Análisis de la capacidad de aprendizaje y memoria en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer usando el laberinto de agua Morris

Resumen

Aquí, se describe un protocolo para llevar a cabo las pruebas de laberinto de agua Morris para evaluar la capacidad de aprendizaje y memoria de los ratones modelo de la enfermedad de Alzheimer y para evaluar el efecto de la acupuntura manual para tratarlos.

Resumen

Un experimento de laberinto de agua Morris (MWM) obliga a los animales experimentales a nadar y aprender a encontrar una plataforma escondida en el agua. Es ampliamente utilizado en la investigación científica para evaluar el aprendizaje y la memoria de los animales. Debido al uso extensivo de la prueba MWM, los protocolos experimentales visuales son esenciales para los investigadores. Este manuscrito utiliza los últimos estudios para introducir el protocolo de la prueba MWM. Enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por una pérdida progresiva de la memoria y la función cognitiva. Un tratamiento alternativo y complementario utilizado para la AD es la Acupuntura Manual (MA). Para evaluar la capacidad de aprendizaje y memoria de los ratones modelo AD, se llevó a cabo la prueba MWM. El ensayo de plataforma visible, el ensayo de plataforma oculta, el ensayo de sondeo y la prueba de reversión de MWM se utilizaron para evaluar el aprendizaje espacial y la capacidad de memoria. En la prueba de la plataforma visible, la velocidad de natación y la latencia de escape de los ratones en diferentes grupos no fue significativamente diferente. En la plataforma oculta y las pruebas de inversión, el grupo AD mostró una latencia de escape larga. La latencia de escape disminuyó significativamente después del tratamiento con MA. El número de cruce de plataforma baja y la proporción de tiempo en el cuadrante SW en el ensayo de la sonda aumentaron después del tratamiento de MA (p < 0.05 o p < 0.01). Los resultados de las pruebas de MWM sugieren que ma puede mejorar eficazmente el aprendizaje espacial y las capacidades de memoria de los ratones modelo AD. Las rigurosas operaciones experimentales garantizaron la fiabilidad de los resultados.

Introducción

Actualmente, el experimento MWM se ha convertido en el experimento conductual más utilizado y estándar para evaluar el aprendizaje espacial y la memoria de los animales¹. Inicialmente fue diseñado por el psicólogo británico Richard G. Morris y se ha mejorado constantemente. Muchas ventajas tales como el entrenamiento mínimo, la utilidad entre especies, la insensibilidad a las diferencias en el peso corporal, y la capacidad de prueba repetida de MWM lo convierten en el mejor método para evaluar la función cognitiva². La enfermedad de Alzheimer (AD) es un problema médico importante, caracterizado principalmente por una disminución en el procesamiento de la memoria y la función cognitiva³. MWM es un medio experimental indispensable para evaluar la capacidad de aprendizaje y memoria de los animales modelo AD y la eficacia de los métodos de intervención. Los experimentos MWM generalmente consumen mucho tiempo (6-11 días) e implican muchos factores variables^4. Aunque hay muchos artículos sobre experimentos de laberinto de agua, en la práctica, los investigadores carecen de un protocolo coherente. Por lo tanto, un vídeo de proceso de protocolo intuitivo y riguroso es particularmente importante. Utilizando un experimento anterior como ejemplo⁵, se describen todos los pasos del MWM. Usando MWM, estudios previos sugirieron que la acupuntura podría aliviar los síntomas de los ratones modelo AD^5,6,7.

En este documento, el protocolo MWM utilizado en un estudio reciente⁵ se describe para proporcionar un método simple y visible para que los investigadores evalúen el aprendizaje espacial y la memoria de los animales modelo AD.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de ética animal de la Universidad de Medicina China de Beijing, y fue de acuerdo con todas las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de China. No hubo una situación de muerte accidental durante el procedimiento experimental, y ningún animal necesitaba ser eutanasiado en este estudio.

1. Preparación

1. Comprar 30 machos SAMP8 ratones y 10 machos SAMR1 ratones (edad: 8 meses).
2. Aloje los ratones individualmente en jaulas de ventilación individuales a una temperatura de 24 oC y un ciclo oscuro/claro de 12 h.
3. Alimente a los ratones con una dieta de pellets estándar disponible ad libitum y proporcione agua potable estéril.
4. Aclimatar todos los ratones al medio ambiente durante 5 días antes de la experimentación.

2. Agrupación de animales

1. Divida aleatoriamente 30 ratones SAMP8 en tres grupos (n a 10/grupo): el grupo AD, el grupo de acupuntura manual (MA) y el grupo de medicamentos (M).
2. Utilice 10 ratones SAMR1 como el grupo de control normal (N)⁶.

3. Administración de comprimidos de clorhidrato de donepezil

1. Aplastar un comprimido de clorhidrato de donepezil (5 mg/tableta) y disolverlo en 50 ml de agua destilada.
2. Entregar el medicamento preparado en el paso 3.1 a dosis de 1 mg/kg a los ratones utilizando un gavage oral una vez al día⁸ durante todo el experimento, incluidos los días en que se realizan las pruebas de MA y MWM.

4. Administración de la acupuntura manual

1. Inmovilizar a los ratones del grupo MA en bolsas de ratón.
2. Utilice agujas de acupuntura estériles desechables (0,25 mm x 13 mm) y aplique el método de espina plana de MA en Baihui (GV20) y Yintang (GV29)⁵ hacia la nariz durante 20 min. Asegúrese de que la profundidad de la aguja sea de 0,2-0,3 cm.
3. Girar bidireccionalmente la manipulación dentro de 90o a una velocidad de aproximadamente 180 r/min cada 5 minutos durante 15 s cada vez durante todo el experimento, incluidos los días en que se realizan pruebas de tratamiento de MA y MWM.

5. Prueba MWM

NOTA: A las 24 h después de los 15 días consecutivos de tratamiento, someta a los ratones de los cuatro grupos a la prueba de MWM. Lleve a cabo el ensayo de plataforma visible, el ensayo de plataforma oculta, el ensayo de sondeo y el ensayo de reversión en orden.

1. Prepárese para la prueba MWM.
   1. Coloque el dispositivo MWM y el sistema de adquisición y procesamiento de señal en una sala de experimentos diseñada para mantener el aislamiento acústico.
   2. Coloque un depósito blanco circular (diámetro de 90 cm, alto a 50 cm) rodeado por un paño opaco en el centro del dispositivo MWM.
   3. Fije una cámara de vídeo al techo del dispositivo MWM y conéctela a una grabadora de vídeo con un sistema de seguimiento automatizado para recopilar los datos.
   4. Divida el tanque del laberinto de agua por igual en cuatro regiones iguales usando dos líneas mutuamente perpendiculares, etiquetadas norte (N), sur (S), este (E) y oeste (W). Divida el área de la piscina conceptualmente en cuatro cuadrantes del mismo tamaño (NE, NW, SW y SE).
   5. A la vista del ratón, coloque señales visuales de diferentes formas en la pared de cada cuadrante como referencias visuales (por ejemplo, cuadrados, triángulos y círculos).
      NOTA: Las señales distales son los puntos de referencia de navegación del animal para localizar la plataforma. Por lo tanto, no los mueva durante la prueba. La posición del investigador es una posible señal distal y puede influir en el MWM. Por lo tanto, el investigador debe permanecer fuera de la vista de los ratones mientras espera a que el animal realice la prueba.
   6. Llenar el depósito circular con agua a una profundidad de 30 cm y mantener a 22 oC con un calentador eléctrico.
   7. Renderice el agua opaca con unos 150 g de leche en polvo.
2. Realice la versión de prueba visible de la plataforma.
   1. Coloque una plataforma circular de plástico (diámetro de 9,5 cm; altura a 28 cm) 1 cm por encima de la superficie del agua en cualquier cuadrante al azar.
   2. Pon una bandera negra en la plataforma.
   3. Suelte cada ratón suavemente en el agua a nivel del agua desde uno de los cuatro lugares de inicio frente a la pared del tanque. No deje caer el ratón en el agua.
   4. Active el programa de seguimiento de computadoras tan pronto como el ratón se suelte al agua.
   5. Dé a cada ratón 60 s para buscar la plataforma. Al final de cada prueba, coloque cada ratón en la plataforma y permita que permanezca en él durante 10-30 s.
   6. Observe las trayectorias de natación de los ratones en el ordenador, registre el tiempo que el ratón tardó en encontrar la plataforma como latencia de escape y analice la velocidad de natación.
   7. Seque cada ratón con toallas y caliente con un calentador eléctrico. Asegúrese de utilizar una fuente de calor adecuada para evitar que el animal se sobrecaliente.
      NOTA: Coloque cada ratón en la piscina en cada uno de los cuatro cuadrantes iniciales diferentes para cuatro pruebas, moviendo la plataforma a una ubicación diferente con cada prueba posterior. El intervalo entre dos ensayos con cada ratón es de 15-20 min.
3. Realice la prueba de navegación de la plataforma oculta/lugar.
   1. Coloque la misma plataforma sin una bandera en el cuadrante SE.
   2. Coloque aleatoriamente el ratón en la piscina desde cada uno de los cuatro cuadrantes (NE, NW, SW, N) frente a la pared de la piscina para cuatro pruebas. Utilice un intervalo de tiempo de 15–20 min entre dos ensayos.
   3. Dar a cada ratón 60 s para buscar la plataforma oculta.
   4. Registre la latencia de escape de cada prueba después de que el ratón suba a la plataforma para su posterior análisis.
   5. Seque cada ratón con toallas y caliente con un calentador eléctrico.
      NOTA: Lleve a cabo la prueba de la plataforma oculta de los días 2 a 6. Si el ratón no puede encontrar la plataforma en 60 s, lleve al ratón a subir a la plataforma y permita que permanezca allí durante 10-30 s al final de cada prueba. Realice cuatro ensayos/día para cada ratón durante 5 días consecutivos, con la plataforma y las señales visuales en posiciones constantes.
4. Realice la prueba de la sonda.
   NOTA: Localice cada ratón en la piscina en una nueva posición de inicio para observar la capacidad de exploración espacial del ratón.
   1. Retire la plataforma.
   2. Localice cada ratón frente a la pared del tanque en la piscina una vez durante 60 s. Asegúrese de que la ubicación inicial sea el cuadrante NW, que es el cuadrante más alejado del cuadrante SE.
   3. Registre la distancia de natación, la velocidad de natación y el número de crossover de la plataforma en el laberinto.
   4. Seque cada ratón con toallas y proporcione calor después del ensayo.
5. Realice la prueba de reversión.
   NOTA: Realice la prueba de reversión de los días 8 a 11.
   1. Coloque la plataforma en el centro del cuadrante NW (en lugar del cuadrante SE).
   2. Siga los pasos 5.3.2 a 5.3.5 como se detalla en la sección de prueba de la plataforma oculta.

6. Análisis estadístico

1. Utilice el software de estadísticas (por ejemplo, SPSS 20.0) para realizar el análisis estadístico.

Resultados

El diagrama del eje de tiempo de este protocolo se muestra en la Figura 1.

Figura 1: Diagrama del eje temporal del protocolo de estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El eje de tiempo muestra que este experimento duró un total de 21 días. El tratamiento se aplicó al ratón durante todo el experimento y las pruebas de MWM comenzaron después de 15 días de tratamiento. La plataforma visible, la plataforma oculta, la sonda y los ensayos de reversión se llevaron a cabo en orden.

Los resultados publicados anteriormente de Ding et al.⁵ se presentan como resultados típicos de la Figura 2de MWM.

Figura 2: Resultados típicos de la prueba de laberinto de agua Morris (n.o 10). (A) Cambios en la latencia de escape y la velocidad de natación de las ratas entre los diferentes grupos en el ensayo de la plataforma visible. (B) Cambios en la latencia de escape de ratas entre los diferentes grupos en la plataforma oculta y ensayos de inversión. Los valores p son *p < 0.05 y **p < 0.01 en comparación con el grupo de control. El símbolo de la clase -- indica p < 0.01 en comparación con el grupo AD. (C) Cambios en el número de cruce de la plataforma y el porcentaje del tiempo pasado por las ratas en el cuadrante noroeste entre los diferentes grupos experimentales en el ensayo de la sonda. Se muestran los resultados de la plataforma visible, la plataforma oculta y el ensayo de reversión en cada grupo (n a 10, media de SD). Esta cifra ha sido modificada de Ding et al⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 2A muestra los resultados del ensayo de la plataforma visible. No se observaron diferencias estadísticas en la latencia de escape o la velocidad de natación entre los grupos en el primer día de MWM. La Figura 2B muestra los resultados de la plataforma oculta y la prueba de reversión de los días 2 a 6 y los días 8 a 11. La latencia de escape del grupo AD se mantuvo en un nivel alto en cada día de la prueba. La latencia de escape de los otros tres grupos disminuyó gradualmente. La latencia de escape de los días 3 a 6 y 8 a 11 fue más larga en el grupo DE AD que en el grupo de control (p < 0.01). Las latencias de escape de los ratones en la MA y los grupos de drogas fueron más cortas que las de los ratones en el grupo AD los días 2-6 y los días 8-11, respectivamente (p < 0.01). La Figura 2C muestra los resultados del ensayo de la sonda. El número de ratones cruzados de la plataforma en el grupo AD fue estadísticamente menor que el del grupo de control (p < 0.01). El número de cruce de la plataforma en el grupo MA era más alto que el del grupo AD (p < 0.05). La proporción de tiempo empleado en el cuadrante SW por los ratones en el grupo AD fue significativamente menor que la del grupo de control (p < 0.01). La proporción de tiempo invertido en el cuadrante SW en el grupo MA fue mayor que la del grupo AD (p < 0.01).

Discusión

Aunque muchos laberintos de agua, incluyendo el laberinto de agua de Biel y el laberinto de agua de Cincinnati, han existido durante al menos un siglo, sólo el MWM ha sido ampliamente utilizado para evaluar de manera efectiva y objetiva el aprendizaje espacial y la capacidad de memoria porque tiene muchos ventajas⁹. A pesar del uso extensivo del MWM, el procedimiento no siempre se ha utilizado de manera óptima. Los experimentos MWM generalmente toman mucho tiempo y están influenciados por muchos factores variables. Hay algunos aspectos eficaces y confiables que ayudan a detectar cambios en el aprendizaje espacial y la capacidad de memoria que deben tenerse en cuenta.

Se realizaron cuatro ensayos MWM diferentes. El ensayo de plataforma visible se utilizó el día 1 de MWM. Si los animales podían nadar directamente a la plataforma, indicaba que la capacidad de natación y la visión de los animales eran normales^10. Otnass sugirió que el ensayo de plataforma visible se llevara a cabo primero¹¹. Los resultados del ensayo de plataforma visible en este estudio significaron que los cuatro grupos comenzaron en el mismo nivel de aprendizaje. A partir de ahí, se podrían iniciar los sucesivos experimentos. El ensayo de plataforma oculta se utilizó para evaluar la capacidad de los ratones para adquirir capacidad de aprendizaje y memoria. El ensayo de la sonda se llevó a cabo el día 7, 24 h después del final de la prueba de la plataforma oculta, para evaluar la memoria de trabajo. Por último, el ensayo de reversión se utilizó para evaluar la memoria de trabajo². Los cambios en los cuatro ensayos diferentes de MWM juntos indicaron que los ratones modelo AD tenían baja capacidad de aprendizaje y memoria y que MA tuvo un efecto positivo en AD⁵.

No existen normas específicas para las dimensiones de la piscina y la plataforma^1. En la mayoría de los estudios de MWM se utiliza una piscina de 214 cm de diámetro. Vorhees y Williams demostraron que con protocolos idénticos, las ratas aprenden más rápido en una piscina de 122 cm que en una piscina de 210 cm; la pendiente pronunciada de la curva de aprendizaje indica que la piscina de 122 cm de diámetro es extremadamente fácil para las ratas navegar¹². En el protocolo actual, teniendo en cuenta la vejez y la estatura débil de los ratones AD, se utilizó una piscina de 90 cm de diámetro y una plataforma de 9,5 cm de diámetro. Los resultados de los experimentos preliminares indicaron que los ratones tenían más dificultades para encontrar la plataforma en una piscina de mayor diámetro. Por lo tanto, las pruebas en agrupaciones más grandes no representan la diferencia real entre los grupos. A los animales experimentales les resultaba más difícil encontrar la plataforma en una piscina más grande con una plataforma más pequeña^4. Por lo tanto, el tamaño de la piscina y la plataforma debe optimizarse en experimentos preliminares de acuerdo con los requisitos experimentales y el estado de los animales experimentales.

Se recomienda el agua a temperaturas que oscilan entre 20 y 24 oC para realizar la prueba MWM⁴. Los animales experimentales envejecidos tuvieron un mal desempeño en agua fría^13,lo que indica una clara pérdida de termorregulación¹⁴dependiente de la edad. En este estudio, se colocó un termostato en la parte inferior de la piscina para mantener la temperatura del agua a 20-24 oC. Los resultados del estudio no mostraron ninguna diferencia significativa en las velocidades de natación entre los cuatro grupos^5.

MWM es una técnica poderosa para evaluar la función cognitiva y es ampliamente utilizado en estudios en la actualidad. Sin embargo, no hay un equipo definido, estándar y consistente para realizar la prueba MWM, incluyendo los tamaños de la piscina y la plataforma^15,16. Diferentes laboratorios tienen diferentes especificaciones para MWM. Por lo tanto, los investigadores eligen el dispositivo experimental adecuado de acuerdo con sus requisitos experimentales individuales, lo que puede causar confusión entre los investigadores. También son necesarios experimentos preliminares. Es necesario realizar más estudios sobre experimentos básicos como MWM. En la actualidad, la flexibilidad de MWM como herramienta experimental sólo radica en la capacidad de elegir los protocolos básicos de acuerdo con el estudio diseñado. Por lo tanto, esta prueba se puede aplicar para evaluar la función cognitiva en mayor profundidad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
acupuncture needles	Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company	511526
desktop computer	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	Lenovo T4700D
Donepezil Hydrochloride Tablet	Eisai China	H20050978	Aricept
mice	Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science	SCXK2014-0003
Mirros water maze device	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	WMT-100S
mouse bags	home-made
Signal acquisition and processing system	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	BL-420N