Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung des Mausauges mit Augenlid-, Augenoberfläche-, vorderen und hinteren Segmenten in relativ intakter Position.

Zusammenfassung

Die Augenoberfläche (OS) besteht aus einem Epithelblatt mit drei verbundenen Teilen: palpebrale Bindehaut, Bulbarkonjunktiviva und Hornhautepithel. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). In experimentellen Tiermodellen mit bestimmten genetischen Modifikationen oder künstlichen Operationen ist es sinnvoll, alle Teile des OS-Epithelblatts zu untersuchen, um relative pathogenetische Veränderungen jedes Teils parallel zu bewerten. Die Zerlegung des OS-Gewebes als Ganzes ohne Verzerrung oder Beschädigung war jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Weichheit und Dünnheit des Os, das an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln befestigt ist. Darüber hinaus ist die tiefe Augenhöhle, die durch die harten Schädel/Orbitalknochen gebildet wird, durch den Augapfel voll belegt, so dass nur begrenzter Platz für die Bedienung von Sezierungen bleibt. Als Ergebnis würde eine direkte Zerlegung des Augapfels mit zugehörigem OS-Gewebe von der Gesichtsseite oft zu Gewebeschäden führen, insbesondere der palpebralen und bulbaren Bindehaut. In diesem Protokoll beschrieben wir eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell von einem zerkularten Mauskopf zu entfernen, wobei Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammengelassen werden. Die Integrität des OS-Blattes war gut erhalten und konnte durch Histologie oder Immunostainierung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden.

Einleitung

Die Augenoberfläche besteht aus einem kontinuierlichen Blatt regionalisiertes Epithel einschließlich palpebrale Bindehaut, Bulbar-Konjunktiva und Hornhaut¹. Viele Drüsenstrukturen sind mit dem Augenoberflächenepithel assoziiert und erzeugen zusammen eine Schicht Tränenfolie, die die Hornhautoberfläche vor Trocknung und Umweltinvasionen schützt². Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltreizstoffe oder ihre Wechselwirkungen tragen zu pathologischen Veränderungen des OS^3,4bei. Dementsprechend wurden eine Vielzahl von gentechnisch veränderten und physikalisch oder chemisch induzierten Tiermodellen zur Untersuchung von Krankheitsprozessen des menschlichen Betriebssystems verwendet.

Die Struktur und Funktion des Maus-OS ist ähnlich wie die des Menschen in vielerlei Hinsicht. Die von den Augendrüsen sezernierten Tränenfilmkomponenten ähneln auch bei Mäusen und Menschen. Eine Fülle von Studien wurde mit Mausmodellen zur Aufklärung von Mechanismen menschlicher OS-Erkrankungen^5,6,7durchgeführt. In vielen Fällen ist es wichtig, globale statt lokale molekulare Veränderungen des Betriebssystems zu analysieren, um umfassende Informationen unter der gleichen experimentellen Behandlung zu erhalten. Daher ist eine Probenvorbereitung mit guter Integrität erforderlich, um sicherzustellen, dass jeder Teil des Betriebssystems gleichzeitig analysiert wird.

Das Mausbetriebssystem verbindet sich eng mit dem Augapfel, der in die Augenhöhle/Orbit eingebettet war (eine knöcherne Tasse aus mehreren verschiedenen Schädelknochen) und verbindet sich mit ihm durch dünnes Bindegewebe. Es gibt enorme Herausforderungen für die Sezieren der gesamten Augenoberfläche, ohne die palpebrale oder bulbar Konjunktiva zu beschädigen. Diese Herausforderungen gehen von: (i) das Betriebssystem ist weich und dünn und befestigt an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln, daher anfällig für Verzerrungen und Beschädigungen; und (ii) der begrenzte Abstand zwischen den Orbitalknochen und dem Augapfel die Seziervorgänge einschränken. Die Herausforderungen sind viel größer für die erwachsene Maus. In der embryonalen Maus ist die Orbitalknochenverknösung nicht vollständig und das umgebende Gewebe ist relativ locker⁸. Der Kopf kann entfernt und zerlegt werden und dann direkt paraformaldehyd (PFA) Fixierung und Einbettung^{ausgesetzt 9}. Im Gegensatz dazu sind die postnatalen und erwachsenen Maus-Orbitalknochen vollständig mit dicken umgebenden Geweben verknözt, was das Eindringen von Fixativen weniger effizient macht. Darüber hinaus sind die Orbital-/Schädelknochen hart und spröde, leicht gebrochen, wenn sie in die weichen Einbettverbindungen wie Paraffin geschnitten werden. Die gebrochenen Knochenstücke reißen einstimmig die nahegelegenen Gewebe, was zu einer minderwertigen Gewebemorphologie führt.

Viele veröffentlichte Studien zeigten oft partielle Augenoberfläche, die für ihre speziellen Forschungszwecke ausreichen kann^10,11. Eine grobe Untersuchung der Literatur ergab nur wenige Studien, die zeigten, dass die gesamte intakte Augenoberfläche ohne detaillierte Beschreibung der Sezierprotokolle^12,13nachgewiesen wurde. In diesem Protokoll haben wir eine Seziermethode beschrieben, um eine integrierte postnatale Augenoberfläche zu erhalten, bei der Orbital- und Schädelknochen geordnet entfernt wurden, wobei die unberührte Augenoberfläche zusammen mit dem Augapfel und den Augenlidern zurückbleibt, wodurch die körperlichen Schäden minimiert werden. Wir untersuchten die OS-Histologie und führten die Immunhistochemie mit den mit diesem Protokoll hergestellten Gewebeabschnitten durch.

Protokoll

Alle Verfahren zur Verwendung von Mäusen wurden vom Animal Care and Use Committee, Zhongshan Ophthalmic Center, genehmigt und befolgten die ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung.

1. Zerlegung des Augapfels mit intakter Augenoberfläche und Augenlidern

1. Sezieren Sie den Kopf.
   1. Euthanisieren Sie postnatale Tag 10 (P10) und P28 Mäuse (siehe Tabelle der Materialien für Mausstämme) durch Zervixdislokation, schneiden Sie den Kopf vom Hals durch eine scharfe Schere.
   2. Bisect Kopf mit einem Paar gerade Schere entlang der sagittalen Mittellinie beginnend an der interparietalen Knochen rostral zur Nasal (Abbildung 1A,B).
      HINWEIS: Der Schädelknochen härtet mit der Alterung der Maus aus, achten Sie darauf, dass die Schere so weit wie möglich entlang der Mittellinie schneidet.
   3. Legen Sie jede Hälfte des geteilten Kopfes in eine saubere Petrischale, schneiden Sie den Kiefer und die Zunge zuerst mit einer scharfen Schere ab. Befreien Sie den Sehnerv, indem Sie ihn vor der optischen Chiasm-Position aus dem Gehirn schneiden, und entfernen Sie alle Hirngewebe, einschließlich der Olfaktor-Lampe, die an der Schädelwand befestigt ist.
   4. Nun sollen die restlichen Gewebe alle Schädel-Orbital-Knochen haben, die mit dem Augapfel verbunden sind (Abbildung 1C,D). Waschen Sie den restlichen Teil mit PBS, um Blut und Haarreste zu reinigen.
   5. Präfixgewebe mit 4% Paraformaldehyd (PFA, in phosphatgepufferter Saline [PBS], pH 7,4) in einem 50 ml konischen Rohr bei Raumtemperatur (RT) mit Rotation. Die ungefähre Fixierungszeit ist wie folgt: 10 min für P0 bis P7; 20 min für P8 bis P28; und 30 min für P29 und älter.
      HINWEIS: Die Präfixierung bietet Gewebesteifigkeit, die die anschließende Zerlegung erleichtert. Darüber hinaus vermeidet die Präfixierung, dass frisches Gewebe zu lange vor der Zerlegung unfixiert bleibt.
      VORSICHT: PFA ist gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden.
2. Entfernen Sie Schädel-Orbitalknochen.
   1. Nach der Präfixierung den sezierten Kopf in PBS dreimal schnell waschen, um die gebrochenen Haare und Fixativen weiter zu beseitigen, um mit der weiteren Zerlegung fortzufahren.
      VORSICHT: Die Exposition gegenüber Fixativen während der Zerlegung kann gesundheitsschädlich sein.
   2. Legen Sie das Gewebe in 10 cm Petrischale, schneiden Sie den Schädel in drei Teile entlang der in Abbildung 1D,Eangegebenen Ebenen. Der Augapfel in der Steckdose ist im mittleren Teil des Schädels unter ethmoiden, frontalen und kieferllbeinen Knochen versteckt (Abbildung 1D,E).
   3. Verwenden Sie zwei Paare von No. 4 geradeZange, um den ethmoiden Knochen abzuschälen, um die Frontal- und Kieferknochen vollständig freizulegen (Abbildung 1F).
   4. Teilen Sie die Schädeloberfläche (einschließlich Der Oberkiefer und der Frontalknochen) geographisch in 4 Bereiche (Abbildung 1F). Setzen Sie die Spitze der gekrümmten Zangen horizontal in jeden Bereich ein, um die Oberkiefer- und Frontalknochen sequenziell zu entfernen (Abbildung 1F).
      HINWEIS: Die Kieferknochen können nicht alle gleichzeitig entfernt werden. Geduldig sezieren sie Stück für Stück. Der Frontalknochen ist durch weiches Bindegewebe direkt mit dem Augapfel verbunden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie ihn aus dem Augapfel entfernen, um zu verhindern, dass sich der Augapfel dehnt und die Bindehaut beschädigt wird.
   5. Nach der Entfernung des partiellen Kieferknochens und aller Frontalknochen würden die darunter liegenden Tränen- und Jugalknochen freigelegt (Abbildung 1G). Entfernen Sie die beiden Knochen und die damit verbundenen subkutanen Muskeln und Fette, die den Augapfel umgeben, schneiden Sie den Augapfel mit angeschlossenen Augenlidern und Haut in einen kleinen quadratischen Block, um das Gewebevolumen zu reduzieren und die Orientierung des Gewebes beim Einbetten zu erleichtern(Abbildung 1 H).
   6. Den Augapfel und das zugehörige Gewebe wieder in 4% PFA geben und über Nacht bei 4 °C fixieren. Das feste Gewebe kann mindestens einen Monat lang bei 4 °C in PBS mit einem Zusatz von 0,02% NaN₃konserviert werden. Alternativ können Sie sofort mit der histologischen Analyse fortfahren.
      HINWEIS: Wenn das Gewebe länger gelagert werden muss, kann es leicht in 70% Ethanol gelagert werden.

2. Histologische Analyse

1. Paraffin-Sektion und Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E)
   1. Befolgen Sie das an anderer Stelle beschriebene Standardprotokoll^9, um Paraffineinbettungen und -schnitte durchzuführen.
2. Immunhistochemie (IHC)
   1. Paraffinabschnitte mit Xylol ableiten und die Abschnitte durch Alkoholreihen (100%, 95%, 80%) rehydrieren in destilliertes Wasser (dH₂O).
   2. Antigenabruf durch Mikrowellenbehandlung der Geweberutschen im 0,01 M Zitronensäurepuffer (3 g Trinatriumcitrat, 0,4 g Zitronensäure pro 1 L doppelt destilliertem_H2O) in einem Glasschieber glas mit geringer Leistung (120 W). Die Energie sollte zeitweise für insgesamt 5-10 min mit jedem Intervall von etwa 2 min geliefert werden.
      HINWEIS: Hochleistungs-Mikrowelle oder gleichmäßige Erwärmung würde zur Ablösung von Gewebeabschnitten von der Rutsche führen.
   3. Wählen Sie die Dias aus dem Glas, wischen Sie die Restflüssigkeit, die jeden Abschnitt umgibt, vorsichtig mit Gesichtsgewebeabsaugen ab und legen Sie sie in einer Histologiebox auf das Diaregal. Zeichnen Sie ein Quadrat um jeden Abschnitt mit einem wasserdichten histologischen Stift. Legen Sie 100 l Blockierpuffer (0,1% Triton X-100 und 10% Eselserum in 1x PBS) auf jedes Quadrat und brüten 30 min bei RT.
   4. Entfernen Sie die Blockierlösung vorsichtig mit Vakuum, fügen Sie den primären Antikörper (siehe Materialtabelle) mit der gewünschten Verdünnung im Sperrpuffer hinzu und inkubieren Sie die Dias 24 h oder länger bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Konzentration für jeden primären Antikörper, der für IHC verwendet wird, variiert und muss in Pilotversuchen getestet werden.
   5. Waschen Sie Gewebeschlitten mit PBST (0,1% Triton in PBS) dreimal, für jeweils 10 min. Wiederholen Sie Schritt 2.2.4 mit dem sekundären Antikörper (siehe Materialtabelle) zusammen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), der den Sperrpuffer ersetzt. Bei Raumtemperatur (RT) mindestens 4 h oder länger weiter inkubieren.
   6. Entfernen Sie den sekundären Antikörper, waschen Gewebeabschnitte mit PBST-Lösung dreimal, für jeweils 10 min, dann mit sauberen PBS für weitere 5 min waschen.
   7. Wischen Sie die verbleibenden PBS-Umhänge ab, montieren Sie Abdeckungen auf Abschnitten mit Montagemedium. Führen Sie eine fluoreszierende Mikroskopie durch, um Bilder zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien).

Ergebnisse

Die wichtigsten Schädelknochen aus verschiedenen Perspektiven wurden in Abbildung 1A-Edargestellt, mit Farben, die verschiedene Knochen bezeichnen. Wir benutzten vier Wochen altes Tier, um die Sezierprozesse zu demonstrieren. Nach den Sezierschritten 1.1.1-1.1.3 und einer kurzen Präfixierung (Schritt 1.1.4) wird der Augapfel mit den zugehörigen Gesichtsknochen in Abbildung 1Egezeigt. Weitere T...

Diskussion

Eine wichtige Erinnerung für die Vorbereitung des intakten Augapfels ist, dass alle Orbitalknochen vollständig entfernt werden müssen, insbesondere die Juga- und Tränenknochen, die klein sind und sich in der Nähe der Unterseite der Augenhöhle befinden. Alle übrig gebliebenen Knochen können die anschließende Histologie erschweren. Falls ein winziges Stück Knochen nicht versehentlich vollständig aus der Zerlegung entfernt wurde, kann es aus dem Einbettungsparaffinblock mit einem Paar Scharfmacher herausgenommen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01
50ml centrifuge tube	Corning	430829
Adhesive microscope slides	Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Suggested concentration 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Suggested concentration 1:500 - 1,000
Anti-K12 antibody	Abcam	ab124975	Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody	Abcam	ab7800	Suggested concentration 1:800
Citric acid	Various
Cover slide	Various
Curved forceps	World Precision Instruments	14127
Dissecting microscope.	Olmpus	SZ61
Ethyl alcohol	Various
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242
Microwave ovens	Galanz	P70D20TL-D4
Mouse strains	C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6
Normal Goat Serum	Various
Paraformaldehyde (PFA)	Various		Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish	Various
Trisodium citrate	Various
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818