Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Resumen

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Resumen

La dinámica de desarrollo puede ser seguida por una microscopía confocal de lapso de tiempo de embriones de pez cebra transgénicos vivos que expresan fluorescencia en tejidos o células específicos. Una dificultad con el desarrollo de embriones enteros es que los embriones de pez cebra crecen sustancialmente en longitud. Cuando se monta como se hace regularmente en 0.3-1% baja agarosa de fusión, la agarosa impone restricción de crecimiento, dando lugar a distorsiones en el cuerpo del embrión blando. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal de lapso de tiempo, el embrión debe ser inmovilizado. Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen la motilidad de los embriones mientras permiten el crecimiento sin restricciones. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones. Para demostrar la usabilidad de este método, el desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros se realizó en peces transgénicos durante 55 horas consecutivas. Este método de montaje se puede utilizar para obtener imágenes fáciles y de bajo costo de embriones enteros de peces cebra utilizando microscopios invertidos sin necesidad de moldes o equipos especiales.

Introducción

El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo para la biología del desarrollo, y la microscopía es el principal método para visualizar el desarrollo embrionario. Las ventajas de utilizar embriones de pez cebra para estudios de desarrollo incluyen pequeño tamaño, claridad óptica, desarrollo rápido y alta fecundidad de los peces adultos. La generación de líneas transgénicas de peces cebra que expresan fluorescencia en ciertos tejidos o células han permitido una visualización directa del desarrollo de tejidos de maneras no posibles con animales vertebrados más grandes. En combinación con la microscopía de lapso de tiempo, los detalles y la dinámica del desarrollo del tejido se pueden estudiar fácilmente.

Una dificultad con el desarrollo de peces cebra por imágenes es que los embriones crecen sustancialmente en longitud; el embrión extiende su longitud cuatro veces dentro de los primeros 3 días de vida¹. Además, el cuerpo del embrión temprano es suave, y fácilmente se distorsiona si el crecimiento está restringido. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal, el embrión debe estar inmovilizado. Para mantener los embriones en una posición fija para la toma de imágenes confocales de lapso de tiempo, se anestesian regularmente y se montan en agarosa de fusión baja del 0,3-1%. Esto tiene la ventaja de permitir cierto crecimiento durante la toma de imágenes durante un cierto período de tiempo, mientras que restringe los movimientos del embrión. Partes del embrión se pueden imaginar eficientemente así. Sin embargo, cuando se utiliza este método para la toma de imágenes de todo el embrión durante períodos de tiempo prolongados, se observan distorsiones debido al crecimiento restringido causado por la agarosa. Por lo tanto, se requieren otros métodos de montaje. Kaufmann y sus colegas han descrito un montaje alternativo de embriones de pez cebra para la microscopía de láminas ligeras, como la microscopía de iluminación selectiva de plano (SPIM), montando los embriones en tubos de etileno propileno fluorado (FEP) que contienen bajas concentraciones de agarosa o metilcelulosa². Esta técnica produce una excelente visualización de la embriogénesis a lo largo del tiempo. Schmid et al. describen el montaje de hasta seis embriones en agarosa en tubos FEB para la microscopía de hoja de luz³ proporcionando visualización de varios embriones en una sesión de imágenes. Se han utilizado moldes para crear matrices de embriones para un montaje eficiente de un mayor número de embriones^4. Masselkink et al. han construido moldes de plástico impresos en 3D que se pueden utilizar para hacer moldes de silicio en los que se pueden colocar embriones de pez cebra en diferentes etapas, lo que permite el montaje en una posición constante para la toma de imágenes, incluida la imagen confocal^5. La impresión 3D también se ha utilizado para hacer moldes para el posicionamiento consistente de embriones de pez cebra en formato de 96 pozos^6. Algunos moldes se personalizan para ciertas etapas y pueden no permitir un crecimiento sin restricciones durante largos períodos de tiempo, mientras que otros moldes son más flexibles. Recientemente, Weijts et al. publicaron el diseño y la fabricación de un plato de cuatro pozos para la toma de imágenes en vivo de embriones de pez cebra⁷. En este plato, la cola y el tronco de los embriones de pescado anestesiados se colocan manualmente bajo un techo de silicona transparente unido justo encima de un cristal de cubierta para formar un bolsillo. El embrión se fija entonces en esta posición mediante la adición de 0,4% de agarosa. Este montaje permite la toma de imágenes de la parte posterior de unos 2 mm de largo (tronco y cola) del embrión, y como se pueden montar hasta 12 embriones por pozo, el método permite la toma de imágenes de múltiples muestras. Del mismo modo, Hirsinger y Steventon presentaron recientemente un método donde la cabeza del pez está montada en agarose, mientras que la cola puede crecer libremente, y este método también facilita eficientemente la toma de imágenes del tronco y la región de la cola del embrión^8.

Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen los movimientos de los embriones mientras permiten un crecimiento sin restricciones. Las ventajas de este método de montaje son que es un método de bajo costo, rápido y fácil para montar embriones de varias etapas para la toma de imágenes utilizando cualquier microscopio invertido. El montaje permite imágenes a largo plazo de todo el cuerpo (cabeza, tronco y cola) durante el desarrollo embrionario. Para mostrar la usabilidad de este método, se realizó la imagen del desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros en peces transgénicos. Dos embriones por sesión, a dos longitudes de onda en 3D fueron representados por microscopía de lapso de tiempo durante 55 horas consecutivas para representar películas de desarrollo de tejido.

Protocolo

El trabajo animal presentado aquí fue aprobado por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUCs) de la Universidad de Houston y la Universidad de Indiana.

1. Cría de pescado

NOTA: El trabajo con modelos de vertebrados requiere un protocolo aprobado por la IACUC. Debe llevarse a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes.

1. Mantener el pez cebra adulto como se describe en la literatura publicada anteriormente⁹.
2. Por la tarde, coloque el pez cebra adulto en tanques de cría. Criar machos a hembras en una proporción de 1:2.

2. Preparación de soluciones

1. Hacer una solución en stock de agarosa baja de fusión 1% en medios embrionarios (E3: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, ajustado a pH 7.0). Alísgue la solución en stock en tubos de 1,5 ml y guárdelos a 4 oC.
2. Hacer una solución en stock de 4% (p/v) tricaína (MS-222) en agua destilada. Conservar a 4oC en una botella oscura.
   ADVERTENCIA: La tricaína es tóxica y debe pesarse y disolverse en una campana de humos.
3. Hacer una solución de stock de 20 mM N-feniltionea (PTU) en agua destilada. Conservar a -20oC.

3. Preparación de embriones

1. Después del apareamiento, cosechar embriones en E3 en una placa de Petri e incubarlos a 26,5 oC durante unos 28 h antes del montaje.
   NOTA: Esto ralentiza el desarrollo de los embriones de modo que los embriones estén aproximadamente en 30 etapas de somita al comienzo de la toma de imágenes.
2. Anestetizar embriones en 0.016-0.020% Tricaína en E3. Para inhibir la pigmentación, añada la PTU a una concentración de 200 m.
3. Decotermir los embriones usando fórceps bajo un microscopio de disección. Usando dos fórceps, agarre y tire suavemente del coro para liberar el embrión.

4. Montaje en agarosa

NOTA: El método de montaje desarrollado requiere dos concentraciones diferentes de agarosa de baja fusión en E3 con 0.02% Tricaína y PTU según sea necesario. La primera solución de agarosa contiene una concentración óptima de agarosa en la que la distorsión y la motilidad son mínimas. La optimización se describe en el paso 5 a continuación.

1. Calentar las soluciones de agarosa para las dos capas (concentración definida en el paso 5 a continuación y 1%) a 65 oC. Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 30 oC justo antes del montaje para que el embrión no se dañe por el calor. Para el montaje, utilice platos inferiores de vidrio de 35 mm con un fondo de vidrio de cubierta No. 0. El vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato crea un pozo de 10 mm poco profundo (aprox. 1,2 mm de profundidad), en el que se va a colocar el embrión.
   NOTA: En este caso, la concentración con la menor motilidad y distorsiones estaba entre 0.025 a 0.040% agarosa.
2. Coloque suavemente un embrión desconfiónizado con uno de sus lados laterales hacia la parte inferior del plato utilizando una pipeta de vidrio o una micropipette. Si utiliza un micropipeta, corte la parte externa de la punta para aumentar el tamaño de la abertura para que se ajuste al embrión(Figura 1A). Retire con cuidado cualquier E3 restante con un micropipeta.
3. Añadir la primera solución de agarosa al pequeño pozo creado por el vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato para cubrir el embrión (Capa 1)(Figura 1B). Asegúrese de que la agarosa cubra el pozo pequeño, pero no lo desbordará.
4. Cubra el pozo pequeño con un vidrio de cubierta (22 mm x 22 mm)(Figura 1C)para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre los dos vasos de cubierta.
5. Coloque una capa de solución de agarosa al 1% en la parte superior del cristal de la cubierta por toda la parte inferior del plato (Capa 2)(Figura 1D). A medida que esta capa se solidifica, mantiene el vidrio de la cubierta en su lugar.
6. Llene la porción restante del plato con E3 que contiene 0,02% de tricaína para mantener el sistema hidratado (Capa 3)(Figura 1E).
   NOTA: En esta configuración, el vidrio de la cubierta y el 1% de agarosa protegen la capa inferior de diluirse.

5. Optimización de la solución de agarosa para la capa 1

1. Para identificar la concentración óptima de agarosa para la Capa 1, utilice un enfoque de búsqueda de cuadrícula multiescala. Monte embriones en concentraciones crecientes de agarosa que van del 0,01% al 1% seguido de imágenes de lapso de tiempo de restricción del crecimiento embrionario y motilidad en el campo de visión. Identificar las concentraciones en las que tanto la distorsión como la motilidad son mínimas.
2. Para optimizar aún más la concentración de agarosa, monte los embriones utilizando un rango más fino de concentraciones de agarosa (por ejemplo, entre 0,025 y 0,040% agarosa) dependiendo de la concentración que se encuentre mejor en el paso 5.1 (por ejemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   NOTA: En nuestro laboratorio, la concentración óptima de agarosa fue de alrededor del 0,03%.

6. Imágenes de lapso de tiempo

NOTA: Este método de montaje funciona para cualquier microscopio invertido con funcionalidad de lapso de tiempo para fluorescencia e imágenes de campo brillante.

1. Realizar imágenes de lapso de tiempo para todo el embrión o partes del mismo durante un máximo de 55 horas. Para obtener imágenes de varios embriones, utilice un adaptador de etapa que sostenga varios platos con un embrión montado por plato. Gire los platos uno por uno para que los embriones se posicionen aproximadamente horizontalmente según lo determinado por el ojo. Para un crecimiento y desarrollo óptimo de embriones, utilice una etapa de microscopio con una incubadora establecida a 28,5 oC.
2. Seleccione un objetivo de aumento bajo en el software del microscopio. Debajo de la pieza del ojo, localice y alinee finamente los embriones horizontalmente girando los platos utilizando la iluminación de campo brillante y registre sus ubicaciones en el software. Cree un nombre de archivo para el guardado automático de los datos.
   NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de plan apo 4x 0.2 NA y la pestaña XY dentro de la ventana de adquisición de ND para registrar las ubicaciones de los embriones. Los datos se guardaron en formato .nd2. El objetivo fue seleccionado haciendo clic en sus iconos en la pestaña Ti Pad.
3. Establezca el tamaño del agujero, la velocidad de escaneado, el tamaño de la imagen y el zoom. A continuación, seleccione un objetivo de ampliación más alto para capturar las imágenes.
   NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de na de 10 x 0,45 planos para la toma de imágenes de embriones enteros, y se utilizó un objetivo superfluor 20x 0,75 NA para la mayor magnificación de partes del embrión. El agujero se estableció en 1,2 UA (19,2 m para la lente 10x), la velocidad de escaneo se estableció para un tiempo de permanencia de píxeles de 2,4 s y el tamaño de la imagen se estableció en 1024 x 1024 píxeles con un zoom de escaneo de uno, dando un tamaño de píxel de 1,24 ám para la lente 10x y 0,62 m para la lente 20x.
4. Seleccione los canales para la fluorescencia que se va a tomar en la imagen. Ajuste los ajustes de captura de imagen de un canal a la vez. Para cada canal de fluorescencia ajustar la potencia del láser y el detector de alto voltaje, asegurándose de recoger el mejor rango dinámico posible evitando la saturación y limitando el fotoblanqueo.
   NOTA: En este experimento, GFP se dio a la imagen del canal verde de 488, (láser de 488 nm y emisión entre 500 y 550 nm), y RFP con el canal rojo 561 (láser de 561 nm y emisión entre 570 y 600 nm), y la imagen de transmisión se recogió utilizando el láser de 561 nm y el detector de luz transmitida (canalTD).
5. Para tomar imágenes de todo el embrión con el objetivo 10x, idee varios campos de visión con superposición y coselos con el software del microscopio.
   NOTA: Como los embriones crecerán sustancialmente en tamaño durante la toma de imágenes, asegúrese de que haya espacio en el campo de visión anterior y posterior al embrión. Utilice la pestaña Escanear imagen grande de la ventana de adquisición de ND y seleccione un patrón de 4 x 1 con una superposición del 10% para capturar cuatro campos de visión adyacentes.
6. Configure los ajustes para capturar las pilas Z utilizando el software del microscopio.
   NOTA: Debido a que el embrión está montado cerca de la parte inferior de la placa de vidrio, su centro se alejará de la parte inferior a medida que crece. Utilice la pestaña Z de la ventana de adquisición ND y seleccione el rango relativo asimétrico. Con este método, el plano de enfoque actual se utiliza como plano de referencia y el resto de los planos se distribuyen asimétricamente por encima y por debajo para incluir todo el embrión dentro del volumen de la pila Z, con suficiente espacio para tener en cuenta el crecimiento de la muestra. En todos los experimentos, el intervalo se estableció en 11 m y el rango total en unos 45 planos.
7. Para mantener el enfoque de varios embriones durante las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice un enfoque automatizado. Si toma imágenes de varios embriones, ajuste los niveles de desplazamiento individuales para que cada embrión se centre en el plano de referencia.
   NOTA: En este experimento, se utilizó un sistema de estabilización de enfoque basado en láser.
8. Configure los parámetros de lapso de tiempo en el software del microscopio y la imagen para una duración de 55 h a intervalos de aproximadamente 1 h. En cada ciclo, capture dos conjuntos de datos de embriones secuencialmente y guarde los datos automáticamente después de cada ciclo.
9. Procese imágenes utilizando una versión en línea o fuera de línea del software del microscopio. Si se ha creado una imagen de más de un embrión, cree archivos independientes para cada embrión dividiendo el conjunto de datos en función de la ubicación de la imagen. Utilice proyecciones de intensidad máxima o una herramienta similar para convertir conjuntos de datos de tiempo 3D en conjuntos de datos de tiempo 2D. Cree archivos de película mediante la opción de menú Guardar como, seleccionando .avi como formato de archivo. Seleccione la opción Sin compresión con intervalos de 200 ms para una velocidad de reproducción de 5 fotogramas /s.
   NOTA: El conjunto de datos original de dos embriones en este experimento se dividió utilizando la función De las ubicaciones divididas en el software (Archivo ? Importación/Exportación (Import/Export) Dividir multipuntos). Los datasets de tiempo 3D se convirtieron en conjuntos de datos de tiempo 2D mediante la función de proyección de intensidad máxima (Imagen ? Procesamiento ND Crear imagen de proyecciónde intensidad máxima en Z ).

Resultados

Desarrollo del método de montaje
El objetivo principal de este trabajo era desarrollar una técnica de montaje de bajo costo para la toma de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo de peces cebra durante largos períodos de tiempo. El método de montaje en capas fue desarrollado para permitir el crecimiento completo del frágil cuerpo embrionario de pez cebra, al tiempo que restringe sus movimientos. Si la concentración de agarosa de la capa 1 es demasiado alta, los embriones se distorsionarán ...

Discusión

Aquí se describe un método de montaje para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de peces cebra. El paso más crítico para el método de montaje es identificar la concentración óptima de agarosa que permitirá el crecimiento sin restricciones del embrión del pez cebra, y al mismo tiempo mantener los embriones en una posición completamente fija para la toma de imágenes confocales. Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, este valor es muy sensible a lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software