Analisi della capacità di apprendimento e memoria in un modello di mouse malattia di Alzheimer utilizzando il Morris Water Maze

Riepilogo

Qui, viene descritto un protocollo per condurre i test del labirinto d'acqua Morris per valutare la capacità di apprendimento e la memoria dei topi modello di malattia di Alzheimer e per valutare l'effetto dell'agopuntura manuale per il trattamento di loro è descritto.

Abstract

Un esperimento del labirinto d'acqua (MWM) costringe gli animali sperimentali a nuotare e imparare a trovare una piattaforma nascosta nell'acqua. È ampiamente usato nella ricerca scientifica per valutare l'apprendimento e la memoria degli animali. A causa dell'ampio uso del test MWM, i protocolli sperimentali visivi sono essenziali per i ricercatori. Questo manoscritto utilizza gli ultimi studi per introdurre il protocollo del test MWM. La malattia di Alzheimer (AD) è caratterizzata da una progressiva perdita di memoria e funzione cognitiva. Un trattamento alternativo e complementare utilizzato per l'AD è l'agopuntura manuale (MA). Per valutare la capacità di apprendimento e memoria dei topi del modello AD, è stato condotto il test MWM. La prova della piattaforma visibile, la prova della piattaforma nascosta, la prova della sonda e la prova di inversione di MWM sono stati utilizzati per valutare l'apprendimento spaziale e la capacità di memoria. Nello studio della piattaforma visibile, la velocità di nuoto e la latenza di fuga dei topi in gruppi diversi non erano significativamente diverse. Nella piattaforma nascosta e nelle prove di inversione, il gruppo AD ha mostrato una lunga latenza di fuga. La latenza di fuga è diminuita in modo significativo dopo il trattamento MA. Basso numero di piattaforma crossover e la percentuale di tempo nel quadrante SW nella prova di sonda è aumentato dopo il trattamento MA (p < 0.05 o p < 0.01). I risultati dei test MWM suggeriscono che MA può migliorare efficacemente l'apprendimento spaziale e le capacità di memoria dei topi modello AD. Rigorose operazioni sperimentali hanno garantito l'affidabilità dei risultati.

Introduzione

Attualmente, l'esperimento MWM è diventato il più utilizzato e l'esperimento comportamentale standard per valutare l'apprendimento spaziale e la memoria degli animali¹. È stato inizialmente progettato dallo psicologo britannico Richard G. Morris ed è stato costantemente migliorato. Molti vantaggi come l'allenamento minimo, l'utilità tra specie, l'insensibilità alle differenze nel peso corporeo e la capacità di test ripetuti di MWM lo rendono il metodo migliore per valutare la funzione conoscitiva². Il morbo di Alzheimer (AD) è un grave problema medico, principalmente caratterizzato da un declino nell'elaborazione della memoria e nella funzione cognitiva³. MWM è un mezzo sperimentale indispensabile per valutare la capacità di apprendimento e memoria degli animali modello AD e l'efficacia dei metodi di intervento. Gli esperimenti MWM richiedono in genere molto tempo (6-11 giorni) e coinvolgono molti fattori variabili⁴. Anche se ci sono molti articoli sugli esperimenti di labirinto d'acqua, in pratica, i ricercatori mancano di un protocollo coerente. Pertanto, un video di processo protocollo intuitivo e rigoroso è particolarmente importante. Utilizzando un esperimento precedente come esempio⁵, vengono descritti tutti i passaggi di MWM. Utilizzando MWM, studi precedenti hanno suggerito che l'agopuntura potrebbe alleviare i sintomi dei topi modello AD^5,6,7.

Qui, il protocollo MWM utilizzato in un recente studio⁵ è descritto per fornire un metodo semplice e visibile per i ricercatori per valutare l'apprendimento spaziale e la memoria degli animali modello AD.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Università di Pechino di medicina cinese, ed era in conformità con tutte le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio della Cina. Non c'è stata alcuna situazione di morte accidentale durante la procedura sperimentale e nessun animale doveva essere eutanasia in questo studio.

1. Preparazione

1. Acquista 30 topi Maschi SAMP8 e 10 topi SAMR1 maschi (età: 8 mesi).
2. Alloggiare i topi singolarmente in gabbie di ventilazione individuali a una temperatura di 24 , 2 gradi centigradi e un ciclo scuro/chiaro di 12 h.
3. Nutrire i topi con una dieta a pellet standard disponibile ad libitum e fornire acqua potabile sterile.
4. Acclimatare tutti i topi all'ambiente per 5 giorni prima della sperimentazione.

2. Raggruppamento di animali

1. Dividi casualmente 30 topi SAMP8 in tre gruppi (n - 10/gruppo): il gruppo AD, il gruppo di agopuntura manuale (MA) e il gruppo di medicina (M).
2. Utilizzare 10 topi SAMR1 come gruppo di controllo normale (N)⁶.

3. Somministrazione di compresse di cloruro di donepezil

1. Schiacciare una compressa di cloridrica donepezil (5 mg/tablet) e scioglierla in 50 mL di acqua distillata.
2. Consegnare il medicinale preparato al punto 3.1 a dosi di 1 mg/kg ai topi utilizzando un gavage orale una volta al giorno⁸ durante l'intero esperimento, compresi i giorni in cui vengono eseguiti il trattamento MA e i test MWM.

4. Amministrazione dell'agopuntura manuale

1. Immobilizzare i topi del gruppo MA in sacchetti per topi.
2. Utilizzare aghi sterili monouso (0,25 mm x 13 mm) e applicare il metodo della spina piatta di MA su Baihui (GV20) e Yintang (GV29)⁵ verso il naso per 20 min. Assicurarsi che la profondità dell'ago sia di 0,2–0,3 cm.
3. Rotazione bidirezionale della manipolazione entro 90 gradi ad una velocità di circa 180 r/min ogni 5 min per 15 dollari ogni volta durante l'intero esperimento, compresi i giorni in cui vengono eseguiti il trattamento MA e i test MWM.

5. Test MWM

NOTA: A 24 h dopo i 15 giorni consecutivi di trattamento, sottoporre i topi nei quattro gruppi al test MWM. Condurre la prova della piattaforma visibile, la prova della piattaforma nascosta, la prova della sonda e la prova di inversione in ordine.

1. Prepararsi per il test MWM.
   1. Posizionare il dispositivo MWM e il sistema di acquisizione ed elaborazione del segnale in una sala sperimentale progettata per mantenere l'isolamento acustico.
   2. Mettere un serbatoio bianco circolare (diametro di 90 cm, altezza 50 cm) circondato da un panno opaco al centro del dispositivo MWM.
   3. Fissare una videocamera al soffitto del dispositivo MWM e collegarlo a un videoregistratore con un sistema di tracciamento automatizzato per raccogliere i dati.
   4. Dividere equamente il serbatoio del labirinto d'acqua in quattro regioni uguali utilizzando due linee reciprocamente perpendicolari, etichettate a nord (N), a sud (S), a est (E) e ad ovest (W). Dividere l'area della piscina concettualmente in quattro quadranti della stessa dimensione (NE, NW, SW e SE).
   5. All'interno del mouse, posizionare segnali visivi di forme diverse sulla parete di ogni quadrante come riferimenti visivi (ad esempio, quadrati, triangoli e cerchi).
      NOTA: i segnali di distale sono i punti di riferimento di navigazione dell'animale per localizzare la piattaforma. Pertanto, non spostarli durante il test. La posizione del ricercatore è un potenziale spunto distale e può influenzare il MWM. Pertanto, il ricercatore dovrebbe rimanere fuori dalla vista dei topi in attesa che l'animale esegua il test.
   6. Riempire il serbatoio circolare con acqua fino a una profondità di 30 cm e mantenerlo a 22 x 2 gradi centigradi con un riscaldatore elettrico.
   7. Rendere l'acqua opaca con circa 150 g di latte in polvere.
2. Eseguire la versione di prova della piattaforma visibile.
   1. Posizionare una piattaforma circolare in plastica (diametro di 9,5 cm; altezza 28 cm) 1 cm sopra la superficie dell'acqua in qualsiasi quadrante a caso.
   2. Metti una bandiera nera sulla piattaforma.
   3. Rilasciare delicatamente ogni topo in acqua a livello dell'acqua da una delle quattro posizioni di partenza che si affacciano sulla parete del serbatoio. Non far cadere il topo in acqua.
   4. Attivare il programma di tracciamento del computer non appena il mouse viene rilasciato in acqua.
   5. Dare ogni mouse 60 s per cercare la piattaforma. Alla fine di ogni prova, posizionare ogni mouse sulla piattaforma e consentirgli di rimanere su di esso per 10-30 s.
   6. Osservare le traiettorie di nuoto dei topi sul computer, registrare il tempo impiegato dal mouse per trovare la piattaforma come latenza di fuga e analizzare la velocità di nuoto.
   7. Asciugare ogni mouse con gli asciugamani e riscaldarlo con un riscaldatore elettrico. Assicurarsi di utilizzare una fonte di calore appropriata per evitare che l'animale si surriscaldi.
      NOTA: Posizionare ogni mouse nella piscina in ciascuno dei quattro diversi quadranti di partenza per quattro prove, spostando la piattaforma in una posizione diversa con ogni prova successiva. L'intervallo tra due prove che utilizzano ogni mouse è 15-20 min.
3. Eseguire il test di prova/destinazione della piattaforma nascosta.
   1. Posizionare la stessa piattaforma senza una bandiera nel quadrante SE.
   2. Posizionare casualmente il mouse nella piscina da ciascuno dei quattro quadranti (NE, NW, SW, N) di fronte alla parete della piscina per quattro prove. Utilizzare un intervallo di tempo di 15-20 min tra due prove.
   3. Dare ogni mouse 60 s per cercare la piattaforma nascosta.
   4. Registrare la latenza di fuga di ogni prova dopo che il mouse sale fino alla piattaforma per analisi successive.
   5. Asciugare ogni mouse con gli asciugamani e riscaldarlo con un riscaldatore elettrico.
      NOTA: Conduci la prova nascosta della piattaforma dai giorni 2/6. Se il mouse non riesce a trovare la piattaforma in 60 s, portare il mouse a salire fino alla piattaforma e permettergli di rimanere lì per 10-30 s alla fine di ogni prova. Esegui quattro prove al giorno per ogni mouse per 5 giorni consecutivi, con la piattaforma e i segnali visivi in posizioni costanti.
4. Eseguire la prova della sonda.
   NOTA: Individuare ogni mouse nella piscina in una nuova posizione iniziale per osservare la capacità di esplorazione spaziale del mouse.
   1. Rimuovere la piattaforma.
   2. Individuare ogni mouse rivolto verso la parete del serbatoio nella piscina una volta per 60 s. Assicurarsi che la posizione di partenza è il quadrante NW, che è il quadrante più lontano dal quadrante SE.
   3. Registrare la distanza di nuoto, la velocità di nuoto, e il numero di crossover piattaforma nel labirinto.
   4. Asciugare ogni mouse con gli asciugamani e fornire calore dopo la prova.
5. Eseguire la prova di inversione.
   NOTA: Eseguire la prova di inversione a partire dai giorni 8-11.
   1. Posizionare la piattaforma al centro del quadrante NW (invece del quadrante SE).
   2. Seguire i passaggi 5.3.2 : 5.3.5 come descritto nella sezione relativa alla versione di valutazione della piattaforma nascosta.

6. Analisi statistiche

1. Utilizzare il software di statistica (ad esempio, SPSS 20.0) per eseguire l'analisi statistica.

Risultati

Il diagramma dell'asse temporale di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.

Figura 1: Diagramma dell'asse temporale del protocollo di studio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'asse temporale mostra che questo esperimento è durato per un totale di 21 giorni. Il trattamento è stato applicato al topo durante l'intero esperimento e i test MWM sono iniziati dopo 15 giorni di trattamento. La piattaforma visibile, piattaforma nascosta, sonda, e prove di inversione sono stati condotti in ordine.

I risultati pubblicati in precedenza da Ding et al.⁵ sono presentati come risultati tipici di MWM Figura 2.

Figura 2: Risultati tipici del test del labirinto d'acqua Morris (n - 10). (A) Cambiamenti nella latenza di fuga e la velocità di nuoto dei ratti tra i diversi gruppi nella prova piattaforma visibile. (B) Cambiamenti nella latenza di fuga dei ratti tra i diversi gruppi nella piattaforma nascosta e prove di inversione. I valori di p sono i valori di p < 0,05 e di z < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Il simbolo " s indica p < 0.01 rispetto al gruppo AD. (C) Cambiamenti nel numero di crossover della piattaforma e la percentuale del tempo trascorso dai ratti nel quadrante nord-ovest tra i diversi gruppi sperimentali nella prova di sonda. Vengono visualizzati i risultati della piattaforma visibile, della piattaforma nascosta e della prova di inversione in ogni gruppo (n - 10, media - SD). Questa cifra è stata modificata da Ding et al⁵. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2A Mostra i risultati della prova della piattaforma visibile. Non sono state osservate differenze statistiche nella latenza di fuga o nella velocità di nuoto tra i gruppi il primo giorno di MWM. La figura 2B mostra i risultati della piattaforma nascosta e lo studio di inversione dei giorni 2/6 e dei giorni 8-11. La latenza di escape del gruppo AD è rimasta a un livello elevato in ogni giorno del test. La latenza di fuga degli altri tre gruppi è diminuita gradualmente. La latenza di fuga dei giorni 3-6 e dei giorni 8-11 era più lunga nel gruppo AD che nel gruppo di controllo (p < 0,01). Le latenze di fuga dei topi nei gruppi MA e dei gruppi di farmaci erano più brevi di quelle dei topi del gruppo AD nei giorni 2/6 e i giorni 8-11, rispettivamente (p < 0,01). La figura 2C mostra i risultati della prova della sonda. Il numero di mouse di piattaforma crossover di mouse nel gruppo AD è stato statisticamente inferiore a quello del gruppo di controllo (p < 0.01). Il numero di platform crossover nel gruppo MA era superiore a quello del gruppo AD (p < 0.05). La percentuale di tempo trascorso nel quadrante SW dai mouse nel gruppo AD era significativamente inferiore a quella del gruppo di controllo (p < 0,01). La percentuale di tempo trascorso nel quadrante SW nel gruppo MA era superiore a quella del gruppo AD (p < 0,01).

Discussione

Anche se molti labirinti d'acqua, tra cui il labirinto d'acqua di Biel e il labirinto d'acqua di Cincinnati, sono in giro da almeno un secolo, solo la MWM è stata ampiamente utilizzata per valutare in modo efficace e oggettivo l'apprendimento spaziale e la capacità di memoria perché ha molti vantaggi⁹. Nonostante l'ampio uso del MWM, la procedura non è sempre stata utilizzata in modo ottimale. Gli esperimenti MWM in genere richiedono molto tempo e sono influenzati da molti fattori variabili. Ci sono alcuni aspetti efficaci e affidabili che aiutano a rilevare i cambiamenti nell'apprendimento spaziale e capacità di memoria che dovrebbero essere presi in considerazione.

Sono state eseguite quattro diverse prove MWM. La prova della piattaforma visibile è stata utilizzata il giorno 1 di MWM. Se gli animali potevano nuotare direttamente alla piattaforma, indicava che la capacità di nuoto e la visione degli animali erano normali¹⁰. Otnass ha suggerito che lo studio della piattaforma visibile dovrebbe essere condotto prima¹¹. I risultati dello studio sulla piattaforma visibile in questo studio hanno fatto sì che i quattro gruppi iniziassero allo stesso livello di apprendimento. Da lì, gli esperimenti successivi potrebbero essere avviati. Lo studio della piattaforma nascosta è stato utilizzato per valutare la capacità dei topi di acquisire capacità di apprendimento e memoria. La prova di sonda è stata condotta il giorno 7, 24 h dopo la fine dello studio piattaforma nascosta, per valutare la memoria di lavoro. Infine, la prova di inversione è stata utilizzata per valutare la memoria di lavoro². I cambiamenti nelle quattro diverse prove di MWM insieme indicato che i topi modello AD avevano scarsa capacità di apprendimento e memoria e che MA ha avuto un effetto positivo su AD⁵.

Non ci sono standard specifici per le dimensioni della piscina e della piattaforma¹. Una piscina di 214 cm di diametro è utilizzata nella maggior parte degli studi MWM. Vorhees e Williams hanno dimostrato che con protocolli identici, i ratti imparano più velocemente in una piscina di 122 cm che in una piscina di 210 cm; la pendenza ripida della curva di apprendimento indica che la piscina di 122 cm di diametro è estremamente facile per i ratti di navigare¹². Nel protocollo attuale, considerando la vecchiaia e la bassa statura dei topi AD, sono stati utilizzati una piscina di 90 cm di diametro e una piattaforma di diametro di 9,5 cm. I risultati degli esperimenti preliminari hanno indicato che i topi avevano maggiori difficoltà a trovare la piattaforma in una piscina di diametro più grande. Pertanto, i test in pool più grandi non rappresentano la vera differenza tra i gruppi. Gli animali sperimentali hanno avuto un tempo più difficile trovare la piattaforma in una piscina più grande con una piattaforma più piccola⁴. Pertanto, le dimensioni del pool e della piattaforma devono essere ottimizzate in esperimenti preliminari in base ai requisiti sperimentali e alle condizioni degli animali sperimentali.

Per l'esecuzione del test MWM⁴si raccomanda di utilizzare l'acqua a temperatura compresa tra i 20 e i 24 gradi centigradi. Gli animali sperimentali invecchiati hanno ottenuto scarse prestazioni in acqua fredda¹³, indicando una chiara perdita di termoregolazione dipendente dall'età¹⁴. In questo studio, un termostato è stato posto sul fondo della piscina per mantenere la temperatura dell'acqua a 20-24 gradi centigradi. I risultati dello studio non hanno mostrato differenze significative nella velocità di nuoto tra i quattro gruppi⁵.

MWM è una tecnica potente per valutare la funzione conoscitiva ed è ampiamente utilizzato negli studi attualmente. Tuttavia, non esistono attrezzature definite, standard e coerenti per eseguire il test MWM, incluse le dimensioni della piscina e della piattaforma^15,16. Laboratori diversi hanno specifiche diverse per MWM. Pertanto, i ricercatori scelgono il dispositivo sperimentale appropriato in base alle loro esigenze sperimentali individuali, che possono causare confusione tra i ricercatori. Sono necessari anche esperimenti preliminari. Ulteriori studi devono essere condotti su esperimenti di base come MWM. Attualmente, la flessibilità di MWM come strumento sperimentale risiede solo nella capacità di scegliere i protocolli di base secondo lo studio scopo. Pertanto, questo test può essere applicato per valutare la funzione conoscitiva in maggiore profondità.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
acupuncture needles	Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company	511526
desktop computer	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	Lenovo T4700D
Donepezil Hydrochloride Tablet	Eisai China	H20050978	Aricept
mice	Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science	SCXK2014-0003
Mirros water maze device	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	WMT-100S
mouse bags	home-made
Signal acquisition and processing system	Chengdu Techman Software Limited Liability Company	BL-420N