC en las líneas celulares NSCLC. Las CSC se clasifican con marcadores putativos por citometría de flujo, y la capacidad de auto-renovación de las células ordenadas se evalúa mediante el ensayo de formación de esferas. El ensayo de formación de colonias, que determina cuántas células pierden la capacidad de generar descendientes que forman la colonia después de una cierta dosis de radiación, se realiza para evaluar la radiación de las células ordenadas. Este manuscrito proporciona los primeros pasos para estudiar la radiosensibilidad de las SC, que establece la base para una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes.

Introducción

La radioterapia desempeña un papel importante en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la existencia de células madre de cáncer radioresistentes (CCS) puede provocar recaídas o malos resultados después de la radioterapia^1,2. Las CSC se caracterizan por su capacidad de auto-renovación y capacidad para generar células cancerosas heterogéneas³. Blindados con una capacidad de reparación de daños por ADN más eficiente o niveles más altos de sistemas de barrido de radicales libres u otros mecanismos, los CSC son relativamente resistentes a la radioterapia^{4,5,6,7 , 8}. Identificar los marcadores CSC y explorar sus mecanismos facilitará el desarrollo de fármacos que superarán la radiorresistencia sin aumentar el daño tisular normal.

Se ha notificado la isoforma 5 del canal de calcio cerrado por tensión n.o 21 como un marcador para los CCS radiorresistentes en las líneas celulares DeNC⁹. El número 2 1 fue identificado originalmente como un marcador CSC para el carcinoma hepatocelular (HCC)¹⁰. Utilizando la inmunización sustractiva con un par de líneas celulares hcc derivadas de los tumores primarios y recurrentes en el mismo paciente, se identificó un anticuerpo llamado 1B50-1 para apuntar específicamente a las células recurrentes del HCC. Las células 1B50-1-positivas mostraron una alta eficiencia de formación de esferas in vitro y alta tumorigeniidad in vivo. Su antígeno fue identificado por espectrometría de masas, como el canal de calcio 2-1 subunidad isoform 5. El n.o 21 expresa específicamente en los CoS y es indetectable en la mayoría de los tejidos normales, lo que lo convierte en un candidato potencial para apuntar a los CSC^10. El número 21 también puede servir como un marcador CSC para las líneas celulares NSCLC, y se ha demostrado que imparteradiorresistencia a las células NSCLC parcialmente mejorando la eficiencia de la reparación de daños al ADN en respuesta a la radiación 9.

El estudio de las CCS radiorresistentes puede proporcionar pistas para superar la radiorresistencia. Utilizando el n.o 2-1 en el NSCLC como ejemplo, se presentan los métodos principales para estudiar la radiosensibilidad de los SCP. Por lo general, los CCS se aíslan con un marcador de superficie putativa, y se comparan las características de las células madre y la radiosensibilidad de las poblaciones de células positivas y negativas. La formación de esferas en un medio libre de suero complementado con factores de crecimiento que apoyan la autorrenovación es un ensayo útil para evaluar la talla de las células in vitro. Es probable que las células con alta capacidad de formación de esferas muestren una alta tumorigeniidad cuando se inyectan en ratones inmunodeficientes^10,11,12. El ensayo de formación de colonias se utiliza entonces para evaluar la radiación de las células, que determina cuántos han perdido la capacidad de generar descendientes que forman la colonia después de una dosis de radiación¹³.

Protocolo

NOTA: Los pasos se realizan bajo la temperatura indicada. Para los pasos en los que no se menciona la temperatura, realice bajo temperatura ambiente (18-25 oC). El medio de cultivo celular debe almacenarse a 4 oC, y otros reactivos deben almacenarse de acuerdo con las guías del fabricante. El medio se debe precalentar a 37 oC antes de añadirse a las células.

1. Clasificación de celdas

1. Conjugación de anticuerpos
   NOTA: Teniendo en cuenta el menor tiempo de incubación, se prefiere el anticuerpo con etiqueta directa para la clasificación celular. Si no se dispone de anticuerpos comerciales con etiqueta directa, utilice reactivos conjugados de fluoresceína para conjugar el anticuerpo con un colorante fluorescente de acuerdo con la guía del fabricante (ver Tabla de materiales). Como las células se cultivarán después de la clasificación, todos los pasos deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica o banco limpio laminar. Para evitar la contaminación, se recomienda añadir antibióticos (penicilina y estreptomicina) al medio de cultivo después de la clasificación.
   1. Añadir 1 l de reactivo modificador por cada 10 ml de anticuerpo que se va a etiquetar. Mezclar suavemente.
   2. Añadir la mezcla de anticuerpos y modificador directamente sobre la fluoresceína liofilizada. Pipet suavemente. Deje el vial de pie durante 3 h o durante la noche a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad.
   3. Añadir 1 l de reactivo quencher por cada 10 oL de anticuerpo. El conjugado se puede utilizar después de 30 min. El conjugado de fluoresceína se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 18 meses.
   4. Antes de la clasificación, se recomienda la valoración de los anticuerpos conjugados. Prepare las células que expresan (p. ej., H1299 o A549 para el n.o 2o 1) y no expresan (p. ej., H1975) el marcador. Alíspe las células e incubarlas con anticuerpos a diferentes concentraciones (p. ej., 15 g/ml, 7,5 g/ml, 1,5 g/ml y 0,75 g/ml, respectivamente).
   5. Realice el análisis citométrico de flujo (con histograma o gráfica de puntos) y elija la concentración en la que las celdas positivas de H1299 o A549 se pueden separar del control de isotipo y las células H1975 tienen pocas señales inespecíficas.
2. Etiquetado celular
   1. Células de cultivo A549 en rpm 1640 mediana suplementadas con 10% suero bovino fetal (FBS) en platos de 10 cm a 37 oC y 5% CO₂ en una incubadora de cultivo celular. Digerir las células de la siguiente manera para la clasificación cuando alcanzan entre el 80% y el 90% de la confluencia (alrededor de 5-10 x 10⁶ células por plato).
   2. Retire el medio de referencia cultural. Lave brevemente las células con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 ml de 0,05% de trippsina a cada plato. Retire la trippsina y deje que la trippsina residuaria digiere las células a 37 oC durante 1-3 min. Compruebe el desprendimiento de las células con frecuencia para evitar la sobredigestión.
      NOTA: Algunas líneas de celda pueden ser relativamente difíciles de digerir, como las líneas de celda NSCLC H520 y PC9. En tal situación, 3 ml de tripsina se pueden dejar en el plato, en lugar de la digestión con la trippsina residuaria. Además, el tiempo de digestión se puede extender.
   3. Cuando las células se aflojen y comiencen a desprenderse de los platos, agregue 3 ml de medio RPMI 1640 complementado con 10% FBS y pipetee la suspensión celular en un tubo de 50 ml.
   4. Centrífuga a 300 x g a 4oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Agregue 10 mL de PBS para resuspender las celdas. Transfiera 0,5 ml (o al menos 5 x 10⁵ células) de suspensión celular a un tubo nuevo como control de isotipo. Las celdas restantes son para ordenar.
   5. Centrifugar tanto los tubos de control como los experimentales a 300 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
   6. Preparar la solución de trabajo para la tinción diluyendo el control de isotipo conjugado con tinte fluorescente o anticuerpo en PBS a la concentración óptima valorada como se mencionó anteriormente.
      NOTA: En este experimento, el 1B50-1 conjugado por FITC (el anticuerpo de 2x1) se diluyó en 7,5 g/ml. El volumen de la solución de trabajo depende de la cantidad de celda.
   7. Resuspenda las células de control y experimentales con cada solución de trabajo a aproximadamente 2-5 x 10⁷ células/ml y mezcle suavemente. Incubar las muestras en RT durante 30-40 minutos en la oscuridad.
   8. Lavar las células añadiendo 10 ml de PBS a las muestras, mezclar suavemente y centrifugar a 300 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células con 10 ml de PBS.
   9. Poner tensores de células de 40 m en nuevos tubos de 50 ml para el control y las células experimentales respectivamente. Aplique la suspensión celular en el colador y recoja el flujo.
      NOTA: Este paso elimina los grumos celulares que pueden bloquear el capilar del clasificador de células.
   10. Centrifugar el flujo a través de 300 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda las celdas con PBS de 0,2–1,0 ml y luego transfiera a un tubo de 5 ml para la citometría de flujo.
3. Clasificación celular por citometría de flujo
   1. Preparar dos tubos de 5 ml para recoger las poblaciones celulares positivas y negativas. Añadir 1 ml de medio RPMI 1640 en cada tubo. Coloque los tubos en la plataforma de recolección del clasificador de células.
   2. Analice las celdas de control y las celdas experimentales respectivamente con la gráfica de puntos. Atraviese las celdas vivas con los parámetros de dispersión hacia adelante (FSC) y dispersión lateral (SSC). Atraviese la población positiva y negativa de las células vivas de acuerdo con la intensidad FL-1.
   3. Recoger las células positivas de 2 1 y las células negativas de 2. Registre el número de celdas obtenidas.
   4. Para confirmar que las poblaciones de células cosechadas tienen un nivel diferente de expresión de 2o1, se puede realizar una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR).
      1. Extraer ARN de células positivas y negativas con reactivo de tiocianato de guanidinio y transcripción inversa del ARN en ADNc nm según la guía del fabricante. Realice QPCR con el reactivo verde SYBR. Las secuencias de imprimaciones son las siguientes: 2-F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; 2-1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; y GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.

2. Ensayo de formación de esferas

NOTA: El ensayo de formación de esferas se aplica para determinar la capacidad de autorenovación de las células. Las células con capacidad de autorenovación podrían formar esferas en este medio semisólido libre de suero complementado con factores de crecimiento. Todos los pasos deben realizarse en un armario de seguridad biológica o en un banco limpio laminar. Para evitar la contaminación, se recomienda añadir antibióticos (penicilina y estreptomicina) al medio de cultivo después de la clasificación.

1. Preparación media
   1. Preparar 2x DMEM/F-12 medio mediante la reconstitución de un paquete de 1 L de polvo DMEM/F-12 en 475 ml de agua destilada. Añadir 2.438 g de NaHCO₃. Ajuste el pH a 7.0–7.2 agregando lentamente 1 N NaOH o 1 N HCl con agitación. Añadir agua destilada a un volumen final de 500 ml. Esterilice el medio filtrando a través de un filtro de 0,2 m.
   2. Preparar una solución de metilcelulosa al 2% añadiendo 2 g de metilcelulosa en 100 ml de agua destilada. Autoclave la solución. La metilcelulosa puede mostrar un estado similar al algodón después de la autoclave. Mezcle hacia arriba y hacia abajo suavemente por algunas veces y déjela para un enfriamiento natural. Se convertirá en un semisólido transparente de la noche a la mañana.
   3. Para obtener 20 ml de medio de auto-renovación, añadir 10 mL de 2x DMEM/F-12 medio a un tubo de 50 ml. Añadir 400 sl de B27 al medio. Añadir factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) a una concentración final de 25 ng/ml. Añadir el factor de crecimiento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF) a una concentración final de 25 ng/ml. Añadir 2% de metilcelulosa para alcanzar un volumen final de 20 ml.
   4. Mezclar el medio por vórtice para obtener el medio de auto-renovación.
2. Sembrado celular
   1. Transfiera las células cosechadas al medio de auto-renovación para alcanzar 2000 células/ml y mezclarlas con un breve vórtice. Añadir 100 l de suspensión celular a cada pocal de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja. No utilice los pozos en el borde de la placa, ya que el medio es más propenso a evaporarse en estos pozos. Agregue agua esterilizada a estos pozos.
   2. Cultivo a 37oC con 5% de CO2 en incubadora de cultivo celular durante 10-14 días. Añadir 50 l de medio de auto-renovación en el día 5–7.
3. Conteo y cálculo de esferas
   1. 10–14 días después de la sembración, cuente el número de esferas con más de 50 células (aproximadamente) o con un diámetro superior a 100 m bajo un microscopio (lente objetivo 4x, ocular 10x).
      NOTA: A partir de la parte superior izquierda del pozo, cuente las esferas mientras mueve la tabla objetiva horizontalmente hacia la derecha con el joystick del microscopio. A continuación, mueva la tabla de objetivos a la fila central del campo visual y cuente las esferas de derecha a izquierda. A continuación, vaya a la fila inferior y cuente de izquierda a derecha. Un pozo de 96 pozos placa se puede contar dentro de tres filas.
   2. Calcule la eficiencia de la formación de esferas como el número de esferas dividido por el número de celdas sembradas. Compare la eficiencia de la formación de esferas entre las poblaciones de células positivas y negativas.

3. Ensayo de formación de colonias

NOTA: El ensayo de formación de colonias se aplica para determinar la radiasensibilidad de las células. La radiación puede ser suministrada por un acelerador lineal utilizado para la radioterapia. El sistema de irradiación celular para uso en laboratorio también se puede utilizar si el equipo está disponible. Los pasos 3.1, 3.2.3 y 3.2.6 deben realizarse en un armario de seguridad biológica o en un banco limpio laminar. Para evitar la contaminación, se recomienda añadir antibióticos (penicilina y estreptomicina) al medio de cultivo después de la clasificación.

1. Sembrado celular
   1. Prepare una placa de 6 pocillos para cada dosis de radiación, incluido el grupo 0 Gy. Añadir 1,5 ml de medio a cada pozo de 6 pocillos. El medio de cultivo para el ensayo de formación de colonias es el medio RPMI 1640 convencional complementado con 10% FBS (llamado como "completado 1640").
   2. Células cosechadas diluidas con 1640 medias a 1000 células/ml completas.
   3. Agregue la suspensión celular a los pozos. Agitar las placas horizontalmente para hacer que las células se distribuyan uniformemente en los pozos. Registre el volumen añadido en cada grupo de dosis.
      NOTA: Generalmente, semilla 200 células por pozo para 0 Gy, 200 células para 2 Gy, 400 células para 4 Gy, 800 células para 6 Gy, y 1600 células para 8 Gy, respectivamente. Es mejor ajustar los números de celda en celdas no ordenadas en preexperimentos.
   4. Cultivo a 37oC con 5% de CO2 en incubadora de cultivos celulares.
2. Radiación
   1. Después de que las células se han unido a la parte inferior de los pozos (generalmente un día después de la sembración, y no se recomienda más tiempo teniendo en cuenta la proliferación celular), proceder a realizar la radiación celular.
   2. Calcular el número de unidades de monitor (MU) para cada dosis a una profundidad de 1 cm en un campo de radiación de 20 cm x 20 cm.
      NOTA: Número de MU - dosis (cGy)/factor de salida para la dosis de campo de radiación/profundidad porcentual (PDD) para la profundidad. Por ejemplo, el factor de salida para un campo de 20 cm x 20 cm es 1.066, PDD para 1.0 cm es 0.987, y el número de MU para 8 Gy (800 cGy) es 760 (800/1.066/0.987 a 760.35). Si es necesario irradiar varias placas para cada dosis, también se puede utilizar un campo más grande y los números de MU deben volver a calcularse según el tamaño del campo. El factor de salida y el PDD difieren en diferentes aceleradores. Consulte a los físicos de radiación para conocer estos parámetros.
   3. Añadir 1640 completado a cada pozo para alcanzar 1 cm para la altura del medio.
      NOTA: El área de crecimiento celular de la placa de 6 pozos se puede encontrar en la guía del fabricante. Por ejemplo, si el área de crecimiento es de 9,5 cm² para cada pozo de 6 pocillos, y se ha añadido 1,5 ml de suspensión media y 0,4 ml de suspensión celular el día anterior, añada 7,6 ml de medio al pozo. La altura es necesaria para la acumulación de dosis. No se recomienda una altura media inferior a 0,8 cm.
      NOTA: Mantenga las placas cubiertas durante la radiación. Cuando las placas se transfieran entre la sala de cultivo celular y la sala de radioterapia, envuelva las placas con papel de aluminio o colóquelas en una caja limpia para evitar la contaminación. Sostenga las placas planas para evitar que se derrame un medio.
   4. Establezca un campo de radiación de 20 cm x 20 cm. Coloque un bolo equivalente a un tejido de 1,0 cm de espesor en el sofá de tratamiento y coloque la placa de 6 pocillos en el bolo para mantenerlos en contacto. Asegúrese de que toda la placa esté dentro del campo de radiación. Establezca la distancia de la piel de origen como 100 cm. Alinee el nivel de superficie medio con el nivel del láser ajustando la altura del sofá de tratamiento.
      NOTA: Las placas con la misma dosis de radiación se pueden irradiar al mismo tiempo. Para este caso, se necesita un campo de radiación más grande, y el número de MU debe ser recalculado de acuerdo con el factor de salida correspondiente. Asegúrese de que todas las placas estén dentro del campo de radiación.
   5. Entregue cada dosis asignada a cada placa en secuencia.
      ADVERTENCIA: El acelerador lineal sólo puede ser operado por técnicos cualificados. Manténgase alejado de la radiación.
   6. Lleve los platos de vuelta a la sala de cultivo celular. Cambiar el medio con 2 ml de medio completado para cada pocto. Cultivo a 37oC con 5% de CO2 en incubadora de cultivos celulares. Cambie el medio cada 3-5 días.
3. Tinción
   1. 7-10 días después de la radiación, cuando se forman muchas colonias y antes de que crezcan demasiado grandes y se fusionen, luego realice la tinción y el conteo de la siguiente manera. Retire el medio y lávelo brevemente con PBS. Agregue 1 ml de 4% de formaldehído a cada pocto para fijar las células.
      ADVERTENCIA: El formaldehído es volátil. Use formaldehído en una campana de humo.
   2. Después de 10 minutos de fijación, retire el formaldehído y lave con 2 ml de agua destilada cada poca.
   3. Añadir 1 mL de 1% de solución de manchas violetas de cristal a cada poca. Mancha durante 10 minutos. Retire la solución de manchas violetas cristalinas y lave con agua destilada 3 veces. Retire el agua y seque las placas.
4. Conteo y cálculo de colonias
   1. Cuente el número de colonias con más de 50 células. No incluya colonias pequeñas con menos de 50 células. Revise las colonias bajo un microscopio para obtener una impresión de una colonia constituida por 50 células y márquela en la parte inferior de la placa con un rotulador.
      NOTA: Fotografiar los pozos y utilizar el software ImageJ facilitará el proceso de conteo.
   2. Calcular la eficiencia de la formación de colonias como el número de colonias divididas por el número de células sembradas. Calcular la fracción de supervivencia como la eficiencia de formación de la colonia a una cierta dosis de irradiación dividida por la eficiencia de formación de la colonia en 0 Gy.
   3. Utilizando la dosis como el eje X y la fracción de supervivencia como el eje Y, se puede obtener una curva de supervivencia. Compare las curvas de supervivencia entre las poblaciones de células positivas y negativas.

Resultados

Se clasificaron las células A549 de 2-1-alto y 2-bajo A549 (Figura1A). Algunos marcadores pueden mostrar poblaciones distintas y son fáciles de gatear. Sin embargo, algunos marcadores solo muestran patrones de expresión altos y bajos, en lugar de poblaciones positivas y negativas distintas. En esta situación, un control de isotipo es muy importante para el gating. La expresión de 2x1 en las celdas ordenadas es validada por qPCR. La expresión de CACNA2D1, el gen que codifica el...

Discusión

Este protocolo describe métodos para estudiar la radiosensibilidad de los CI en las líneas celulares cancerosas in vitro. En este estudio, la expresión de 2s 1 es continua en las líneas celulares DeNc. Por lo tanto, el gating se basa en un control de isotipo. Antes de ordenar, la expresión de 2o 1 debe examinarse en varias líneas de celda mediante citometría de flujo y validarse mediante QPCR o western blot. Se recomienda volver a analizar la expresión de 2o1 de las células ordenadas de 2a 1 y 2-baja por citomet...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red	Thermo Fisher	15400054	Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water
1B50-1			This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)
4% formaldehyde solution	Solarbio	G2160
A549	ATCC		RRID: CVCL_0023
B27	Thermo Fisher	17504044
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher	1336
Centrifuge	Eppendorf	5910R
DMEM/F-12	Thermo Fisher	12500062
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16140071
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher	PHG0261
Flow cytometer/cell sorter	BD	FACSARIA III
H1299	ATCC		RRID: CVCL_0060
H1975	ATCC		RRID: CVCL_1511
Lightning-Link Fluorescein Kit	Innova Biosciences	310-0010
linear accelerator	VARIAN	CLINAC 600C/D
Methyl cellulose	Sigma Aldrich	M7027
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Thermo Fisher	15140122
Phosphate buffered saline	Solarbio	P1020
RPMI-1640	Thermo Fisher	11875093
SYBRGREEN	TOYOBO	QPK-201
TRIzol	Thermo Fisher	15596026
Violet crystal staining solution	Solarbio	G1062