Histolojik Muayene ve İmmünohistokimya için İntegral Göz Yüzey Dokusu Elde Etmek Için Bozulmamış Göz Küresinin İzolasyon

Özet

Bu protokol, fare göz küresinin göz kapağı, göz yüzeyi, anterior ve posterior segmentleri ile nispeten sağlam konumda izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Oküler yüzey (OS) üç bağlı parçadan oluşan bir epitel levhaoluşur: palpebral konjonktiva, bulbar konjonktiva ve kornea epitel. OS bozulması keratit yol açacak, konjonktivit veya her ikisi (keratokonjonktivit). Belirli genetik modifikasyonlara veya yapay operasyonlara sahip deneysel hayvan modellerinde, her bir parçanın göreceli patogenetik değişikliklerini paralel olarak değerlendirmek için OS epitel sayfasının tüm bölümlerini incelemek yararlıdır. Ancak, distorsiyon veya hasar olmadan bir bütün olarak OS doku diseksiyon, öncelikle yumuşaklık ve os incelik nedeniyle fiziksel olarak ayrı henüz hareketli göz kapakları ve göz küresi yapıştırılmış nedeniyle zor olmuştur. Ayrıca, sert kafatası / orbital kemikler tarafından oluşturulan derin göz soketi tamamen çalışma diseksiyonları için sınırlı alan bırakarak göz küresi tarafından işgal edilir. Sonuç olarak, yüz tarafında ilişkili OS dokuları ile göz küresi doğrudan diseksiyon genellikle doku hasarlarına yol açacak, özellikle palpebral ve bulbar konjonktiva. Bu protokolde, kafatası ve yörünge kemiklerini iki parçalı fare başından sırayla çıkarmak için bir yöntem tanımlanmış, göz kapakları, göz yüzeyi, lens ve retinayı tek parça halinde bırakılmıştır. OS sayfasının bütünlüğü iyi korunmuştur ve histoloji veya immünboyama ile tek bir bölümde incelenebilir.

Giriş

Oküler yüzey palpebral konjonktiva, bulbar konjonktiva ve kornea¹dahil olmak üzere bölgesel epitel sürekli bir levha oluşur. Birçok glandüler yapılar oküler yüzey epitel ile ilişkilidir ve birlikte kuruyan ve çevresel istilalar kornea yüzeyini koruyan gözyaşı film bir tabaka oluşturmak². OS bozulması keratit yol açacak, konjonktivit veya her ikisi (keratokonjonktivit). Hem genetik faktörler hem de çevresel tahriş edici maddeler ya da etkileşimleri OS^3,4'ünpatolojik değişikliklerine katkıda bulunur. Buna göre, insan işletim sistemi hastalık süreçlerini incelemek için çeşitli genetiği değiştirilmiş ve fiziksel veya kimyasal kaynaklı hayvan modelleri kullanılmıştır.

Fare işletim sistemi yapısı ve işlevi birçok yönden insanların ki benzer. Göz bezleri tarafından salgılanan gözyaşı filmi bileşenleri de fareler ve insanlar arasında benzer. Çalışmalar zenginliği insan işletim sistemi^{hastalıklarının}mekanizmaları açıklığa kavuşturucu için fare modelleri kullanılarak yapılmıştır 5^,6,7. Birçok durumda, aynı deneysel tedavi altında kapsamlı bilgi elde etmek için işletim sistemi yerel moleküler değişiklikler yerine küresel analiz etmek önemlidir. Bu nedenle, işletim sistemi her parçası aynı anda analiz edilmesini sağlamak için iyi bir bütünlük ile örnek hazırlanması gereklidir.

Fare OS sıkıca göz çukuru / yörünge (birkaç farklı kafatası kemikleri yapılmış kemikli bir fincan) gömülü ve ince bağ dokuları ile bağlanır göz küresi ile ilişkilendirir. Palpebral veya bulbar konjonktiva zarar vermeden tüm oküler yüzeyi diseksiyon için büyük zorluklar var. Bu zorluklar aşağıdakilerden kaynaklanır: (i) işletim sistemi yumuşak ve incedir ve fiziksel olarak ayrı ama taşınabilir göz kapakları ve göz küresi için yapıştırılmış, bu nedenle bozulma ve hasara karşı savunmasızdır; ve (ii) orbital kemikler ve göz küresi arasındaki sınırlı boşluk diseksiyon operasyonlarını kısıtlar. Zorluklar yetişkin fare için çok daha büyüktür. Embriyonik farede orbital kemik kemikleşme tamamlanmaz ve çevre dokular göreceli gevşek⁸. Baş çıkarılabilir ve ikiye bölünebilir ve daha sonra doğrudan paraformaldehit (PFA) fiksasyona tabi tutulabilir ve^9. Buna karşılık, postnatal ve yetişkin fare orbital kemikleri tamamen kalın çevre dokuları ile kemiklenir, fiksatifpene daha az verimli hale. Ayrıca, orbital / kafatası kemikleri sert ve kırılgan, kolayca parafin gibi yumuşak katıştırma bileşikleri onları kesit zaman kırık. Kırık kemik parçaları oybirliğiyle inferior doku morfolojisi ile sonuçlanan yakındaki dokuları gözyaşı olacaktır.

Birçok yayınlanan çalışmalar genellikle kısmi oküler yüzey gösterdi, hangi kendi özel araştırma amaçları için yeterli olabilir^10,11. Literatür brüt bir inceleme diseksiyon protokolleri^12,13ayrıntılı açıklaması olmadan gösterilen tüm bozulmamış oküler yüzey gösteren sadece birkaç çalışma bulundu . Bu protokolde, orbital ve kafatası kemiklerinin düzenli olarak çıkarıldığı, göz küresi ve göz kapakları ile birlikte el değmemiş göz yüzeyinin bırakılarak fiziksel hasarları en aza indirdiği integral postnatal göz yüzeyini elde etmek için bir diseksiyon yöntemi ayrıntılı olarak incelenmiştir. Os histolojisini daha detaylı olarak inceledik ve bu protokol ile hazırlanan doku kesitlerini kullanarak immünohistokimya uyguladık.

Protokol

Farelerin kullanımı ile ilgili tüm prosedürler Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, Zhongshan Oftalmic Merkezi tarafından onaylandı ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'ne bağlı.

1. Göz küresinin sağlam göz yüzeyi ve göz kapakları ile diseksiyonu

1. Kafasını kes.
   1. Ötanazi sonrası gün 10 (P10) ve P28 fareler (fare suşları için Malzemeler Tablosu bakınız) servikal çıkış tarafından, keskin makas bir çift tarafından boyun kapalı baş kesti.
   2. Buruna interparietal kemik rostrally başlayan sagittal orta hat boyunca düz makas bir çift ile bisect baş (Şekil 1A,B).
      NOT: Kafatası kemiği fare yaşlanma ile sertleşir, mümkün olduğunca orta hat boyunca kesme makas tutmak için dikkatli olun.
   3. Temiz bir Petri kabına ikiye bölünmüş baş Her yarısı yerleştirin, çene ve dil ilk keskin makas kullanarak kesti. Optik kiazma yeri önce beyin keserek optik sinir serbest, ve kafatası duvarına bağlı koku ampul dahil olmak üzere tüm beyin dokuları kaldırın.
   4. Şimdi kalan dokular göz küresi ile ilişkili tüm kafatası / orbital kemikler e sahip olacaktır (Şekil 1C,D). Kan ve saç enkaz temizlemek için PBS ile kalan kısmı yıkayın.
   5. Oda sıcaklığında (RT) 50 mL konik tüpte %4 paraformaldehit (PFA, fosfat tamponlu salin [PBS], pH 7.4) ile önek dokular. Yaklaşık fiksasyon süresi aşağıdaki gibidir: ~10 dk P0 için P7; ~ 20 dk P8 p28 için; ve ~ 30 min P29 ve daha büyük için.
      NOT: Önekasyon, doku sertliği sunarak sonraki diseksiyonu kolaylaştırır. Ayrıca, önekasyon diseksiyon tamamlanmadan önce çok uzun süre taze doku unfixed bırakarak önler.
      DİkKAT: PFA tehlikelidir ve dikkatli kullanılmalıdır.
2. Kafatası/orbital kemikleri çıkarın.
   1. Önekasyondan sonra, daha fazla diseksiyona devam etmek için kırık kılları ve fiksatifleri ortadan kaldırmak için pbs'de parçalanmış başı üç kez hızlıca yıkayın.
      DİkKAT: Diseksiyon sırasında fiksatiflere maruz kalmak sağlığa zararlı olabilir.
   2. 10 cm Petri çanak doku yerleştirin, Şekil 1D, Ebelirtilen düzlemler boyunca üç parçaya kafatası kesti. Soketteki göz küresi etmoid, frontal ve maksiller kemiklerin altında kafatasının orta kısmında gizlidir(Şekil 1D,E).
   3. Frontal ve maksiller kemikleri tamamen ortaya çıkarmak için etmoid kemiği soymak için 4 numaralı düz forceps iki çift kullanın(Şekil 1F).
   4. Coğrafi olarak kafatası yüzeyini (maksiller ve frontal kemikler dahil) 4 alana(Şekil 1F)bölün. Maksiller ve frontal kemikleri sırayla çıkarmak için eğri forceps ucunu yatay olarak her alana yerleştirin (Şekil 1F).
      NOT: Maksiller kemiklerin hepsi aynı anda çıkarılamaz. Sabırla parça parça inceleyin. Frontal kemik doğrudan yumuşak bağ dokuları aracılığıyla göz küresine bağlıdır. Göz küresini germeve konjonktivaya zarar vermesini önlemek için göz küresinden çıkarırken dikkatli olun.
   5. Kısmi maksiller kemik ve tüm frontal kemik çıkarıldıktan sonra altta yatan lakrimal ve jugal kemikler ortaya çıkar (Şekil 1G). İki kemiği ve göz küresini çevreleyen ilişkili deri altı kasları ve yağları çıkarın, doku hacmini azaltmak ve katıştırma yaparken dokuyu yönlendirmeyi kolaylaştırmak için ekli göz kapakları ve deri ile göz küresini küçük bir kare şeklinde ki bloğa bökmek (Şekil 1 H).
   6. Göz küresini ve ilişkili dokuları %4 PFA'ya geri yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de düzeltmeye devam edin. Sabit doku% 0.02 NaN₃ilave si ile PBS 4 ° C en az bir ay boyunca korunabilir. Alternatif olarak, hemen histolojik analize geçin.
      NOT: Doku daha uzun süre saklanması gerekiyorsa, kolayca% 70 etanol saklanabilir.

2. Histolojik analiz

1. Parafin kesiti ve hematoksilin ve eozin (H&E) boyama
   1. Parafin katıştırma ve kesit yapmak için başka bir yerde⁹ açıklanan standart protokolü izleyin.
2. İmmünohistokimya (IHC)
   1. Parafin kesitlerini ksilen ile dewax ve alkol serileri ile rehidrat (100%, %95, %80) distile suya (dH₂O).
   2. 0,01 M sitrik asit tampon (trisodyum sitrat 3 g, 0.4 g sitrik asit 1 L çift distile H₂O) düşük güç (120 W) ile bir cam slayt kavanozda doku slaytları mikrodalga tedavi ile antijen alma gerçekleştirin. Enerji aralıklı olarak toplam 5-10 dakika boyunca her aralıkta yaklaşık 2 dakika sürmelidir.
      NOT: Yüksek güçlü mikrodalga veya tutarlı ısıtma slayt doku bölümlerinin ayrılmasına yol açacaktır.
   3. Cam kavanozdan slaytları seçin, yüz dokularını kullanarak her bölümü çevreleyen artık sıvıyı dikkatlice silin ve bir histoloji kutusundaki slayt rafına yerleştirin. Su geçirmez histolojik kalem ile her bölümün etrafında bir kare çizin. Her bir karenin üzerine 100 μL bloke tamponu (1x PBS'de %0,1 triton X-100 ve %10 eşek serumu) yerleştirin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   4. Engelleme çözeltisini vakumla dikkatlice çıkarın, tamponu bloke ederek istenilen seyreltme ile birincil antikor (Malzemeler Tablosu'nabakın) ekleyin ve slaytları 4 °C'de 24 saat veya daha uzun süre kuluçkaya yatırmaya devam edin.
      NOT: IHC için kullanılan her birincil antikor için konsantrasyon değişir ve pilot deneylerde test edilmesi gerekir.
   5. Doku slaytlarını PBST ile yıkayın (PBS'de %0.1 Triton) her biri 10 dakika boyunca üç kez. İkincil antikor kullanarak adım 2.2.4 tekrarlayın (Malzeme Tablosubakınız) ile birlikte 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) engelleme tampon yerine. Oda sıcaklığında (RT) en az 4 saat veya daha uzun süre kuluçkaya yatın.
   6. Sekonder antikor çıkarın, PBST çözeltisi ile doku bölümleri üç kez yıkayın, her biri için 10 dakika, sonra başka bir 5 dakika için temiz PBS ile yıkayın.
   7. Doku kesitlerini çevreleyen pbs artıklarını silin, montaj ortamına sahip bölümlere kapak lar monte edin. Görüntü elde etmek için floresan mikroskopi yapın (Bkz. Malzemeler Tablosu).

Sonuçlar

Farklı bakış açılarından görüntülenen ana kafatası kemikleri Şekil 1A-E'de,farklı kemikleri gösteren renklerle gösterilmiştir. Diseksiyon süreçlerini göstermek için dört haftalık bir hayvan kullandık. Diseksiyon basamakları 1.1.1-1.1.3 ve kısa bir önekasyon (adım 1.1.4) sonra, ilişkili yüz kemikleri ile göz küresi Şekil 1E'degösterilmiştir. Anterior (nazal ve prem...

Tartışmalar

Bozulmamış göz küresi hazırlanması için önemli bir hatırlatma tüm orbital kemiklertamamen kaldırılması gerektiğini, özellikle juga ve gözyaşı kemikleri, hangi küçük ve göz soketi alt yakınında bulunan. Geriye kalan kemikler, takip eden histolojiyi zorlaştırabilir. Küçük bir kemik parçasının kazara diseksiyondan tamamen çıkarılmaması durumunda, bir çift sharptweezers kullanılarak gömme parafin bloğundan seçilebilir. Geride kalan delik bu işlemden sonra erimiş parafin ile doldurul...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01
50ml centrifuge tube	Corning	430829
Adhesive microscope slides	Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Suggested concentration 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Suggested concentration 1:500 - 1,000
Anti-K12 antibody	Abcam	ab124975	Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody	Abcam	ab7800	Suggested concentration 1:800
Citric acid	Various
Cover slide	Various
Curved forceps	World Precision Instruments	14127
Dissecting microscope.	Olmpus	SZ61
Ethyl alcohol	Various
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242
Microwave ovens	Galanz	P70D20TL-D4
Mouse strains	C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6
Normal Goat Serum	Various
Paraformaldehyde (PFA)	Various		Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish	Various
Trisodium citrate	Various
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818