Aislamiento de intact eyeball para obtener tejido superficial ocular integral para el examen histológico y la inmunohistoquímica

Resumen

Este protocolo describe un método para el aislamiento del globo ocular del ratón con los segmentos del párpado, la superficie ocular, la anterior y la posterior en posición relativamente intacta.

Resumen

La superficie ocular (SA) consiste en una lámina epitelial con tres partes conectadas: conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar y epitelio corneal. La interrupción del sistema operativo conduciría a queratitis, conjuntivitis o ambos (queratoconjuntivitis). En modelos animales experimentales con ciertas modificaciones genéticas u operaciones artificiales, es útil examinar todas las partes de la hoja epitelial del sistema operativo para evaluar los cambios patogenéticos relativos de cada parte en paralelo. Sin embargo, la disección del tejido del sistema operativo en su conjunto sin distorsión o daño ha sido difícil, principalmente debido a la suavidad y delgadez del sistema operativo fijado para separar físicamente los párpados y el globo ocular. Además, la cavidad ocular profunda formada por el cráneo duro /huesos orbitales está completamente ocupada por el globo ocular dejando espacio limitado para operar disecciones. Como resultado, la disección directa del globo ocular con los tejidos asociados del sistema operativo desde el lado facial a menudo conduciría a daños tisulares, especialmente la conjuntiva palpebral y bulbar. En este protocolo, describimos un método para extraer el cráneo y los huesos orbitales secuencialmente de una cabeza de ratón biseced, dejando los párpados, la superficie ocular, la lente y la retina en una sola pieza. La integridad de la hoja del sistema operativo estaba bien preservada y podía ser examinada por histología o inmunomanchación en una sola sección.

Introducción

La superficie ocular consiste en una lámina continua de epitelio regionalizado incluyendo conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar y córnea¹. Muchas estructuras glandulares están asociadas con el epitelio de la superficie ocular y juntos generan una capa de película lagrimal que protege la superficie de la córnea del secado y las invasiones ambientales². La interrupción del sistema operativo conduciría a queratitis, conjuntivitis o ambos (queratoconjuntivitis). Tanto los factores genéticos como los irritantes ambientales o sus interacciones contribuyen a alteraciones patológicas del OS^3,4. En consecuencia, una variedad de modelos animales genéticamente diseñados y inducidos física o químicamente se han utilizado para estudiar los procesos de enfermedad del sistema operativo humano.

La estructura y función del sistema operativo del ratón es similar a la de los seres humanos de muchas maneras. Los componentes de la película lagrimal secretados por las glándulas oculares también son similares entre ratones y humanos. Se han realizado una gran cantidad de estudios utilizando modelos de ratón para dilucidar mecanismos de enfermedades del sistema operativo humano^5,6,7. En muchas ocasiones, es fundamental analizar los cambios moleculares globales en lugar de los cambios moleculares locales del sistema operativo para obtener información completa bajo el mismo tratamiento experimental. Por lo tanto, se necesita una preparación de la muestra con buena integridad para garantizar que cada parte del sistema operativo se analice simultáneamente.

El sistema operativo del ratón se asocia firmemente con el globo ocular que estaba incrustado en la cavidad del ojo / órbita (una taza ósea hecha de varios huesos del cráneo diferentes) y se conecta a él a través de los tejidos conectivos delgados. Existen enormes desafíos para disecar toda la superficie ocular sin dañar la conjuntiva palpebral o bulbar. Estos desafíos descienden de: (i) el sistema operativo es suave y delgado y se fija a los párpados y el globo ocular físicamente separados pero móviles, por lo tanto vulnerables a la distorsión y el daño; y (ii) el espacio limitado entre los huesos orbitales y el globo ocular restringen las operaciones de disección. Los desafíos son mucho mayores para el ratón adulto. En el ratón embrionario, la osificación ósea orbital no está completa y los tejidos circundantes son relativos sueltos^8. La cabeza se puede quitar y bisecar, y luego directamente sometido a la fijación de paraformaldehído (PFA) e incrustar⁹. Por el contrario, los huesos orbitales postnatales y adultos del ratón están completamente osificados con tejidos circundantes gruesos, haciendo que la penetración de fijadores sea menos eficiente. Además, los huesos orbitales/cráneos son duros y quebradizos, fácilmente rotos al seccionarlos en los compuestos de incrustación suave como la parafina. Los trozos rotos de huesos desgarrarán unánimemente los tejidos cercanos, lo que resulta en una morfología de tejido inferior.

Muchos estudios publicados a menudo mostraron superficie ocular parcial, que puede ser suficiente para sus propósitos particulares de investigación^10,11. Un examen bruto de las literaturas encontró sólo unos pocos estudios que muestran toda la superficie ocular intacta que se ha demostrado sin una descripción detallada de los protocolos de disección^12,13. En este protocolo, detallamos un método de disección para obtener la superficie ocular postnatal integral, en la que los huesos orbitales y del cráneo fueron eliminados ordenadamente, dejando la superficie ocular intacta junto con el globo ocular y los párpados, minimizando los daños físicos. Examinamos más a fondo la histología del sistema operativo y realizamos inmunohistoquímica utilizando las secciones de tejido preparadas con este protocolo.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con el uso de ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales, Centro Oftalmológico Zhongshan, y se adhirieron a la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftalmológica y de Visión.

1. Disección del globo ocular con superficie ocular intacta y párpados

1. Disecciona la cabeza.
   1. Eutanasia ratones del día postnatal 10 (P10) y P28 (ver la Tabla de Materiales para las cepas de ratón) por luxación cervical, corta la cabeza del cuello con un par de tijeras afiladas.
   2. Cabezal de bisecta con un par de tijeras rectas a lo largo de la línea media sagital comenzando en el hueso interparietal rostrally a la nariz(Figura 1A,B).
      NOTA: El hueso del cráneo se endurece con el envejecimiento del ratón, tenga cuidado de mantener las tijeras cortando a lo largo de la línea media tanto como sea posible.
   3. Coloque cada mitad de la cabeza bisecada en un plato limpio de Petri, corte primero la mandíbula y la lengua usando tijeras afiladas. Libera el nervio óptico cortando el cerebro antes de la ubicación del quiasmo óptico, y elimina todos los tejidos cerebrales, incluyendo bulbo olfativo unido a la pared del cráneo.
   4. Ahora los tejidos restantes tendrán todos los huesos cráneo/orbital asociados con el globo ocular(Figura 1C,D). Lave la parte restante con PBS para limpiar la sangre y los desechos del cabello.
   5. Prefije los tejidos con 4% de paraformaldehído (PFA, en solución salina con fosfato almacenado en fosfato [PBS], pH 7.4) en un tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente (RT) con rotación. El tiempo aproximado de fijación es el siguiente: 10 min para P0 a P7; 20 min para P8 a P28; y 30 min para P29 y mayores.
      NOTA: El prefijo ofrece rigidez tisular facilitando la disección subsiguiente. Además, la prefijo evita dejar el tejido fresco sin fijar demasiado tiempo antes de que se complete la disección.
      ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado.
2. Retire el cráneo/huesos orbitales.
   1. Después de la prefijo, lave rápidamente la cabeza diseccionada en PBS tres veces para eliminar aún más los pelos rotos y fijadores con el fin de proceder con la disección adicional.
      ADVERTENCIA: La exposición a fijadores durante la disección puede ser perjudicial para la salud.
   2. Coloque el tejido en la placa Petri de 10 cm, corte el cráneo en tres partes a lo largo de los planos indicados en la Figura 1D,E. El globo ocular en la cavidad está oculto en la parte media del cráneo bajo huesos etodotidos, frontales y maxilares(Figura 1D,E).
   3. Utilice dos pares de fórceps rectos No. 4 para despegar el hueso etodoide para exponer completamente los huesos frontales y maxilares(Figura 1F).
   4. Divida geográficamente la superficie del cráneo (incluidos los huesos maxilares y frontales) en 4 áreas(Figura 1F). Inserte la punta de los fórceps curvos horizontalmente en cada área para eliminar secuencialmente los huesos maxilar y frontal(Figura 1F).
      NOTA: Los huesos maxilares no se pueden quitar todos a la vez. Diseccionarlos pacientemente pieza por pieza. El hueso frontal está conectado directamente al globo ocular a través de tejidos conectivos blandos. Tenga cuidado al extraerlo del globo ocular para evitar que se estire el globo ocular y dañe la conjuntiva.
   5. Después de la eliminación del hueso maxilar parcial y todo el hueso frontal, los huesos lagrimales y yugales subyacentes estarían expuestos(Figura 1G). Retire los dos huesos y los músculos subcutáneos asociados y las grasas que rodean el globo ocular, recorte el globo ocular con los párpados unidos y la piel en un pequeño bloque de forma cuadrada para reducir el volumen del tejido y facilitar la orientación del tejido al incrustar(Figura 1 H).
   6. Coloque el globo ocular y los tejidos asociados de nuevo en 4% de PFA y continúe reparando durante la noche a 4 oC. El tejido fijo se puede conservar durante al menos un mes a 4 oC en PBS con adición de 0,02% NaN₃. Alternativamente, proceda al análisis histológico inmediatamente.
      NOTA: Si el tejido necesita ser almacenado durante períodos más largos, se puede almacenar fácilmente en 70% etanol.

2. Análisis histológico

1. Sección de parafina y tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
   1. Siga el protocolo estándar descrito en otro lugar⁹ para realizar la incrustación y seccionamiento de parafina.
2. Inmunohistoquímica (IHC)
   1. Dewax las secciones de parafina con xileno y rehidratar las secciones a través de series de alcohol (100%, 95%, 80%) en agua destilada (dH₂O).
   2. Realizar la recuperación de antígenos mediante el tratamiento por microondas de los portaobjetos de tejido en un tampón de ácido cítrico de 0,01 M (3 g de citrato de trisódico, 0,4 g de ácido cítrico por 1 L de doble destilado H₂O) en un frasco deslizante de vidrio con baja potencia (120 W). La energía debe entregarse intermitentemente durante un total de 5-10 minutos con cada intervalo que dura aproximadamente 2 min.
      NOTA: El microondas de alta potencia o el calentamiento constante conducirían a la desprendimiento de secciones de tejido de la diapositiva.
   3. Escoja los portaobjetos del frasco de vidrio, limpie cuidadosamente el líquido residual que rodea cada sección usando tejidos faciales y colóquelos en el portaobjetos en una caja de histología. Dibuja un cuadrado alrededor de cada sección con un bolígrafo histológico impermeable. Coloque 100 sL de tampón de bloqueo (0,1% triton X-100 y 10% de suero de burro en 1x PBS) en cada cuadrado, e incubar durante 30 minutos en RT.
   4. Retire cuidadosamente la solución de bloqueo con vacío, añada el anticuerpo primario (ver la Tabla de Materiales)con la dilución deseada en el tampón de bloqueo y continúe incubando las diapositivas a 4oC durante 24 h o más.
      NOTA: La concentración de cada anticuerpo primario utilizado para IHC varía y debe probarse en experimentos piloto.
   5. Lave los portaobjetos con PBST (0,1% Tritón en PBS) tres veces, durante 10 minutos cada uno. Repita el paso 2.2.4 utilizando el anticuerpo secundario (ver Tabla de Materiales)junto con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) reemplazando el tampón de bloqueo. Continúe incubando durante al menos 4 h o más a temperatura ambiente (RT).
   6. Retire el anticuerpo secundario, lave las secciones de tejido con la solución PBST tres veces, durante 10 minutos cada una, luego lave con PBS limpio durante otros 5 minutos.
   7. Limpie las secciones residuales de tejido circundante súbditos de PBS, monte los cubreobjetos en las secciones con el medio de montaje. Realizar microscopía fluorescente para obtener imágenes (ver la Tabla de Materiales).

Resultados

Los huesos principales del cráneo vistos desde diferentes perspectivas fueron ilustrados en la Figura 1A-E,con colores que denotan diferentes huesos. Usamos animales de cuatro semanas para la demostración de los procesos de disección. Siguiendo los pasos de disección 1.1.1-1.1.3 y una breve prefijoación (paso 1.1.4), el globo ocular con los huesos faciales asociados se muestran en la Figura 1E

Discusión

Un recordatorio crítico para la preparación del globo ocular intacto es que todos los huesos orbitales deben ser eliminados por completo, especialmente los huesos juga y lagrimal, que son pequeños y se encuentran cerca de la parte inferior de la cavidad ocular. Cualquier hueso sobrante puede complicar la histología subsiguiente. En caso de que un pequeño trozo de hueso no se haya eliminado por completo de la disección por accidente, puede ser recogido del bloque de parafina de incrustación utilizando un par de pin...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01
50ml centrifuge tube	Corning	430829
Adhesive microscope slides	Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Suggested concentration 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Suggested concentration 1:500 - 1,000
Anti-K12 antibody	Abcam	ab124975	Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody	Abcam	ab7800	Suggested concentration 1:800
Citric acid	Various
Cover slide	Various
Curved forceps	World Precision Instruments	14127
Dissecting microscope.	Olmpus	SZ61
Ethyl alcohol	Various
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242
Microwave ovens	Galanz	P70D20TL-D4
Mouse strains	C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6
Normal Goat Serum	Various
Paraformaldehyde (PFA)	Various		Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish	Various
Trisodium citrate	Various
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818