Radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires du cancer du poumon

Résumé

La présence de cellules souches cancéreuses a été associée à une rechute ou à de mauvais résultats après la radiothérapie. Ce manuscrit décrit les méthodes d'étude de la radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires cancéreuses du poumon.

Résumé

La présence de cellules souches cancéreuses (CSC) a été associée à une rechute ou à de mauvais résultats après la radiothérapie. L'étude des CCS radiorésistants peut fournir des indices pour surmonter la radiorésistance. Le canal de calcium à porte de tension no 2 1 isoforme sous-unité 5 a été rapporté comme marqueur pour les CSC radiorésistants dans les lignées cellulaires non à petites cellules du cancer du poumon (NSCLC). À l'aide du canal calcique no 2, comme exemple de marqueur CSC, des méthodes d'étude de la radiosensibilité des CSC dans les lignées cellulaires du NSCLC sont présentées. Les CCS sont triés avec des marqueurs putatifs par cytométrie de flux, et la capacité d'auto-renouvellement des cellules triées est évaluée par essai de formation de sphère. L'analyse de formation des colonies, qui détermine combien de cellules perdent la capacité de générer des descendants formant la colonie après une certaine dose de rayonnement, est ensuite effectuée pour évaluer la radiosensibilité des cellules triées. Ce manuscrit fournit des étapes initiales pour l'étude de la radiosensibilité des CCS, qui établit la base pour une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents.

Introduction

La radiothérapie joue un rôle important dans le traitement du cancer. Cependant, l'existence de cellules souches cancéreuses radiorésistantes (CSC) peut entraîner une rechute ou de mauvais résultats après la radiothérapie^1,2. Les CCS se caractérisent par leur capacité d'auto-renouvellement et leur capacité à générer des cellules cancéreuses hétérogènes³. Armés d'une capacité de réparation des dommages à l'ADN plus efficace ou de niveaux plus élevés de systèmes de récupération de radicaux libres ou d'autres mécanismes, les CCS sont relativement résistants à la radiothérapie^4,5,6^{,7 , 8}. L'identification des marqueurs du SCC et l'exploration de leurs mécanismes faciliteront le développement de médicaments qui surmonteront la radiorésistance sans augmenter les lésions tissulaires normales.

Le canal de calcium à la tension no 2 1 estoforme sous-unité 5 a été signalé comme marqueur pour les CSC radiorésistants dans les lignées cellulaires NSCLC⁹. À l'origine, le carcinome hépatocellulaire (HCC)^aété identifié comme marqueur du SCC 10 . Utilisant l'immunisation soustractive avec une paire de lignées cellulaires de HCC dérivées des tumeurs primaires et récurrentes dans le même patient, un anticorps appelé 1B50-1 a été identifié pour cibler les cellules récurrentes de HCC spécifiquement. Les cellules 1B50-1-positives ont montré l'efficacité élevée de formation de sphère in vitro et la tumorigenicity élevée in vivo. Son antigène a été identifié par spectrométrie de masse, comme canal de calcium '2 '1 sous-unité isoforme 5. Les CSC sont expressément exprimés dans les CCS et sont indétectables dans la plupart des tissus normaux, ce qui en fait un candidat potentiel pour cibler les CCS¹⁰. Il est également démontré qu'il peut servir de marqueur CSC pour les lignées cellulaires du NSCLC, et il a été démontré qu'il transmet une radiorésistance aux cellules du NSCLC en partie en améliorant l'efficacité de la réparation des dommages à l'ADN en réponse au rayonnement⁹.

L'étude des CCS radiorésistants peut fournir des indices pour surmonter la radiorésistance. À titre d'exemple, on présente à titre d'exemple les principales méthodes d'étude de la radiosensibilité des CCS. Habituellement, les CCS sont isolés avec un marqueur de surface putatif, et les caractéristiques des cellules souches et la radiosensibilité des populations de cellules positives et négatives sont comparées. La formation de sphère dans un milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance qui soutiennent l'auto-renouvellement est un résultat utile pour évaluer la tige des cellules in vitro. Les cellules avec la capacité élevée de formation de sphère sont susceptibles de montrer la tumorigenicité élevée une fois injectées dans les souris immunodéficientes^10,11,12. L'analyse de formation des colonies est ensuite utilisée pour évaluer la radiosensibilité des cellules, qui détermine combien ont perdu la capacité de générer des descendants formant la colonie après une dose de rayonnement¹³.

Protocole

REMARQUE : Les étapes sont effectuées sous la température indiquée. Pour les étapes où la température n'est pas mentionnée, effectuez-vous sous la température ambiante (18 à 25 oC). Le milieu de culture cellulaire doit être stocké à 4 oC, et les autres réactifs doivent être stockés selon les guides du fabricant. Le milieu doit être réchauffé à 37 oC avant d'être ajouté aux cellules.

1. Tri cellulaire

1. Conjugaison d'anticorps
   REMARQUE : Compte tenu du temps d'incubation plus court, l'anticorps étiqueté direct est préférable pour le tri cellulaire. Si aucun anticorps commercial à étiquette directe n'est disponible, utilisez des réactifs conjugués à la fluorescéine pour conjuguer l'anticorps à un colorant fluorescent selon le guide du fabricant (voir Tableau des matériaux). Comme les cellules seront cultivées après le tri, toutes les étapes doivent être effectuées dans un coffret de sécurité biologique ou un banc propre laminaire. Pour éviter la contamination, il est recommandé d'ajouter des antibiotiques (pénicilline et streptomycine) au milieu de culture après le tri.
   1. Ajouter 1 l de réactif modificateur pour chaque 10 l d'anticorps à étiqueter. Mélanger délicatement.
   2. Ajouter le mélange d'anticorps et modérer directement sur la fluorescéine lyophilisée. Pipet doucement. Laisser le flacon debout pendant 3 h ou toute la nuit à température ambiante (RT) dans l'obscurité.
   3. Ajouter 1 l de réactif quencher pour chaque 10 l d'anticorps. Le conjugué peut être utilisé après 30 min. La conjugaison de fluorescéine peut être stockée à 4 oC pendant une température allant jusqu'à 18 mois.
   4. Avant le tri, la titration des anticorps conjugués est recommandée. Préparer les cellules qui expriment (p. ex., H1299 ou A549 pour 2 '1) et qui n'expriment pas (p. ex., H1975) le marqueur. Aliquot les cellules et les incuber avec des anticorps à différentes concentrations (p. ex., 15 g/mL, 7,5 g/mL, 1,5 g/mL et 0,75 g/mL, respectivement).
   5. Effectuer une analyse cytométrique du débit (avec l'histogramme ou la parcelle de point) et choisir la concentration dans laquelle les cellules positives de H1299 ou A549 peuvent être séparées de la lutte contre l'isotype et les cellules H1975 ont peu de signaux non spécifiques.
2. Étiquetage cellulaire
   1. Culture Cellules A549 dans RPMI 1640 moyen complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans des plats de 10 cm à 37 oC et 5% CO₂ dans un incubateur de culture cellulaire. Digest cellules comme suit pour le tri quand ils atteignent 80%-90% confluence (environ 5-10 x 10⁶ cellules par plat).
   2. Retirez le support de culture. Laver brièvement les cellules avec 3 ml de phosphate salin (PBS). Ajouter 3 ml de trypsine de 0,05 % à chaque plat. Enlever la trypsine et laisser la trypsine résiduary digérer les cellules à 37 oC pendant 1 à 3 min. Vérifier le détachement des cellules fréquemment pour éviter la surdigestion.
      REMARQUE : Certaines lignées cellulaires peuvent être relativement difficiles à digérer, comme les lignées cellulaires NSCLC H520 et PC9. Dans une telle situation, 3 ml de trypsine peuvent être laissés dans le plat, plutôt que la digestion avec la trypsine résiduary. En outre, le temps de digestion peut être prolongé.
   3. Lorsque les cellules se détachent et commencent à se détacher de la vaisselle, ajouter 3 mL de RPMI 1640 moyen complété par 10% FBS et pipette la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml.
   4. Centrifugeuse à 300 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Ajouter 10 ml de PBS pour resuspendre les cellules. Transférer 0,5 ml (ou au moins 5 x 10⁵ cellules) de suspension cellulaire dans un nouveau tube comme contrôle isotype. Les cellules restantes sont pour le tri.
   5. Centrifuger les tubes de commande et les tubes expérimentaux à 300 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant.
   6. Préparer la solution de travail pour la coloration en diluant le contrôle d'isotype fluorescent teint-conjugué ou anticorps dans PBS à la concentration optimale titrée comme mentionné ci-dessus.
      REMARQUE : Dans le cadre de cette expérience, le 1B50-1 (l'anticorps de 2 x1) a été dilué dans 7,5 g/mL. Le volume de la solution de travail dépend de la quantité de cellules.
   7. Resuspendre les cellules de contrôle et expérimentales avec chaque solution de travail à environ 2 x 5 x 10⁷ cellules/mL et mélanger doucement. Incuber les échantillons à RT pendant 30 à 40 min dans l'obscurité.
   8. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de PBS aux échantillons, mélanger délicatement et la centrifugeuse à 300 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Resuspendre les cellules avec 10 ml de PBS.
   9. Placez des passoires à cellules de 40 m sur de nouveaux tubes de 50 ml pour les cellules de contrôle et expérimentales respectivement. Appliquer la suspension cellulaire sur la passoire et recueillir le flux à travers.
      REMARQUE : Cette étape enlève les amas de cellules qui peuvent bloquer le capillaire du trieur cellulaire.
   10. Centrifuger le flux à 300 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Resuspendre les cellules avec 0.2 -1.0 mL DE PBS, puis transférer dans un tube de 5 ml pour la cytométrie de flux.
3. Tri cellulaire par cytométrie de flux
   1. Préparer deux tubes de 5 ml pour recueillir les populations cellulaires positives et négatives. Ajouter 1 ml de RPMI 1640 milieu dans chaque tube. Placez les tubes sur la plate-forme de collecte du trieur cellulaire.
   2. Analyser les cellules témoins et les cellules expérimentales respectivement avec la parcelle de point. Portez les cellules vivantes avec les paramètres de diffusion vers l'avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC). Portez la population positive et négative des cellules vivantes selon l'intensité de FL-1.
   3. Recueillir les cellules positives de 2 '1 et les cellules '2'1-négatif. Enregistrez le nombre de cellules obtenues.
   4. Pour confirmer que les populations de cellules récoltées ont un niveau différent d'expression de 2 euros, une réaction quantitative en chaîne de polymérase (QPCR) peut être effectuée.
      1. Extraire l'ARN des cellules positives et négatives avec le réagent de thiocyanate de guanidinium et la transcription inverse de l'ARN dans l'ADNc selon le guide du fabricant. Effectuer QPCR avec sYBR réactif vert. Les séquences d'amorces sont les suivantes : 2-1 -F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; 2-R, TTGTATGAGCAGTGTGTGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; et GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.

2. L'exemple de formation de sphère

REMARQUE : L'exemple de formation de sphère est appliqué pour déterminer la capacité d'auto-renouvellement des cellules. Les cellules avec la capacité d'auto-renouvellement pourraient former des sphères dans ce milieu semi-solide sérique-libre complété avec des facteurs de croissance. Toutes les étapes doivent être effectuées dans un coffret de sécurité biologique ou un banc laminaire propre. Pour éviter la contamination, il est recommandé d'ajouter des antibiotiques (pénicilline et streptomycine) au milieu de culture après le tri.

1. Préparation moyenne
   1. Préparer 2x DMEM/F-12 moyen en reconstituant un paquet de 1 L de poudre DMEM/F-12 en 475 ml d'eau distillée. Ajouter 2.438 g de NaHCO₃. Ajustez le pH à 7,0 à 7,2 en ajoutant lentement 1 N NaOH ou 1 N HCl en remuant. Ajouter l'eau distillée à un volume final de 500 ml. Stérilisez le support en filtrant à travers un filtre de 0,2 m.
   2. Préparer une solution de méthylcellulose de 2 % en ajoutant 2 g de méthylcellulose dans 100 ml d'eau distillée. Autoclave la solution. La méthylcellulose peut montrer un état de coton après l'autoclacage. Mélangez-le en inversant la bouteille de haut en bas doucement pendant quelques fois et laissez-le pour le refroidissement naturel. Il deviendra un semi-solide transparent du jour au lendemain.
   3. Pour obtenir 20 ml de milieu d'auto-renouvellement, ajouter 10 ml de 2x DMEM/F-12 moyen à un tube de 50 ml. Ajouter 400 oL de B27 au milieu. Ajouter le facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF) à une concentration finale de 25 ng/mL. Ajouter le facteur de croissance de base recombinant de fibroblaste humain (bFGF) à une concentration finale de 25 ng/mL. Ajouter 2% de méthylcellulose pour atteindre un volume final de 20 ml.
   4. Mélanger le milieu par vortex afin d'obtenir le milieu d'auto-renouvellement.
2. Ensemencement cellulaire
   1. Transférer les cellules récoltées dans le milieu d'auto-renouvellement pour atteindre 2000 cellules/mL et les mélanger avec un bref vortex. Ajouter 100 l de suspension cellulaire à chaque puits d'une plaque de puits d'attachement ultra-faible 96. N'utilisez pas les puits au bord de la plaque, car le milieu est plus susceptible de s'évaporer dans ces puits. Ajouter de l'eau stérilisée à ces puits.
   2. Culture à 37 oC avec 5% de CO₂ dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 10 à 14 jours. Ajouter 50 l de milieu d'auto-renouvellement au jour 5 à 7.
3. Comptage et calcul de sphère
   1. 10 à 14 jours après l'ensemencement, comptez le nombre de sphères avec plus de 50 cellules (environ) ou d'un diamètre supérieur à 100 m au microscope (objectif 4x objectif, oculaire 10x).
      REMARQUE : À partir de la partie supérieure gauche du puits, comptez les sphères tout en déplaçant la table objective horizontalement vers la droite avec le joystick du microscope. Ensuite, déplacez la table objective vers la rangée du milieu du champ visuel et comptez les sphères de droite à gauche. Ensuite, déplacez-vous vers la rangée inférieure et comptez de gauche à droite. Un puits de 96 plaques de puits peut être compté dans trois rangées.
   2. Calculer l'efficacité de formation de sphère comme le nombre de sphères divisées par le nombre de cellules enseissées. Comparez l'efficacité de formation de sphère entre les populations cellulaires positives et négatives.

3. L'exemple de formation de colonie

REMARQUE : L'analyse de formation de colonie est appliquée pour déterminer la radiosensibilité des cellules. Les radiations peuvent être transmises par un accélérateur linéaire utilisé pour la radiothérapie. Le système d'irradiation cellulaire à usage de laboratoire peut également être utilisé si l'équipement est disponible. Les étapes 3.1, 3.2.3 et 3.2.6 doivent être exécutées dans un coffret de sécurité biologique ou un banc propre laminaire. Pour éviter la contamination, il est recommandé d'ajouter des antibiotiques (pénicilline et streptomycine) au milieu de culture après le tri.

1. Ensemencement cellulaire
   1. Préparer une plaque de 6 puits pour chaque dose de rayonnement, y compris le groupe 0 Gy. Ajouter 1,5 ml de milieu à chaque puits de 6 assiettes de puits. Le milieu de culture pour l'assay de formation de colonie est le milieu conventionnel de RPMI 1640 complété avec 10% FBS (nommé comme « achevé 1640 »).
   2. Diluer les cellules récoltées avec 1640 cellules moyennes à 1000 cellules/mL.
   3. Ajouter la suspension cellulaire aux puits. Secouez les plaques horizontalement pour que les cellules se répartissent uniformément dans les puits. Enregistrez le volume ajouté dans chaque groupe de dose.
      REMARQUE: Généralement, les graines 200 cellules par puits pour 0 Gy, 200 cellules pour 2 Gy, 400 cellules pour 4 Gy, 800 cellules pour 6 Gy, et 1600 cellules pour 8 Gy, respectivement. Il est préférable d'ajuster le nombre de cellules dans les cellules non triées dans les pré-expériences.
   4. Culture à 37 oC avec 5% de CO₂ dans l'incubateur de culture cellulaire.
2. radiations
   1. Une fois que les cellules se sont fixées au fond des puits (habituellement un jour après l'ensemencement, et qu'il n'est pas recommandé d'allonger la prolifération cellulaire), procédez à l'exécution du rayonnement cellulaire.
   2. Calculer le nombre d'unités de moniteur (MU) pour chaque dose à une profondeur de 1 cm dans un champ de rayonnement de 20 cm x 20 cm.
      REMARQUE : Nombre de MU - dose (cGy)/facteur de sortie pour le champ de rayonnement/dose de profondeur de pourcentage (PDD) pour la profondeur. Par exemple, le facteur de sortie d'un champ de 20 cm x 20 cm est de 1,066, le PDD pour 1,0 cm est de 0,987 et le nombre de MU pour 8 Gy (800 cGy) est de 760 (800/1,066/0,987 à 760,35). Si plusieurs plaques doivent être rayonnées pour chaque dose, un champ plus grand peut également être utilisé, et les nombres de MU doivent être recalculés en fonction de la taille du champ. Le facteur de sortie et le PDD diffèrent selon les accélérateurs. Consultez les physiciens des radiations pour ces paramètres.
   3. Ajouter 1640 complétés à chaque puits pour atteindre 1 cm pour la hauteur du milieu.
      REMARQUE : La zone de croissance cellulaire de 6 plaques de puits se trouve sur le guide du fabricant. Par exemple, si la zone de croissance est de 9,5 cm² pour chaque puits de 6 plaques de puits, et 1,5 ml de suspension moyenne et 0,4 ml de suspension cellulaire a été ajoutée la veille, puis ajouter 7,6 ml à moyen au puits. La hauteur est nécessaire pour l'accumulation de dose. Une hauteur moyenne inférieure à 0,8 cm n'est pas recommandée.
      REMARQUE : Gardez les plaques couvertes pendant les radiations. Lorsque les plaques sont transférées entre la salle de culture cellulaire et la salle de radiothérapie, enveloppez les plaques de papier d'aluminium ou placez-les dans une boîte propre pour éviter la contamination. Maintenez les plaques à plat pour éviter que le milieu ne s'éverse.
   4. Définir un champ de rayonnement de 20 cm x 20 cm. Placez un bolus équivalent tissu de 1,0 cm d'épaisseur sur le canapé de traitement, et placez la plaque de 6 puits sur le bolus pour les garder en contact. Assurez-vous que la plaque entière est dans le champ de rayonnement. Réglez la distance de la peau source comme 100 cm. Alignez le niveau de surface moyen au niveau du laser en ajustant la hauteur du canapé de traitement.
      REMARQUE : Les plaques avec la même dose de rayonnement peuvent être rayonnées en même temps. Pour ce cas, un champ de rayonnement plus important est nécessaire, et le nombre de MU doit être recalculé en fonction du facteur de sortie correspondant. Assurez-vous que toutes les plaques sont dans le champ de rayonnement.
   5. Livrer la dose assignée à chaque assiette dans l'ordre.
      CAUTION : L'accélérateur linéaire ne peut être actionné que par des techniciens qualifiés. Éloignez-vous des radiations.
   6. Ramener les plaques à la salle de culture cellulaire. Changer le milieu avec 2 ml de milieu complété pour chaque puits. Culture à 37 oC avec 5% de CO₂ dans l'incubateur de culture cellulaire. Changez le milieu tous les 3 à 5 jours.
3. Coloration
   1. 7 à 10 jours après le rayonnement, lorsque de nombreuses colonies se forment et avant qu'elles ne grandissent trop et fusionnent, alors effectuez la coloration et le comptage comme suit. Retirer le milieu et laver brièvement avec du PBS. Ajouter 1 ml de formaldéhyde de 4 % à chaque puits pour fixer les cellules.
      CAUTION: Le formaldéhyde est volatil. Utilisez du formaldéhyde dans une hotte à fumée.
   2. Après 10 min de fixation, retirer le formaldéhyde et laver avec 2 ml d'eau distillée chaque puits deux fois.
   3. Ajouter 1 ml de 1% de solution de tache de violette cristalline à chaque puits. Tache pendant 10 min. Retirez la solution de tache violette en cristal et lavez-la à l'eau distillée 3 fois. Retirer l'eau et sécher les assiettes.
4. Comptage et calcul des colonies
   1. Comptez le nombre de colonies avec plus de 50 cellules. N'incluez pas les petites colonies de moins de 50 cellules. Vérifiez les colonies au microscope pour avoir une impression d'une colonie constituée de 50 cellules et marquez-la sur le fond de la plaque avec un stylo marqueur.
      REMARQUE : Photographier les puits et utiliser le logiciel ImageJ facilitera le processus de comptage.
   2. Calculer l'efficacité de la formation des colonies en tant que nombre de colonies divisées par le nombre de cellules enseissées. Calculer la fraction de survie comme efficacité de formation de colonie à une certaine dose d'irradiation divisée par l'efficacité de formation de colonie à 0 Gy.
   3. En utilisant la dose comme l'axe X et la fraction de survie comme l'axe y, une courbe de survie peut être obtenue. Comparez les courbes de survie entre les populations cellulaires positives et négatives.

Résultats

Les cellules A549 de 2 et 1-1-bas ont été triées (figure 1A). Certains marqueurs peuvent montrer des populations distinctes et sont faciles à gater. Cependant, certains marqueurs montrent simplement des modèles d'expression élevés et faibles, plutôt que des populations positives et négatives distinctes. Dans cette situation, un contrôle isotype est très important pour le gating. L'expression de la 2e '1 dans les cellules triées est validée par qPCR. L'expression de CACNA2D1<...

Discussion

Ce protocole décrit des méthodes pour étudier la radiosensibilité des CCS dans les lignées de cellules cancéreuses in vitro. Dans cette étude, l'expression de la 2e 1 est continue dans les lignées cellulaires du NSCLC. Par conséquent, le gating est basé sur un contrôle isotype. Avant le tri, l'expression de 2 o1 doit être examinée en plusieurs lignées cellulaires par cytométrie de flux et validée par QPCR ou western blot. Il est recommandé de réanalyser l'expression de la cellule triée de 2 et 1-bas pa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red	Thermo Fisher	15400054	Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water
1B50-1			This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)
4% formaldehyde solution	Solarbio	G2160
A549	ATCC		RRID: CVCL_0023
B27	Thermo Fisher	17504044
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher	1336
Centrifuge	Eppendorf	5910R
DMEM/F-12	Thermo Fisher	12500062
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16140071
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher	PHG0261
Flow cytometer/cell sorter	BD	FACSARIA III
H1299	ATCC		RRID: CVCL_0060
H1975	ATCC		RRID: CVCL_1511
Lightning-Link Fluorescein Kit	Innova Biosciences	310-0010
linear accelerator	VARIAN	CLINAC 600C/D
Methyl cellulose	Sigma Aldrich	M7027
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Thermo Fisher	15140122
Phosphate buffered saline	Solarbio	P1020
RPMI-1640	Thermo Fisher	11875093
SYBRGREEN	TOYOBO	QPK-201
TRIzol	Thermo Fisher	15596026
Violet crystal staining solution	Solarbio	G1062