Radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro del polmone

Riepilogo

La presenza di cellule staminali tumorali è stata associata a ricadute o scarsi esiti dopo la radioterapia. Questo manoscritto descrive i metodi per studiare la radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro polmonare.

Abstract

La presenza di cellule staminali tumorali (CSC) è stata associata a ricadute o scarsi esiti dopo la radioterapia. Lo studio dei CSC radioresistenti può fornire indizi per superare la radioresistenza. Il canale di calcio con cancello di tensione n. 2 è stato segnalato come marcatore per i CSC radioresistenti nelle linee cellulari del cancro del polmone non piccolo (NSCLC). Utilizzando il canale di calcio di 1 o più come esempio di marcatore CSC, vengono presentati metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC nelle linee cellulari NSCLC. I CSC sono ordinati con marcatori putativi in base alla citometria di flusso e la capacità di auto-rinnovamento delle cellule ordinate viene valutata in base all'espressione di esempio di formazione. Il saggio di formazione della colonia, che determina quante cellule perdono la capacità di generare discendenti formando la colonia dopo una certa dose di radiazioni, viene quindi eseguito per valutare la radiosensibilità delle cellule ordinate. Questo manoscritto fornisce i primi passi per studiare la radiosensibilità dei CSC, che stabilisce le basi per un'ulteriore comprensione dei meccanismi sottostanti.

Introduzione

La radioterapia svolge un ruolo importante nel trattamento del cancro. Tuttavia, l'esistenza di cellule staminali tumorali radioresistenti (CSC) può portare a ricadute o a scarsi esiti dopo la radioterapia^1,2. I CSC sono caratterizzati dalla loro capacità di auto-rinnovamento e dalla capacità di generare cellule tumorali eterogenoe³. Corazzati con una capacità di riparazione dei danni al DNA più efficiente o livelli più elevati di sistemi di scavenging a radicali liberi o altri meccanismi, i CSC sono relativamente resistenti alla radioterapia^{4,5,6,7 , 8}. L'identificazione dei marcatori CSC e l'esplorazione dei loro meccanismi faciliterà lo sviluppo di farmaci che supereranno la radioresistenza senza aumentare i normali danni ai tessuti.

Il canale di calcio con tensione-gated n. 2 - 1 isoforme 5 è stato segnalato come marcatore per i CSC radioresistenti nelle linee cellulari NSCLC⁹. L'H2-1 è stato originariamente identificato come marcatore CSC per il carcinoma epatocellulare (HCC)¹⁰. Utilizzando l'immunizzazione sottrattiva con una coppia di linee cellulari HCC derivate dai tumori primari e ricorrenti nello stesso paziente, è stato identificato un anticorpo denominato 1B50-1 per colpire specificamente le cellule HCC ricorrenti. 1B50-1-positivo le cellule hanno mostrato un'elevata efficienza di formazione della sfera in vitro e un'elevata tumorigenicità in vivo. Il suo antigene è stato identificato dalla spettrometria di massa, come isometria di sottounità di calcio 2 . L'espresso da 2 a 1 espressamente nei CSC non è rilevabile nella maggior parte dei tessuti normali, rendendolo un potenziale candidato per il targeting dei CSC¹⁰. Il numero 2 può anche fungere da marcatore CSC per le linee cellulari NSCLC, ed è stato dimostrato che impartisce parzialmente la radioresistenza alle cellule NSCLC migliorando l'efficienza della riparazione dei danni al DNA in risposta alle radiazioni⁹.

Lo studio dei CSC radioresistenti può fornire indizi per superare la radioresistenza. Come esempio, l'uso di .2-1 nel NSCLC, vengono presentati i principali metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC. Di solito, i CSC sono isolati con un marcatore di superficie putativo e vengono confrontate le caratteristiche delle cellule staminali e la radiosensibilità delle popolazioni cellulari positive e negative. La formazione di sfere in un mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita che supportano l'auto-rinnovamento è un utile saggio per valutare lo stelo delle cellule in vitro. Le cellule con elevata capacità di formazione della sfera possono mostrare un'elevata tumoripotenza quando iniettate in topi immunodeficienti^10,11,12. Il saggio di formazione della colonia viene quindi utilizzato per valutare la radiosensibilità delle cellule, che determina quanti hanno perso la capacità di generare discendenti formando la colonia dopo una dose di radiazioni¹³.

Protocollo

NOTA: I passi vengono eseguiti sotto la temperatura indicata. Per i passaggi in cui la temperatura non è menzionata, eseguire sotto la temperatura ambiente (18-25 gradi centigradi). Il mezzo di coltura cellulare deve essere immagazzinato a 4 gradi centigradi, e altri reagenti devono essere conservati secondo le guide del produttore. Medio deve essere preriscaldato a 37 gradi centigradi prima di essere aggiunto alle cellule.

1. Ordinamento delle celle

1. Coniugazione anticorpale
   NOTA: Considerando il tempo di incubazione più breve, l'anticorpo con etichetta diretta è preferibile per lo smistamento delle cellule. Se non è disponibile alcun anticorpo commerciale con etichetta diretta, utilizzare reagenti coniuganti a fluoresceina per coniugare l'anticorpo a un colorante fluorescente secondo la guida del produttore (vedi Tabella dei materiali). Poiché le cellule saranno coltivate dopo lo smistamento, tutti i passaggi devono essere eseguiti in un mobile di sicurezza biologica o in un banco pulito laminare. Per evitare la contaminazione, si raccomandano antibiotici (penicillina e streptomicina) da aggiungere al mezzo di coltura dopo lo smistamento.
   1. Aggiungere 1 - L di reagente modificatore per ogni 10 l di anticorpo da etichettare. Mescolare delicatamente.
   2. Aggiungere la miscela di anticorpo e modificatore direttamente sulla fluoresceina liofilizzata. Pipet delicatamente. Lasciare la fiala in piedi per 3 h o pernottamento a temperatura ambiente (RT) al buio.
   3. Aggiungere 1 - L di reagente quencher per ogni 10 -L dell'anticorpo. Il coniugato può essere utilizzato dopo 30 min. Il coniugato di fluoresceina può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 18 mesi.
   4. Prima dello smistamento, si raccomanda la titolazione dell'anticorpo coniugato. Preparare le celle che esprimono (ad es., H1299 o A549 per il numero 2) e non esprimono (ad esempio, H1975) il marcatore. Aliquota e incubarle con anticorpi a concentrazioni diverse (ad es. rispettivamente 15 g/mL, 7,5 g/mL, 1,5 g/mL e 0,75 g/mL).
   5. Eseguire l'analisi citometrica del flusso (con istogramma o grafico a punti) e scegliere la concentrazione in cui le cellule positive di H1299 o A549 possono essere separate dal controllo dell'isotipo e le cellule H1975 hanno pochi segnali non specifici.
2. Etichettatura delle celle
   1. Coltura A549 cellule in RPMI 1640 medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) in piatti 10 cm a 37 c e 5% CO₂ in un incubatore di colture cellulari. Cellule digeribili come segue per lo smistamento quando raggiungono l'80%-90% di confluenza (circa 5-10 x 10⁶ cellule per piatto).
   2. Rimuovere il supporto di coltura. Lavare brevemente le cellule con 3 mL di fosfato. Aggiungere 3 mL di 0,05% di prova a ogni piatto. Togliere la trypsin e lasciare che la trypsin residua digeristi le cellule a 37 gradi centigradi per 1-3 min. Controllare frequentemente il distacco delle cellule per evitare la digestione eccessiva.
      NOTA: Alcune linee cellulari possono essere relativamente difficili da digerire, ad esempio le linee cellulari NSCLC H520 e PC9. In tale situazione, 3 mL di trypsin può essere lasciato nel piatto, piuttosto che digestione con trypsin residua. Inoltre, il tempo di digestione può essere prolungato.
   3. Quando le cellule si allentano e iniziano a staccarsi dai piatti, aggiungere 3 mL di RPMI 1640 medio integrato con 10% FBS e pipette la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL.
   4. Centrifuga a 300 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante. Aggiungere 10 mL di PBS per risospendere le celle. Trasferire 0,5 mL (o almeno 5 x 10⁵ celle) di sospensione cellulare in un nuovo tubo come controllo isotipo. Le celle rimanenti sono per l'ordinamento.
   5. Centrifugare sia il tubo di controllo che quello sperimentale a 300 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante.
   6. Preparare la soluzione di lavoro per la colorazione diluindo il controllo isotipo o anticorpo isotipo coniugato di colorante fluorescente o anticorpo in PBS alla concentrazione ottimale titonata come accennato in precedenza.
      NOTA: In questo esperimento, l'anticorpo di 1B50-1 con coniugazione FITC è stato diluito in 7,5 g/mL. Il volume della soluzione di lavoro dipende dalla quantità di celle.
   7. Risospendere il controllo e le cellule sperimentali con ogni soluzione di lavoro a circa 2-5 x 10⁷ celle / mL e mescolare delicatamente. Incubare i campioni a RT per 30-40 min al buio.
   8. Lavare le cellule aggiungendo 10 mL di PBS a campione, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante. Risospendere le celle con 10 mL di PBS.
   9. Mettete 40 ceppi cellulari di 40 m su nuovi tubi da 50 mL rispettivamente per il controllo e le cellule sperimentali. Applicare la sospensione cellulare sul colino e raccogliere il flow-through.
      NOTA: Questo passaggio rimuove i ciuffi di cellule che potrebbero bloccare il capillare della selezionatrice di celle.
   10. Centrifugare il flusso a 300 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Risospendere le celle con PBS da 0,2 a 1,0 mL, quindi trasferirle in un tubo da 5 mL per la citometria di flusso.
3. Ordinamento delle celle per citometria di flusso
   1. Preparare due tubi da 5 mL per raccogliere le popolazioni cellulari positive e negative. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 medio in ogni tubo. Posizionare i tubi nella piattaforma di raccolta della selezionatrice di celle.
   2. Analizzare le celle di controllo e le celle sperimentali rispettivamente con il grafico a punti. Cancellare le celle vive con i parametri di dispersione in avanti (FSC) e di dispersione laterale (SSC). Cancellare la popolazione positiva e negativa delle cellule vive in base all'intensità FL-1.
   3. Raccogliere le celle 1 positive e le celle 1-negative. Registrare il numero di celle ottenute.
   4. Per confermare che le popolazioni di cellule raccolte hanno un diverso livello di espressione di 2, può essere eseguita una reazione a catena quantitativa di polimerasi (QPCR).
      1. Estrarre l'RNA di cellule positive e negative con il reagente di tiocianato del guanidionio e la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA secondo la guida del produttore. Eseguire QPCR con il reagente verde SYBR. Le sequenze dei primer sono le seguenti: "2"-F, CAGTTGAGATGGAGGATGRG; n. 2-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; e GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGAG.

2. Saggio di formazione della sfera

NOTA: Il saggio di formazione della sfera viene applicato per determinare la capacità di auto-rinnovamento delle cellule. Cellule con capacità di auto-rinnovamento potrebbero formare sfere in questo mezzo semisolido senza siero integrato con fattori di crescita. Tutte le fasi devono essere eseguite in un armadietto di sicurezza biologica o in un banco laminare pulito. Per evitare la contaminazione, si raccomandano antibiotici (penicillina e streptomicina) da aggiungere al mezzo di coltura dopo lo smistamento.

1. Preparazione media
   1. Preparare 2x Mezzo DMEM/F-12 rifornindo un pacchetto da 1 L di polvere DMEM/F-12 in 475 mL di acqua distillata. Aggiungere 2.438 g di NaHCO₃. Regolare il pH a 7,0–7,2 aggiungendo lentamente 1 N NaOH o 1 N HCl con agitazione. Aggiungere acqua distillata ad un volume finale di 500 mL. Sterilizzare il mezzo filtrando attraverso un filtro di 0,2 m.
   2. Preparare una soluzione di metilcellulosa 2% aggiungendo 2 g di metilcellulosa in 100 mL di acqua distillata. Autoclave la soluzione. La metilcellulosa può mostrare uno stato simile al cotone dopo l'autoclaving. Mescolare invertendo la bottiglia su e giù delicatamente per alcune volte e lasciarlo per il raffreddamento naturale. Diventerà un semisolido trasparente durante la notte.
   3. Per ottenere 20 mL di mezzo di auto-rinnovamento, aggiungere 10 mL di 2x dMEM/F-12 a un tubo da 50 mL. Aggiungere al di là di 400 l di B27 a media. Aggiungere il fattore di crescita epiderlo umano ricombinante (EGF) a una concentrazione finale di 25 ng/mL. Aggiungere il fattore di crescita del fibroblasto di base umano ricombinante (bFGF) ad una concentrazione finale di 25 ng/mL. Aggiungere il 2% di metilcellulosa per raggiungere un volume finale di 20 mL.
   4. Mescolare il mezzo per vortice in modo da ottenere il mezzo di auto-rinnovamento.
2. Semina delle cellule
   1. Trasferire le cellule raccolte nel mezzo di auto-rinnovamento per raggiungere 2000 cellule / mL e mescolare con un breve vortice. Aggiungere 100 l di sospensione cellulare ad ogni pozzetto di un accessorio ultra-basso 96 bene di fissaggio. Non utilizzare i pozzi sul bordo della piastra, in quanto il mezzo è più probabile che evapora in questi pozzi. Aggiungere acqua sterilizzata a questi pozzi.
   2. Cultura a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂ in incubatore di coltura cellulare per 10-14 giorni. Aggiungere 50 - L di mezzo di auto-rinnovamento al giorno 5-7.
3. Conteggio e calcolo delle sfere
   1. 10-14 giorni dopo la semina, contare il numero di sfere con più di 50 cellule (circa) o con un diametro superiore a 100 m al microscopio (4x obiettivo lente, 10x oculare).
      NOTA: Partendo dall'angolo in alto a sinistra del pozzo, contare le sfere mentre si sposta il tavolo obiettivo orizzontalmente verso destra con il joystick del microscopio. Quindi, spostare la tabella obiettivo nella riga centrale del campo visivo e contare le sfere da destra a sinistra. Quindi, spostatevi nella riga inferiore e contate da sinistra a destra. Un pozzo di 96 piastra bene può essere contato all'interno di tre righe.
   2. Calcolare l'efficienza della formazione della sfera come il numero di sfere divise per il numero di cellule semiate. Confrontare l'efficienza della formazione della sfera tra le popolazioni cellulari positive e negative.

3. Saggio sulla formazione della colonia

NOTA: Il saggio di formazione della colonia viene applicato per determinare la radiosensibilità delle cellule. Le radiazioni possono essere fornite da un acceleratore lineare utilizzato per la radioterapia. Se l'apparecchiatura è disponibile, è possibile utilizzare anche un sistema di irradiazione cellulare per uso in laboratorio. I passaggi 3.1, 3.2.3 e 3.2.6 devono essere eseguiti in un mobile di sicurezza biologica o in un banco pulito laminare. Per evitare la contaminazione, si raccomandano antibiotici (penicillina e streptomicina) da aggiungere al mezzo di coltura dopo lo smistamento.

1. Semina delle cellule
   1. Preparare una piastra 6 pozzetto per ogni dose di radiazioni compreso il gruppo 0 Gy. Aggiungere 1,5 mL di mezzo ad ogni pozzetto di 6 pozzetto. Il mezzo di coltura per la formazione di test delle colonia è il mezzo convenzionale RPMI 1640 integrato con il 10% di FBS (denominato "completato 1640").
   2. Diluire le cellule raccolte con completate 1640 medie a 1000 cellule / mL.
   3. Aggiungere la sospensione cellulare ai pozzi. Agitare le piastre orizzontalmente per distribuire le cellule uniformemente nei pozzi. Registrare il volume aggiunto in ogni gruppo di dosi.
      NOTA: Generalmente, semi 200 cellule per bene per 0 Gy, 200 celle per 2 Gy, 400 cellule per 4 Gy, 800 cellule per 6 Gy, e 1600 cellule per 8 Gy, rispettivamente. È meglio regolare i numeri delle cellule in celle non ordinate nei pre-esperimenti.
   4. Coltura a 37 gradi centigradi con 5% di CO₂ in incubatrice di coltura cellulare.
2. radiazione
   1. Dopo che le cellule si sono attaccate al fondo dei pozzi (di solito un giorno dopo la semina, e non è consigliabile passare più tempo considerando la proliferazione cellulare), procedere all'esecuzione di radiazioni cellulari.
   2. Calcolare il numero di unità di monitoraggio (MU) per ogni dose ad una profondità di 1 cm in un campo di radiazione di 20 cm x 20 cm.
      NOTA: Numero di MU : dose (cGy)/fattore di uscita per la dose di campo/profondità percentuale (PDD) di radiazione per la profondità. Ad esempio, il fattore di output per un campo di 20 cm x 20 cm è 1,066, PDD per 1,0 cm è 0,987 e numero di MU per 8 Gy (800 cGy) è 760 (800/1.066/0.987 - 760,35). Se più piastre devono essere irradiate per ogni dose, è possibile utilizzare anche un campo più grande e il numero di MU deve essere ricalcolato in base alle dimensioni del campo. Fattore di uscita e PDD differiscono in diversi acceleratori. Fare riferimento ai fisici delle radiazioni per questi parametri.
   3. Aggiungere completato 1640 ad ogni pozzo per raggiungere 1 cm per l'altezza del mezzo.
      NOTA: L'area di crescita cellulare di 6 piastra di pozzo può essere trovata sulla guida del produttore. Ad esempio, se l'area di crescita è 9,5 cm² per ogni pozzo di 6 pozze, e 1,5 mL di media e 0,4 mL di sospensione cellulare è stato aggiunto il giorno prima, quindi aggiungere 7,6 mL medio al pozzo. L'altezza è necessaria per l'accumulo di dose. Si sconsiglia un'altezza media inferiore a 0,8 cm.
      NOTA: Tenere le piastre coperte durante le radiazioni. Quando le piastre vengono trasferite tra la stanza di coltura cellulare e la sala radioterapia, avvolgere le piastre con un foglio di alluminio o metterle in una scatola pulita per evitare la contaminazione. Tenere le piastre piatte per evitare perdite medie.
   4. Impostare un campo di radiazione di 20 cm x 20 cm. Posizionare una bolus ingenuo di 1,0 cm di spessore sul divano di trattamento e posizionare la piastra 6 pozzo sul bolo per tenerli in contatto. Assicurarsi che l'intera piastra sia all'interno del campo di radiazione. Impostare la distanza della pelle di origine come 100 cm. Allinea il livello medio della superficie al livello del laser regolando l'altezza del divano di trattamento.
      NOTA: Le piastre con la stessa dose di radiazioni possono essere irradiate contemporaneamente. In questo caso, è necessario un campo di radiazione più grande e il numero di MU deve essere ricalcolato in base al fattore di output corrispondente. Assicurati che tutte le piastre siano all'interno del campo di radiazione.
   5. Consegnare ogni dose assegnata a ciascuna piastra in sequenza.
      AVVISO: L'acceleratore lineare può essere azionato solo da tecnici qualificati. Stai lontano dalle radiazioni.
   6. Riporta le tavole nella stanza della coltura cellulare. Cambiare il supporto con 2 mL di mezzo completato per ogni pozzo. Coltura a 37 gradi centigradi con 5% di CO₂ in incubatrice di coltura cellulare. Cambiare il mezzo ogni 3-5 giorni.
3. Colorazione
   1. 7-10 giorni dopo le radiazioni, quando molte colonie si formano e prima che crescano troppo grandi e si fondono insieme, quindi eseguire la colorazione e il conteggio come segue. Rimuovere il supporto e lavare brevemente con PBS. Aggiungere 1 mL di 4% formaldeide ad ogni pozzo per fissare le cellule.
      AVVISO: La formaldeide è volatile. Utilizzare la formaldeide in una cappa di fumi.
   2. Dopo 10 min di fissazione, rimuovere la formaldeide e lavare con 2 mL di acqua distillata ogni pozzo due volte.
   3. Aggiungere in ogni pozzo una soluzione di macchie viola di cristallo di 1% di 1%. Macchia per 10 min. Rimuovere la soluzione di macchie viola di cristallo e lavare con acqua distillata 3 volte. Rimuovere l'acqua e asciugare le piastre.
4. Conteggio e calcolo delle colonia
   1. Contare il numero di colonie con più di 50 cellule. Non includere piccole colonie con meno di 50 cellule. Controlla le colonie al microscopio per avere un'impressione di una colonia costituita da 50 cellule e segnala sul fondo della piastra con una pennarello.
      NOTA: Fotografare i pozzi e utilizzare il software ImageJ faciliterà il processo di conteggio.
   2. Calcolare l'efficienza della formazione della colonia come il numero di colonie diviso per il numero di cellule semiate. Calcolare la frazione di sopravvivenza come l'efficienza di formazione della colonia ad una certa dose di irradiazione divisa per l'efficienza di formazione della colonia a 0 Gy.
   3. Utilizzando la dose come asse x e frazione di sopravvivenza come asse y, è possibile ottenere una curva di sopravvivenza. Confrontare le curve di sopravvivenza tra le popolazioni cellulari positive e negative.

Risultati

Le celle A549 di livello 1 e di abbassamento di 1 USD sono state ordinate (Figura 1A). Alcuni marcatori possono mostrare popolazioni distinte e sono facili da tenere al cancello. Tuttavia, alcuni marcatori mostrano solo modelli di espressione alta e bassa, piuttosto che popolazioni positive e negative distinte. In questo caso, un controllo isotipo è molto importante per gating. L'espressione di 2 x 1 nelle celle ordinate viene convalidata da qPCR. L'espressione di CACNA2D1, il gene...

Discussione

Questo protocollo descrive i metodi per studiare la radiosensibilità dei CSC nelle linee cellulari tumorali in vitro. In questo studio, l'espressione di "2" è continua nelle righe cellulari NSCLC. Pertanto, gating si basa su un controllo isotipo. Prima dell'ordinamento, l'espressione n. 2 s1 deve essere esaminata in più linee cellulari per citometria di flusso e convalidata da QPCR o macchia occidentale. Si raccomanda di analizzare nuovamente l'espressione di , 1, delle cellule ordinate di 1-alto e di 1-basso per cito...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red	Thermo Fisher	15400054	Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water
1B50-1			This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)
4% formaldehyde solution	Solarbio	G2160
A549	ATCC		RRID: CVCL_0023
B27	Thermo Fisher	17504044
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher	1336
Centrifuge	Eppendorf	5910R
DMEM/F-12	Thermo Fisher	12500062
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16140071
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher	PHG0261
Flow cytometer/cell sorter	BD	FACSARIA III
H1299	ATCC		RRID: CVCL_0060
H1975	ATCC		RRID: CVCL_1511
Lightning-Link Fluorescein Kit	Innova Biosciences	310-0010
linear accelerator	VARIAN	CLINAC 600C/D
Methyl cellulose	Sigma Aldrich	M7027
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Thermo Fisher	15140122
Phosphate buffered saline	Solarbio	P1020
RPMI-1640	Thermo Fisher	11875093
SYBRGREEN	TOYOBO	QPK-201
TRIzol	Thermo Fisher	15596026
Violet crystal staining solution	Solarbio	G1062