Analyse der Lern- und Gedächtnisfähigkeit in einem Alzheimer-Mausmodell mit dem Morris Water Maze

Zusammenfassung

Hierin wird ein Protokoll zur Durchführung der Morris-Wasserlabyrinthtests beschrieben, um die Fähigkeit des Lernens und Gedächtnisses von Alzheimer-Modellmäusen zu bewerten und die Wirkung der manuellen Akupunktur für ihre Behandlung zu bewerten.

Zusammenfassung

Ein Morris-Wasserlabyrinth (MWM)-Experiment zwingt Versuchstiere zum Schwimmen und lernen, eine im Wasser versteckte Plattform zu finden. Es ist weit verbreitet in der wissenschaftlichen Forschung verwendet, um das Lernen und Gedächtnis von Tieren zu bewerten. Aufgrund des umfangreichen Einsatzes des MWM-Tests sind visuelle Versuchsprotokolle für Forscher unerlässlich. Dieses Manuskript verwendet die neuesten Studien, um das Protokoll des MWM-Tests einzuführen. Alzheimer-Krankheit (AD) ist durch einen fortschreitenden Verlust des Gedächtnisses und der kognitiven Funktion gekennzeichnet. Eine alternative und ergänzende Behandlung für AD ist die manuelle Akupunktur (MA). Um die Lern- und Gedächtnisfähigkeit von AD-Modellmäusen zu bewerten, wurde der MWM-Test durchgeführt. Die "Visible Platform Trial", die Hidden Platform Trial, die Probeversuchs- und Dieumkehrstudie von MWM wurden zur Bewertung der räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeit verwendet. Im Versuch der sichtbaren Plattform war die Schwimmgeschwindigkeit und Fluchtlatenz von Mäusen in verschiedenen Gruppen nicht signifikant unterschiedlich. In der versteckten Plattform und umgedrehten Studien zeigte die AD-Gruppe eine lange Fluchtlatenz. Die Fluchtlatenz verringerte sich nach der MA-Behandlung signifikant. Niedrige Plattform-Crossover-Nummer und der Anteil der Zeit im SW-Quadranten in der Sondenstudie stiegen nach der MA-Behandlung (p < 0,05 oder p < 0,01). Die Ergebnisse der MWM-Tests deuten darauf hin, dass MA die räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten von AD-Modellmäusen effektiv verbessern kann. Strenge Experimentelle Operationen sorgten für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.

Einleitung

Derzeit ist das MWM-Experiment das am weitesten verbreitete und das Standard-Verhaltensexperiment zur Bewertung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses von Tieren¹. Es wurde ursprünglich vom britischen Psychologen Richard G. Morris entworfen und ständig verbessert. Viele Vorteile wie minimales Training, artenübergreifende nutzbringende, Unempfindlichkeit gegenüber Unterschieden im Körpergewicht und wiederholte Testfähigkeit von MWM machen es zur besten Methode zur Beurteilung der kognitiven Funktion². Alzheimer-Krankheit (AD) ist ein großes medizinisches Problem, in erster Linie durch einen Rückgang der Gedächtnisverarbeitung und kognitive Funktion gekennzeichnet³. MWM ist ein unverzichtbares experimentelles Mittel, um die Lern- und Gedächtnisfähigkeit von AD-Modelltieren und die Wirksamkeit von Interventionsmethoden zu bewerten. MWM-Experimente sind in der Regel zeitaufwändig (6–11 Tage) und beinhalten viele variable Faktoren⁴. Obwohl es viele Artikel über Wasserlabyrinth-Experimente gibt, fehlt den Forschern in der Praxis ein kohärentes Protokoll. Daher ist ein intuitives und strenges Protokollprozessvideo besonders wichtig. Anhand eines vorherigen Experiments als Beispiel⁵werden alle Schritte des MWM beschrieben. Mit MWM, frühere Studien legten nahe, dass Akupunktur könnte die Symptome der AD-Modell Mäuse^5,6,7.

Hierin wird das MWM-Protokoll beschrieben, das in einer aktuellen Studie⁵ verwendet wurde, um Forschern eine einfache und sichtbare Methode zur Beurteilung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses von AD-Modelltieren zu bieten.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Animal Ethics Committee der Beijing University of Chinese Medicine genehmigt und entsprach allen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren chinas. Während des Versuchsfalles gab es keine Unfalltodessituation, und in dieser Studie mussten keine Tiere eingeschläfert werden.

1. Vorbereitung

1. Kaufen Sie 30 männliche SAMP8-Mäuse und 10 männliche SAMR1-Mäuse (Alter: 8 Monate).
2. Die Mäuse einzeln in einzelnen Lüftungskäfigen bei einer Temperatur von 24 °C und einem 12 h Dunkel-Licht-Zyklus unterbringen.
3. Füttern Sie die Mäuse mit einer Standard-Pellet-Diät, die ad libitum verfügbar ist, und liefern Sie steriles Trinkwasser.
4. Akklimatisieren Sie alle Mäuse für 5 Tage vor dem Experimentieren an die Umwelt.

2. Gruppierung von Tieren

1. Teilen Sie zufällig 30 SAMP8-Mäuse in drei Gruppen auf (n = 10/Gruppe): die AD-Gruppe, die manuelle Akupunkturgruppe (MA) und die Medizingruppe (M).
2. Verwenden Sie 10 SAMR1-Mäuse als normale Kontrollgruppe (N) Gruppe⁶.

3. Verabreichung von Donepezil-Hydrochloridtabletten

1. Eine Donepezil-Hydrochlorid-Tablette (5 mg/Tablette) zerkleinern und in 50 ml destilliertem Wasser auflösen.
2. Geben Sie das in Schritt 3.1 zubereitete Arzneimittel in Dosen von 1 mg/kg an die Mäuse mit einer oralen Gavage einmal täglich⁸ während des gesamten Experiments, einschließlich der Tage, an denen die MA-Behandlung und MWM-Tests durchgeführt werden.

4. Verabreichung der manuellen Akupunktur

1. Immobilisieren Sie die Mäuse der MA-Gruppe in Mausbeuteln.
2. Verwenden Sie Sterileinweg-Akupunkturnadeln (0,25 mm x 13 mm) und wenden Sie die Flachdorn-Methode von MA auf Baihui (GV20) und Yintang (GV29)⁵ 20 min zur Nase an. Stellen Sie sicher, dass die Nadeltiefe 0,2–0,3 cm beträgt.
3. Bidirektional wirbeln Die Manipulation innerhalb von 90° mit einer Geschwindigkeit von etwa 180 r/min alle 5 min für 15 s jedes Mal während des gesamten Experiments, einschließlich der Tage, an denen MA-Behandlung und MWM-Tests durchgeführt werden.

5. MWM-Test

HINWEIS: Um 24 uhr nach den 15 aufeinanderfolgenden Behandlungstagen die Mäuse in den vier Gruppen dem MWM-Test zu unterziehen. Führen Sie den Test der sichtbaren Plattform, den Test für versteckte Plattformen, den Testversuch für Diesonund den Umkehrversuch in der Reihenfolge durch.

1. Bereiten Sie sich auf den MWM-Test vor.
   1. Positionieren Sie das MWM-Gerät und das Signalerfassungs- und -verarbeitungssystem in einem Experimentraum, der für die Schalldämmung ausgelegt ist.
   2. Legen Sie einen kreisförmigen weißen Tank (Durchmesser = 90 cm, Höhe = 50 cm) in die Mitte des MWM-Geräts, das von einem undurchsichtigen Tuch umgeben ist.
   3. Befestigen Sie eine Videokamera an der Decke des MWM-Geräts und verbinden Sie sie mit einem Videorecorder mit einem automatisierten Tracking-System, um die Daten zu sammeln.
   4. Teilen Sie den Wasserlabyrinthtank gleichmäßig in vier gleiche Regionen mit zwei sich gegenseitig senkrechten Linien, die nördlich (N), südlich (S), östlich (E) und westlich (W) beschriftet sind. Teilen Sie den Poolbereich konzeptionell in vier Quadranten gleicher Größe auf (NE, NW, SW und SE).
   5. Platzieren Sie in sichtweite Weise der Maus visuelle Hinweise unterschiedlicher Formen an der Wand jedes Quadranten als visuelle Referenzen (z. B. Quadrate, Dreiecke und Kreise).
      HINWEIS: Distale Hinweise sind die Navigationsreferenzpunkte des Tieres für die Suche nach der Plattform. Bewegen Sie sie daher während des Tests nicht. Die Position des Forschers ist ein potenzieller distaler Hinweis und kann den MWM beeinflussen. Daher sollte der Forscher a-gontieren aus den Augen der Mäuse bleiben, während er darauf wartet, dass das Tier den Test durchführt.
   6. Füllen Sie den kreisförmigen Tank mit Wasser bis zu einer Tiefe von 30 cm und halten Sie bei 22 x 2 °C mit einer elektrischen Heizung.
   7. Das Wasser mit ca. 150 g Milchpulver undurchsichtig machen.
2. Führen Sie die Testversion der sichtbaren Plattform durch.
   1. Legen Sie eine Kunststoff-Rundplattform (Durchmesser = 9,5 cm; Höhe = 28 cm) 1 cm über der Wasseroberfläche in jedem Quadranten nach dem Zufallsprinzip.
   2. Setzen Sie eine schwarze Flagge auf die Plattform.
   3. Lassen Sie jede Maus sanft in swassergewässeraus von einer der vier Startstellen zur Tankwand. Lassen Sie die Maus nicht ins Wasser fallen.
   4. Aktivieren Sie das Computer-Tracking-Programm, sobald die Maus ins Wasser freigesetzt wird.
   5. Geben Sie jeder Maus 60 s, um nach der Plattform zu suchen. Platzieren Sie am Ende jeder Testversion jede Maus auf der Plattform und lassen Sie sie 10 bis 30 s lang auf ihr bleiben.
   6. Beobachten Sie die Schwimmbahnen der Mäuse auf dem Computer, zeichnen Sie die Zeit auf, die die Maus benötigte, um die Plattform als Escape-Latenz zu finden, und analysieren Sie die Schwimmgeschwindigkeit.
   7. Trocknen Sie jede Maus mit Handtüchern und erwärmen Sie sie mit einer elektrischen Heizung. Achten Sie darauf, eine geeignete Wärmequelle zu verwenden, um eine Überhitzung des Tieres zu verhindern.
      HINWEIS: Platzieren Sie jede Maus in den Pool an jedem der vier verschiedenen Startquadranten für vier Versuche, wodurch die Plattform mit jeder nachfolgenden Testversion an einen anderen Ort bewegt wird. Das Intervall zwischen zwei Versuchen mit jeder Maus beträgt 15–20 min.
3. Führen Sie den Test für die versteckte Plattform-Test-/Ortnavigation durch.
   1. Platzieren Sie dieselbe Plattform ohne Flag im SE-Quadranten.
   2. Legen Sie die Maus zufällig in den Pool von jedem der vier Quadranten (NE, NW, SW, N) mit Blick auf die Poolwand für vier Versuche. Verwenden Sie ein Zeitintervall von 15 bis 20 min zwischen zwei Versuchen.
   3. Geben Sie jeder Maus 60 s, um nach der versteckten Plattform zu suchen.
   4. Zeichnen Sie die Escape-Latenz jeder Studie auf, nachdem die Maus zur weiteren Analyse auf die Plattform klettert.
   5. Trocknen Sie jede Maus mit Handtüchern und erwärmen Sie sie mit einer elektrischen Heizung.
      HINWEIS: Führen Sie die Testversion der versteckten Plattform ab den Tagen 2 bis 6 durch. Wenn die Maus die Plattform in 60 s nicht finden kann, führen Sie die Maus dazu, auf die Plattform zu klettern und sie am Ende jeder Testversion für 10 bis 30 s dort bleiben zu lassen. Führen Sie vier Versuche/Tag für jede Maus für 5 aufeinanderfolgende Tage durch, mit der Plattform und den visuellen Hinweisen an konstanten Positionen.
4. Führen Sie die Testprüfung durch.
   HINWEIS: Suchen Sie jede Maus im Pool an einer neuartigen Startposition, um die räumliche Explorationsfähigkeit der Maus zu beobachten.
   1. Entfernen Sie die Plattform.
   2. Finden Sie jede Maus mit Blick auf die Tankwand im Pool einmal für 60 s. Stellen Sie sicher, dass der Startort der NW Quadrant ist, der Quadrant am weitesten vom SE Quadranten entfernt ist.
   3. Zeichnen Sie die Schwimmdistanz, die Schwimmgeschwindigkeit und die Plattform-Crossover-Nummer im Labyrinth auf.
   4. Trocknen Sie jede Maus mit Handtüchern und sorgen Sie für Wärme nach der Testversion.
5. Führen Sie die Umkehrprüfung durch.
   HINWEIS: Führen Sie die Umkehrprüfung ab den Tagen 8 bis 11 durch.
   1. Positionieren Sie die Plattform in der Mitte des NW-Quadranten (anstelle des SE-Quadranten).
   2. Führen Sie die Schritte 5.3.2 bis 5.3.5 aus, wie im Abschnitt für die Testversion der versteckten Plattform beschrieben.

6. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie Statistiksoftware (z. B. SPSS 20.0), um die statistische Analyse durchzuführen.

Ergebnisse

Das Zeitachsendiagramm dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.

Abbildung 1: Zeitachsendiagramm des Studienprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Zeitachse zeigt, dass dieses Experiment insgesamt 21 Tage gedauert hat. Die Behandlung wurde während des gesamten Experiments auf die Maus angewendet und die MWM-Tests begannen nach 15 Tagen der Behandlung. Die sichtbare Plattform, versteckte Plattform, Sonde und Umkehrversuche wurden in der Reihenfolge durchgeführt.

Zuvor veröffentlichte Ergebnisse von Ding et al.⁵ werden als typische Ergebnisse von MWM Abbildung 2dargestellt.

Abbildung 2: Typische Ergebnisse des Morris-Wasserlabyrinthtests (n = 10). (A) Änderungen in der Fluchtlatenz und Schwimmgeschwindigkeit von Ratten zwischen den verschiedenen Gruppen in der sichtbaren Plattform-Studie. (B) Änderungen in der Fluchtlatenz von Ratten zwischen den verschiedenen Gruppen in der versteckten Plattform und Umkehrversuche. Die p-Werte sind *p < 0.05 und **p < 0.01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Das Symbol ' ' zeigt p < 0.01 im Vergleich zur AD-Gruppe an. (C) Änderungen der Plattform-Crossover-Nummer und der Prozentsatz der Zeit, die die Ratten im nordwestlichen Quadranten unter den verschiedenen Versuchsgruppen in der Sondenstudie aufgewendet haben. Die Ergebnisse der sichtbaren Plattform, der versteckten Plattform und der Umkehrstudie in jeder Gruppe werden angezeigt (n = 10, Mittelwert sD). Diese Zahl wurde von Ding et al⁵geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2A zeigt die Ergebnisse der sichtbaren Plattformstudie. Am ersten MWM-Tag wurden keine statistischen Unterschiede in der Fluchtlatenz oder schwimmgeschwindigkeit zwischen den Gruppen beobachtet. Abbildung 2B zeigt die Ergebnisse der versteckten Plattform- und Umkehrstudie aus den Tagen 2 bis 6 und der Tage 8 bis 11. Die Fluchtlatenz der AD-Gruppe blieb an jedem Testtag auf hohem Niveau. Die Fluchtlatenz der anderen drei Gruppen nahm allmählich ab. Die Escape-Latenz von den Tagen 3-6 und den Tagen 8-11 war in der AD-Gruppe länger als in der Kontrollgruppe (p < 0.01). Die Fluchtlatenzen von Mäusen in der MA- und Wirkstoffgruppe waren an den Tagen 2-6 bzw. 8-11 (p < 0,01) kürzer als die von Mäusen in der AD-Gruppe. Abbildung 2C zeigt die Ergebnisse der Probestudie. Die Plattform-Crossover-Anzahl von Mäusen in der AD-Gruppe war statistisch niedriger als in der Kontrollgruppe (p < 0,01). Die Plattform-Crossover-Nummer in der MA-Gruppe war höher als in der AD-Gruppe (p < 0.05). Der Anteil der Zeit, die Mäuse in der AD-Gruppe im SW-Quadranten verbrachten, war deutlich geringer als in der Kontrollgruppe (p < 0,01). Der Anteil der im SW-Quadranten in der MA-Gruppe verbrachten Zeit war höher als in der AD-Gruppe (p < 0,01).

Diskussion

Obwohl viele Wasserlabyrinthe, darunter das Bieler Wasserlabyrinth und das Wasserlabyrinth von Cincinnati, seit mindestens einem Jahrhundert bestehen, wurde nur das MWM weit verbreitet, um das räumliche Lernen und die Gedächtnisfähigkeit effektiv und objektiv zu bewerten, da es viele Vorteile⁹. Trotz umfangreicher Nutzung des MWM wurde das Verfahren nicht immer optimal eingesetzt. MWM-Experimente dauern in der Regel lange und werden von vielen variablen Faktoren beeinflusst. Es gibt einige effektive und zuverlässige Aspekte, die helfen, Veränderungen im räumlichen Lernen und Gedächtnisfähigkeit zu erkennen, die berücksichtigt werden sollten.

Es wurden vier verschiedene MWM-Versuche durchgeführt. Die sichtbare Plattform-Studie wurde am ersten Tag von MWM verwendet. Wenn die Tiere direkt auf die Plattform schwimmen konnten, deutete es darauf hin, dass die Schwimmfähigkeit und Vision der Tiere normal waren¹⁰. Otnass schlug vor, dass die Prüfung der sichtbaren Plattform zuerst durchgeführt werden sollte¹¹. Die Ergebnisse der "Sichtbaren Plattform-Studie" in dieser Studie bedeuteten, dass die vier Gruppen auf dem gleichen Lernniveau begannen. Von dort aus konnten die aufeinanderfolgenden Experimente gestartet werden. Die versteckte Plattform-Studie wurde verwendet, um die Fähigkeit der Mäuse zu bewerten, Lern- und Gedächtnisfähigkeiten zu erwerben. Der Probeversuch wurde am Tag 7, 24 h nach dem Ende des versteckten Plattformversuchs durchgeführt, um das Arbeitsgedächtnis zu bewerten. Schließlich wurde die Umkehrstudie verwendet, um arbeitsspeicher²zu bewerten. Die Veränderungen in den vier verschiedenen Studien von MWM zusammen zeigten, dass die AD-Modellmäuse geringe Lern- und Gedächtnisfähigkeit hatten und dass MA einen positiven Effekt auf AD⁵hatte.

Es gibt keine spezifischen Standards für die Abmessungen des Pools und der Plattform¹. In den meisten MWM-Studien wird ein Pool mit einem Durchmesser von 214 cm verwendet. Vorhees und Williams zeigten, dass Ratten mit identischen Protokollen in einem 122-cm-Pool schneller lernen als in einem 210-cm-Pool; die steile Steigung der Lernkurve zeigt an, dass das Pool mit 122 cm Durchmesser für Ratten extrem einfach zu navigieren ist¹². Im aktuellen Protokoll wurden unter Berücksichtigung des Alters und der schwachen Statur der AD-Mäuse ein 90-cm-Durchmesser-Pool und eine Plattform mit 9,5 cm Durchmesser verwendet. Die Ergebnisse der Vorversuche zeigten, dass Mäuse größere Schwierigkeiten hatten, die Plattform in einem Pool mit größerem Durchmesser zu finden. Daher stellen Tests in größeren Pools nicht den tatsächlichen Unterschied zwischen den Gruppen dar. Die Versuchstiere hatten es schwerer, die Plattform in einem größeren Pool mit einer kleineren Plattform⁴zu finden. Daher muss die Größe des Beckens und der Plattform in Vorversuchen entsprechend den experimentellen Anforderungen und dem Zustand der Versuchstiere optimiert werden.

Für die Durchführung des MWM-Tests⁴wird Wasser bei Temperaturen von 20 bis 24 °C empfohlen. Gealterte Versuchstiere schnitten in kaltem Wasser schlecht ab¹³, was auf einen deutlichen altersabhängigen Verlust der Thermoregulation¹⁴hindeutet. In dieser Studie wurde ein Thermostat am Boden des Pools platziert, um die Temperatur des Wassers bei 20–24 °C zu halten. Die Studienergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in den Schwimmgeschwindigkeiten zwischen den vier Gruppen⁵.

MWM ist eine leistungsfähige Technik zur Beurteilung der kognitiven Funktion und wird derzeit in Studien weit verbreitet. Es gibt jedoch keine definierte, standardeinheitliche, konsistente Ausrüstung, um den MWM-Test durchzuführen, einschließlich der Größen des Pools und der Plattform^15,16. Verschiedene Laboratorien haben unterschiedliche Spezifikationen für MWM. Daher wählen die Forscher das geeignete Versuchsgerät entsprechend ihren individuellen experimentellen Anforderungen aus, was zu Verwirrung unter den Forschern führen kann. Auch Vorversuche sind notwendig. Weitere Studien müssen an grundlegenden Experimenten wie MWM durchgeführt werden. Derzeit liegt die Flexibilität von MWM als experimentelles Werkzeug nur in der Fähigkeit, die Basisprotokolle entsprechend der geplanten Studie zu wählen. Daher kann dieser Test angewendet werden, um die kognitive Funktion in größerer Tiefe zu bewerten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
acupuncture needles	Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company	511526
desktop computer	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	Lenovo T4700D
Donepezil Hydrochloride Tablet	Eisai China	H20050978	Aricept
mice	Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science	SCXK2014-0003
Mirros water maze device	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	WMT-100S
mouse bags	home-made
Signal acquisition and processing system	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	BL-420N