Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Resumo

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Resumo

A dinâmica do desenvolvimento pode ser seguida pela microscopia confocal do time-lapse de embriões transgênicos vivos do zebrafish que expressam a fluorescência em tecidos ou em pilhas específicos. Uma dificuldade com o desenvolvimento de embriões inteiros da imagem latente é que os embriões do zebrafish crescem substancialmente no comprimento. Quando montada como feito regularmente em 0,3-1% de baixa agarose de raço, a agarose impõe restrição de crescimento, levando a distorções no corpo de embriões moles. No entanto, para realizar microscopia confocal time-lapse, o embrião deve ser imobilizado. Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem a motilidade dos embriões, permitindo o crescimento irrestrito. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações. Para demonstrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgémicos por 55 horas consecutivas. Este método de montagem pode ser usado para imagens fáceis e de baixo custo de embriões inteiros de zebrafish usando microscópios invertidos sem requisitos de moldes ou equipamentos especiais.

Introdução

O zebrafish tem sido um organismo modelo para a biologia do desenvolvimento, e a microscopia é o método principal para visualizar o desenvolvimento embrionário. As vantagens do uso de embriões de zebrafish para estudos de desenvolvimento incluem pequeno tamanho, clareza óptica, desenvolvimento rápido e alta fecundidade dos peixes adultos. A geração de linhas transgênicas de zebrafish expressando fluorescência em certos tecidos ou células permitiu uma visualização direta do desenvolvimento de tecidos de maneiras não possíveis com animais vertebrados maiores. Em combinação com a microscopia de lapso de tempo, detalhes e dinâmicas do desenvolvimento do tecido podem ser prontamente estudados.

Uma dificuldade com o desenvolvimento do zebrafish da imagem latente é que os embriões crescem substancialmente no comprimento; o embrião estende seu comprimento quatro vezes nos primeiros 3 dias de vida^1. Além disso, o corpo do embrião precoce é macio e facilmente se torna distorcido se o crescimento for restrito. No entanto, para realizar microscopia confocal, o embrião deve ser imobilizado. Para manter os embriões em posição fixa para imagens confocais de lapso de tempo, eles são regularmente anestesiados e montados em 0,3-1% de baixa fusão agarose. Isto tem a vantagem de permitir algum crescimento durante a imagem latente por um determinado período de tempo, ao restringir movimentos do embrião. Partes do embrião podem ser imagemdas de forma eficiente assim. No entanto, ao utilizar este método de imagem de todo o embrião por longos períodos de tempo, as distorções são observadas devido ao crescimento restrito causado pela agarose. Assim, outros métodos de montagem são necessários. Kaufmann e seus colegas descreveram uma montagem alternativa de embriões de zebrafish para microscopia de folha de luz, como microscopia seletiva de iluminação plana (SPIM), montando os embriões em tubos de etileno fluorado (FEP) contendo baixas concentrações de agarose ou metilcelulose². Esta técnica produz uma visualização soberba de embriogênese ao longo do tempo. Schmid et al. descrevem a montagem de até seis embriões em agarose em tubos feb para microscopia de folha de luz³ fornecendo visualização de vários embriões em uma sessão de imagem. Os moldes foram usados para criar disposições do embrião para a montagem eficiente de um número maior de embriões^4. Masselkink et al. construíram moldes plásticos impressos em 3D que podem ser usados para fazer moldes de silício em que embriões de zebrafish em diferentes estágios podem ser colocados, permitindo a montagem em uma posição constante para imagens, incluindo imagens confocais⁵. Impressão 3D também tem sido usada para fazer moldes para o posicionamento consistente de embriões zebrafish em 96 bem formato⁶. Alguns moldes são personalizados para determinadas fases e não podem permitir o crescimento irrestrito por longos períodos de tempo, enquanto outros moldes são mais flexíveis. Recentemente, Weijts et al. publicou o projeto e fabricação de um prato de quatro poços para imagens ao vivo de embriões zebrafish⁷. Neste prato, a cauda e o tronco de embriões de peixeanestesiados são colocados manualmente um telhado de silicone claro ligado logo acima de um copo de cobertura para formar um bolso. O embrião é então fixado nesta posição pela adição de 0,4% agarose. Esta montagem permite a imagem latente da parte posterior de aproximadamente 2 milímetros de comprimento (tronco e cauda) do embrião, e como até 12 embriões podem ser montados por poço, o método permite a imagem latente de amostras múltiplas. Da mesma forma, Hirsinger e Steventon apresentaram recentemente um método onde a cabeça do peixe é montada em agarose, enquanto a cauda pode crescer livremente, e este método também facilita eficientemente a imagem do tronco e da região da cauda do embrião⁸.

Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem os movimentos dos embriões, permitindo um crescimento irrestrito. As vantagens deste método de montagem são que é um método de baixo custo, rápido e fácil de montar embriões de várias fases para imagens usando qualquer microscópio invertido. A montagem permite a imagem latente a longo prazo do corpo inteiro (cabeça, tronco e cauda) durante o desenvolvimento do embrião. Para mostrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgénicas. Dois embriões por sessão, em dois comprimentos de onda em 3D foram imageados pela microscopia do time-lapse por 55 horas consecutivas para render filmes do desenvolvimento do tecido.

Protocolo

O trabalho animal apresentado aqui foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUCs) da Universidade de Houston e da Universidade de Indiana.

1. Criação de peixes

NOTA: O trabalho com modelos de vertebrados requer um protocolo aprovado pela IACUC. Deve ser conduzida de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes.

1. Manter zebrafish adulto, como descrito na literatura publicada anteriormente⁹.
2. À tarde, coloque zebrafish adulto em tanques de reprodução. Raça machos para fêmeas em uma proporção de 1:2.

2. Preparação de soluções

1. Faça uma solução de estoque de 1% de baixa agarose de derretimento em mídia embrionária (E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄, ajustado ao pH 7.0). Aliquot a solução de ações em tubos de 1,5 mL e armazená-los em 4 °C.
2. Faça uma solução de estoque de 4% (w/v) Tricaine (MS-222) em água destilada. Guarde a 4 °C em uma garrafa escura.
   CUIDADO: Tricaine é tóxico e deve ser pesado e dissolvido em um capô de fumaça.
3. Faça uma solução de estoque de 20 mM N-fenilthiourea (PTU) em água destilada. Armazenar a -20 °C.

3. Preparação de embriões

1. Após o acasalamento, colher embriões em E3 em uma placa de Petri e incubar-los em 26,5 ° C por cerca de 28 h antes da montagem.
   NOTA: Isso retarda o desenvolvimento dos embriões para que os embriões estejam aproximadamente em 30 estágios semolo no início da imagem.
2. Embriões de anestesia em 0,016-0,020% Tricaine na E3. Para inibir a pigmentação, adicione ptu a uma concentração de 200 μM.
3. Dechorionate os embriões usando fórceps um microscópio de dissecação. Usando dois fórceps, aderência e puxe suavemente o chorão para além para liberar o embrião.

4. Montagem em agarose

NOTA: O método de montagem desenvolvido requer duas concentrações diferentes de agarose de baixo derretimento na E3 com 0,02% Tricaine e PTU, conforme necessário. A primeira solução agarose contém uma concentração ideal de agarose em que a distorção e motilidade estão no mínimo. A otimização é descrita na etapa 5 abaixo.

1. Aqueça as soluções agarose para as duas camadas (concentração definida na etapa 5 abaixo e 1%) a 65 °C. Deixe a agarose esfriar a aproximadamente 30 °C pouco antes de montar para que o embrião não seja prejudicado pelo calor. Para a montagem, use pratos de fundo de vidro de 35 mm com um fundo de vidro de cobertura Nº 0. O vidro de tampa unido à parte inferior do prato cria um poço raso de 10 milímetros (aproximadamente 1.2 milímetros), em que o embrião deve ser coloc.
   NOTA: Neste caso, a concentração com menor motilidade e distorções ficou entre 0,025 a 0,040% agarose.
2. Coloque suavemente um embrião dechorionado com um de seus lados laterais em direção ao fundo do prato usando uma pipeta de vidro ou micropipette. Se estiver usando uma micropipette, corte a parte externa da ponta para aumentar o tamanho da abertura para caber o embrião (Figura 1A). Retire cuidadosamente qualquer E3 restante com uma micropipette.
3. Adicione a primeira solução agarose para o pequeno poço criado pelo vidro de tampa ligado ao fundo do prato para cobrir o embrião (Camada 1) (Figura 1B). Certifique-se de que a agarose cobre o pequeno poço, mas não vai sobressá-lo.
4. Cubra o pequeno poço com um vidro de cobertura (22 mm x 22 mm) (Figura 1C)para criar um espaço estreito agarose cheio com o embrião entre os dois óculos de cobertura.
5. Coloque uma camada de 1% solução agarose em cima do vidro de tampa em todo o fundo do prato (Camada 2) (Figura 1D). Como esta camada solidifica, ele mantém o vidro da tampa no lugar.
6. Preencha a parte restante do prato com E3 contendo 0,02% Tricaine para manter o sistema hidratado (Camada 3) (Figura 1E).
   NOTA: Nesta configuração, o vidro de tampa e 1% agarose proteger a camada inferior de ficar diluído.

5. Otimização da solução agarose para a camada 1

1. Para identificar a concentração ideal de agarose para a Camada 1, use uma abordagem de pesquisa de rede multiescala. Os embriões da montagem em concentrações crescentes do agarose que variam de 0.01% a 1% seguidos pela imagem latente do time-lapse da limitação e da motilidade do crescimento do embrião no campo de vista. Identifique as concentrações onde a distorção e a motilidade estão no mínimo.
2. Para otimizar ainda mais a concentração de agarose, monte os embriões com uma gama mais fina de concentrações de agarose (por exemplo, entre 0,025 e 0,040% agarose), dependendo da concentração encontrada para ser melhor na etapa 5.1 (por exemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   NOTA: Em nosso laboratório, a concentração agarose ideal foi de cerca de 0,03%.

6. Imagens de lapso de tempo

NOTA: Este método de montagem funciona para qualquer microscópio invertido com funcionalidade de lapso de tempo para fluorescência e imagens de campo brilhantes.

1. Realize imagens de lapso de tempo para todo o embrião ou partes dele por até 55 h. Para imagens de vários embriões, use um adaptador de palco que contém vários pratos com um embrião montado por prato. Gire os pratos um por um para que os embriões sejam posicionados aproximadamente horizontalmente como determinados pelo olho. Para o crescimento e desenvolvimento ideal do embrião, use um estágio do microscópio com uma incubadora ajustada em 28.5 °C.
2. Selecione um objetivo de baixa ampliação no software do microscópio. a parte do olho, localizar e alinhar finamente os embriões horizontalmente, girando os pratos usando iluminação de campo brilhante e gravar suas localizações no software. Crie um nome de arquivo para a avaliação automática dos dados.
   NOTA: Neste experimento, um plano apo λ 4x 0.2 NA objetivo e a guia XY dentro da janela de aquisição ND foram usados para registrar os locais dos embriões. Os dados foram salvos em formato .nd2. O objetivo foi selecionado clicando em seus ícones na aba Ti Pad.
3. Defina o tamanho do pinhole, a velocidade da varredura, o tamanho da imagem e o zoom. Em seguida, selecione um objetivo de ampliação maior para capturar as imagens.
   NOTA: Neste experimento, um objetivo de plano-apo 10x 0,45 NA foi usado para imagens de embriões inteiros, e um objetivo superfluor 20x 0,75 NA foi usado para a maior imagem de ampliação de partes do embrião. O pinhole foi ajustado a 1.2 UA (19.2 μm para a lente 10x), a velocidade da varredura foi ajustada para um tempo do habitamento do pixel de 2.4 μs e o tamanho da imagem foi ajustado a 1024 x 1024 pixels com um zoom da varredura de um, dando um tamanho do pixel de 1.24 μm para a lente 10x e 0,62 μm para a lente 20x.
4. Selecione os canais para que a fluorescência seja imagemda. Ajuste as configurações de captura de imagem em um canal de cada vez. Para cada canal de fluorescência ajustar o poder do laser e o detector de alta tensão, certificando-se de recolher a melhor faixa dinâmica possível, evitando a saturação e limitando o clareamento.
   NOTA: Neste experimento, gfp foi imagemdo com o canal verde 488, (488 nm laser e emissão entre 500 e 550 nm), e RFP com o canal vermelho 561 (561 nm laser e emissão entre570 e 600 nm), ea imagem de transmissão foi coletada usando o laser 561 nm e o detector de luz transmitida ( canalTD ).
5. Para a imagem de todo o embrião com o objetivo 10x, imagem vários campos de visão com sobreposição e costura-los usando o software microscópio.
   NOTA: Como os embriões crescerão substancialmente em tamanho durante a imagem, certifique-se de que há espaço no campo de visão anterior e posterior ao embrião. Use a aba Scan Large Image da janela de aquisição nd e selecione um padrão de 4 x 1 com 10% de sobreposição para capturar quatro campos de visão adjacentes.
6. Configure as configurações para capturar as pilhas Z usando o software de microscópio.
   NOTA: Porque o embrião é montado perto da parte inferior do prato de vidro, seu centro mover-se-á longe da parte inferior enquanto cresce. Use a guia Z da janela de aquisição nd e selecione a faixa relativa assimétrica. Com este método, o plano de foco atual é usado como o plano de referência e o resto dos aviões são distribuídos assimétricamente acima e abaixo para incluir todo o embrião dentro do volume da pilha Z, com espaço suficiente para explicar o crescimento do espécime. Em todos os experimentos, o intervalo foi fixado em 11 μm e o alcance total de cerca de 45 aviões.
7. A fim de manter o foco de embriões múltiplos durante a imagem de longo prazo de lapso de tempo, use um foco automatizado. Se a imagem de vários embriões, ajuste os níveis de compensação individuais para cada embrião para se concentrar no plano de referência.
   NOTA: Neste experimento, um sistema de estabilização de foco baseado em laser foi usado.
8. Configure parâmetros de lapso de tempo no software e imagem do microscópio para uma duração de 55 h em intervalos de cerca de 1 h. Em cada ciclo, capture dois conjuntos de dados de embriões sequencialmente e economize dados automaticamente após cada ciclo.
9. Processe imagens usando uma versão on-line ou off-line do software de microscópio. Se mais de um embrião foi imageado, crie arquivos independentes para cada embrião dividindo o conjunto de dados com base na localização da imagem. Use projeções de intensidade máxima ou uma ferramenta semelhante para converter conjuntos de dados de tempo 3D em conjuntos de dados de tempo 2D. Crie arquivos de filmes usando a opção Save as menu, selecionando .avi como formato de arquivo. Selecione a opção sem compressão com intervalos de 200 ms para uma velocidade de reprodução de 5 quadros /s.
   NOTA: O conjunto de dados original de dois embriões neste experimento foi dividido usando a função de locais Split no software ( Arquivo| Importação/Exportação | Dividir multipontos). Os conjuntos de dados de tempo 3D foram convertidos em conjuntos de dados de tempo 2D usando a função de projeção de intensidade máxima (Imagem | ND Processamento| Criar imagem de projeção de intensidade máxima em Z).

Resultados

Desenvolvimento do método de montagem
O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica de montagem de baixo custo para imagens de lapso de tempo do desenvolvimento de zebrafish por longos períodos de tempo. O método de montagem em camadas foi desenvolvido para permitir o crescimento total do frágil corpo embrionário de zebrafish, restringindo seus movimentos. Se a concentração agarose da camada 1 for muito alta, os embriões ficarão distorcidos e curvos(Fig...

Discussão

Um método de montagem para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões inteiros de zebrafish é descrito aqui. O passo mais crítico para o método de montagem é identificar a concentração ideal de agarose que permitirá o crescimento irrestrito do embrião de zebrafish e, ao mesmo tempo, manter os embriões em uma posição completamente fixa para imagens confocais. Como a concentração ideal de agarose é muito estreita, esse valor é muito sensível aos erros na medição do peso da agarose e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software