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Resumen

El primer paso para comprender la interacción de fase sólida biomolécula-inorgánica es revelar constantes fisicoquímicas fundamentales que pueden evaluarse mediante el establecimiento de isotermas de adsorción. La adsorción de la fase líquida está restringida por la cinética, la capacidad superficial, el pH y la adsorción competitiva, que deben considerarse con cautela antes de establecer un experimento de adsorción.

Resumen

Los fundamentos de las interacciones inorgánicas-orgánicas son de vital importancia en el descubrimiento y desarrollo de nuevas biointerfaces susceptibles de utilización en biotecnología y medicina. Estudios recientes indican que las proteínas interactúan con las superficies a través de sitios de adsorción limitada. Fragmentos de proteínas como aminoácidos y péptidos se pueden utilizar para el modelado de interacción entre macromoléculas biológicas complejas y superficies inorgánicas. Durante las últimas tres décadas, se han desarrollado muchos métodos válidos y sensibles para medir los fundamentos de la química física de esas interacciones: calorimetría de valoración isotérmica (ITC), resonancia de plásmo superficial (SPR), microbalance de cristal de cuarzo (QCM), fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y espectroscopia de reflectancia total atenuada (ATR).

La técnica más sencilla y asequible para la medición de la adsorción es el método de agotamiento, donde el cambio en la concentración de sorbato (agotamiento) después del contacto con sorbente disperso por solución se calcula y se supone que se absorbe. Las isotérmicas de adsorción basadas en datos de agotamiento proporcionan todos los datos fisicoquímicos básicos. Sin embargo, la adsorción de las soluciones requiere tiempos de equilibrio más largos debido a restricciones cinéticas y sorbentes con una superficie específica alta, por lo que es casi inaplicable a las superficies planas fijas macroscópicas. Además, se deben considerar factores como la inestabilidad de los sols, los agregados de nanopartículas, la cristalinidad del sorbente, la distribución del tamaño de las nanopartículas, el pH de la solución y la competencia por la adsorción, al estudiar los péptidos de adsorción. Los datos de agotamiento de la construcción de isotermas proporcionan datos completos de química física para literalmente cada sorbato soluble, pero sigue siendo la metodología más accesible, ya que no requiere configuraciones costosas. Este artículo describe un protocolo básico para el estudio experimental de la adsorción de péptidos en óxido inorgánico y cubre todos los puntos críticos que afectan el proceso.

Introducción

Durante los últimos 50 años la interacción entre superficies inorgánicas y péptidos ha llamado mucho la atención debido a su gran importancia en la ciencia de los materiales y la medicina. La investigación biomédica se centra en la compatibilidad y estabilidad de las superficies bioinorgánicas, que tienen implicaciones directas para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos1,2,3, y la implantación4,5,6,7. Los dispositivos biosensibles contemporáneos, como sensores y actuadores, se basan en proteínas funcionales inmovilizadas en superficies semiconductoras de óxido8,9,10,11,12,13. Las prácticas modernas de purificación para la producción de proteínas a menudo se basan en las propiedades de interacción de biomoléculas en la purificación y separación aguas abajo14.

Entre los múltiples óxidos inorgánicos, el dióxido de titanio sigue siendo el más utilizado en combinación con sustratos biológicamente relevantes15,,16. La investigación en el área de las biointerfaces basadas en TiO2se ha concentrado en establecer una unión fuerte y específica de proteínas y péptidos sin cambiar sus propiedades biológicas y estructurales. En última instancia, el objetivo principal es una capa de alta densidad superficial de biomoléculas con alta estabilidad y mayor funcionalidad que avanzará en la creación de aplicaciones biotecnológicas y médicas basadas en titanio17.

El titanio y sus aleaciones se han utilizado ampliamente como material de implante quirúrgico durante al menos seis décadas porque una capa de superficie TiO2 con un espesor de unos pocos nanómetros es resistente a la corrosión y exhibe un alto nivel de biocompatibilidad en muchas aplicaciones in vivo18,,19,,20. El dióxido de titanio también se considera ampliamente un sustrato inorgánico producido en la biomineralización, donde la nucleación y el crecimiento de la fase inorgánica acompañado de proteínas y péptidos pueden proporcionar materiales con propiedades catalíticas y ópticas prometedoras21,,22,,23,,24.

Dada la gran relevancia de la interacción entre materiales inorgánicos y biomoléculas en general y las interacciones proteína-TiO2 en particular, ha habido mucha investigación para abordar la manipulación y el control de la adsorción de proteínas en TiO2. Debido a estos estudios, se han revelado algunas propiedades fundamentales de esta interacción, como la cinética de adsorción, la cobertura superficial y la conformación de biomoléculas, dando un apoyo sustancial para nuevos avances en las biointerfaces5,,13.

Sin embargo, la complejidad de las proteínas añade restricciones considerables a la determinación completa y la comprensión de la interacción a nivel molecular de una proteína con las superficies inorgánicas. Suponiendo que las biomoléculas interactúan con las superficies inorgánicas a través de sitios limitados, algunas proteínas con estructuras conocidas y secuencias de aminoácidos se han reducido a sus componentes-péptidos y aminoácidos-que se estudian por separado. Algunos de estos péptidos han demostrado una actividad significativa, convirtiéndolos en un tema único de estudios de adsorción sin necesidad de separación previa de proteínas25,,26,,27,28,29,30.

La caracterización cuantitativa de la adsorción de péptidos en TiO2 u otras superficies inorgánicas se puede lograr mediante métodos físicos que se han adaptado específicamente para biomoléculas durante las últimas décadas. Estos métodos incluyen calorimetría de valoración isotérmica (ITC), resonancia de plasmón superficial (SPR), microbalance de cristal de cuarzo (QCM), fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y espectroscopia de reflectancia total atenuada (ATR), todo lo cual permite la detección de la resistencia a la adsorción proporcionando datos termodinámicos clave: La constante de unión, la entalpía libre de Gibbs, la entalpía y la entropía31.

La adsorción de biomoléculas al material inorgánico puede realizarse de dos maneras: 1) ITC, así como el método de agotamiento, utilizan partículas dispersas en una solución que se une a superficies macroscópicas fijas; 2) SPR, QCM, TIRF y ATR utilizan superficies macroscópicas modificadas con material inorgánico, como virutas de vidrio o metal recubiertas de oro, cristales de cuarzo, cristales de sulfuro de zinc y chips de PMMA, respectivamente.

La calorimetría de valoración isotérmica (ITC) es un método físico sin etiquetas que mide el calor producido o consumido tras la valoración de soluciones o mezclas heterogéneas. Las células calorimétricas sensibles detectan efectos de calor tan pequeños como 100 nanojulios, lo que hace posible la medición del calor de adsorción en superficies de nanopartículas. El comportamiento térmico del sorbato durante la adición-valoración continua, proporciona un perfil termodinámico completo de la interacción que revela entalpía, constante de unión y entropía a una temperatura determinada32,,33,34,,35,36.

La espectroscopia de resonancia plasmal superficial (SPR) es una técnica óptica sensible a la superficie basada en la medición del índice de refracción del medio muy cerca de la superficie estudiada. Es un método en tiempo real y sin etiquetas para monitorear la adsorción reversible y el grosor de la capa adsorbida. La constante de enlace se puede calcular a partir de las tasas de asociación y disociación. Los experimentos de adsorción realizados a diferentes temperaturas pueden proporcionar información sobre la dependencia de la temperatura de la energía de activación y secuencialmente otros parámetros termodinámicos37,,38,,39.

El método de microbalance de cristal de cuarzo (QCM) mide el cambio en la frecuencia oscilante de los cristales piezoeléctricos durante los procesos de adsorción y desorción. La constante de enlace puede evaluarse a partir de la relación de las constantes de velocidad de adsorción y desorción. QCM se utiliza para mediciones de masa relativa y, por lo tanto, no necesita calibración25,27,40. QCM se utiliza para la adsorción de gas y líquido. La técnica líquida permite utilizar QCM como herramienta de análisis para describir la deposición en superficies modificadas41.

La fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es una técnica óptica interfacial sensible basada en la medición de la fluorescencia de fluorescencias adsorvistas excitadas con ondas evanescentes reflejadas internamente. El método permite la detección de moléculas fluorescentes que cubren la superficie con espesores en el orden de decenas de nanómetros, por lo que se utiliza en el estudio de la adsorción macromolecular en varias superficies42,,43. El monitoreo in situ de la dinámica de fluorescencia tras la adsorción y la desorción proporciona la cinética de adsorción y por lo tanto los datos termodinámicos42,,43.

La reflectancia total atenuada (ATR) fue utilizada por Roddick-Lanzilotta para establecer isotermas de adsorción de lisina basadas en las bandas espectrales de lisina a 1.600 y 1.525 cm-1. Esta es la primera vez que la constante de unión para un péptido en TiO2 se determinó utilizando un método infrarrojo in situ44. Esta técnica fue eficaz en el establecimiento de isotermas de adsorción para péptidos de polilisina45 y aminoácidos ácidos46.

A diferencia de los métodos antes mencionados, donde el parámetro de adsorción se mide in situ, en un experimento convencional la cantidad de biomoléculas adsorbidas se mide por el cambio de concentración después de que la superficie entró en contacto con la solución. Debido a que la concentración de un sorbato se descompone en una gran mayoría de casos de adsorción, este método se conoce como el método de agotamiento. Las mediciones de concentración requieren un ensayo analítico validado, que puede basarse en una propiedad analítica intrínseca del sorbato o en el etiquetado47,48,49,50 o derivatización51,52 de los mismos.

Los experimentos de adsorción con QCM, SPR, TIRF o ATR requieren una preparación especial de la superficie de los chips y sensores utilizados para los estudios de adsorción. Las superficies preparadas deben utilizarse una vez y requieren cambios al cambiar el adsorbato, debido a la inevitable hidratación de la superficie de óxido o a la posible cesteción de un sorbato. Solo se puede ejecutar una muestra a la vez utilizando ITC, QCM, SPR, TIRF o ATR, mientras que en el método de agotamiento se pueden ejecutar docenas de muestras, para las que la cantidad sólo está limitada por la capacidad del termostato y la disponibilidad de sorbente. Esto es especialmente importante cuando se procesan grandes lotes de muestras o bibliotecas de moléculas bioactivas. Es importante destacar que el método de agotamiento no requiere costosos equipos, sino únicamente un termostato.

Sin embargo, a pesar de sus ventajas obvias, el método de agotamiento requiere características procesales complejas que pueden parecer engorrosas. Este artículo presenta cómo realizar un estudio fisicoquímico completo de la adsorción de dipéptidos en TiO2 utilizando el método de agotamiento y aborda los problemas que los investigadores pueden enfrentar al realizar experimentos relevantes.

Protocolo

1. Preparación de soluciones y diluciones de redes de dipéptidos

  1. Preparación de solución de dipéptido de 16 mM
    1. Colocar 0,183 g de un dipéptido (Ile-His) (ver Tabla de Materiales)en un tubo de ensayo polimérico estéril, diluir a 35 ml con agua de doble destilación (DDW) y disolver a temperatura ambiente (RT) bajo agitación vigorosa.
      NOTA: Si el dipéptido no se disuelve en DDW mientras se agita, coloque la solución de dipéptido en un baño ultrasónico y sonicar durante unos minutos.
    2. Preparar una solución de 50 mM de 2-(N-morpholino)tampón de ácido etanesulfónico (MES) disolviendo 0.533 g de ácido etanesulfónico seco 2-(N-morpholino)en 50 ml de DDW en el tubo de ensayo estéril. Preparar una solución de hidróxido sódico de 50 ml disolviendo 200 mg de hidróxido de sodio en 100 ml de DDW.
    3. Ajuste el pH de la solución de dipéptido predisuelto a 7.4 agregando cuidadosamente (valoración de microlitros) 50 mM MES, o 50 mM de hidróxido de sodio a la solución de dipéptido de 16 mM, revolviendo en RT y monitoreando el pH con un medidor de pH. Después de ajustar el pH, vierta la solución en un cilindro de medición, enjuague el tubo de ensayo y llene el cilindro de medición con DDW a 40 ml para realizar una concentración final de 16 mM.
  2. Preparación de diluciones de dipéptidos a partir de una solución de stock de 16 mM
    1. Preparar diluciones de péptidos con concentraciones entre 0,4 y 12,0 mM diluyendo la solución de dipéptido de 16 mM con DDW. Por ejemplo, para preparar una solución de dipéptido de 8 ml, agregue 7 ml de DDW a 10 ml de la solución de dipéptido de 16 mM. Después de la dilución, ajuste el pH a 7,4 añadiendo 50 mM MES o 50 mM NaOH gota a gota a la solución de dipéptido (ver paso 1.1.3). Después de ajustar el pH, vierta la solución en un cilindro de medición, enjuague el tubo de ensayo y llene el cilindro de medición hasta 20 ml con DDW para realizar la concentración de dipéptidos de 8 mM.
      NOTA: Otras diluciones de solución de stock de dipéptidos de 16 mM con concentraciones de 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 y 12,0 mM, se preparan de acuerdo con la Figura 1. El ajuste de cada solución de dipéptido pH a 7.4 se describe en el paso 1.1.3.

2. Preparación de la titania sol

  1. Prepare una solución de 10 mM de búfer MES disolviendo 1.066 g de MES en 500 mL de DDW. Ajuste el pH a 7,4 con hidróxido de sodio seco al agitar y controlar el pH con el medidor de pH.
  2. Moler 200 mg de TiO nanocristalino2 en un mortero durante al menos 5 minutos (ver Tabla de Materiales).
  3. Pesar 40 mg de nanopartículas de dióxido de titanio molido en un matraz de laboratorio. Coloque el matraz en el baño de sonicación (ver Tabla de Materiales)utilizando el soporte de laboratorio.
  4. Añadir 20 ml de búfer MES de 10 mM en el matraz con TiO2 y sonicar en un baño ultrasónico (5 L, 40 kHz, 120 W) durante 20 min.

3. Mezcla y termostatación

  1. Ajuste el termostato (consulte Tabla de materiales) a las temperaturas deseadas (es decir, 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 o 40,00 o C).
  2. Añadir 1 ml del sol sonicado de TiO2 a los viales de adsorción marcados. Coloque los viales de adsorción marcados contra la dilución de dipéptidos correspondiente en un dispositivo de flotación improvisada hecho de espuma de poliestireno extruido. Coloque el dispositivo de flotación con los viales marcados y las diluciones de dipéptidos correspondientes en el termostato durante al menos 5 minutos.
  3. Añadir 1 ml de cada dilución dipéptido al vial de adsorción marcado correspondiente, asegurándose de que todas las soluciones de mezcla tengan la misma temperatura. Mantenga la serie de muestras de adsorción obtenidas en el termostato a 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 o 40,00 oC durante 24 h para lograr el equilibrio de adsorción.
    NOTA: Agitar con precaución todas las muestras de dispersiones obtenidas antes de ponerlas en el termostato.
  4. Ocasionalmente mezcle las dispersiones de TiO2 sacudiéndolas manualmente durante el termostato.

4. Filtración de las muestras termostatizadas

  1. Con el fin de evitar el reequilibración inducida por la temperatura, saque una muestra a la vez del termostato para la filtración.
  2. Tome una muestra de la solución de dipéptido de cada vial de vidrio con una jeringa, a través de una aguja de jeringa. Retire la aguja de la jeringa y colóquela en el filtro de la jeringa (ver Tabla de materiales)para filtrar la solución de dipéptido en el vial de vidrio. Repita la filtración con las otras muestras.
  3. Analizar el filtrado de acuerdo con la sección 5.
    NOTA: No centrifugar las muestras, ya que toma unos minutos y puede causar un cambio en el equilibrio de concentración.

5. Análisis de derivación y HPLC

  1. Hacer una solución de 50 ml de ácido trifluoroacético (TFA) en acetonitrilo. Añadir 0,34 ml de TFA en el cilindro de medición y ajustar el volumen de la solución a 50 ml con acetonitrilo en RT.
    ADVERTENCIA: Trabaje con AFC bajo una campana de humos con ventilación de escape, ya que el ácido trifluoroacético es dañino cuando se inhala, causa quemaduras graves en la piel y es tóxico para organismos acuáticos incluso a bajas concentraciones53.
  2. Preparar la solución de derivación (es decir, el reactivo Edman54) colocando 299 ol de isotiocianato de fenilo y 347 ol de trietilamina en un cilindro graduado y ajustando el volumen de la solución a 50 ml con acetonitrilo en RT.
  3. Antes del análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), deriva las muestras con el reactivo de Edman en los viales de cromatografía. Mezclar 400 l de la muestra con 400 ml del reactivo de Edman. Calentar la muestra a 60 oC durante 15 min. Después de calentar, neutralice la muestra con 225 ml de la solución de TFA y espere unos minutos para enfriar la muestra a RT.
  4. Utilice el análisis hPLC (ver Tabla de materiales)para determinar la concentración de la solución de dipéptidoantes antes y después de la adsorción. Coloque los viales de cromatografía con las soluciones analizadas en el muestreador automático HPLC y comience a analizar las muestras con las condiciones necesarias, que son establecidas por el software (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: La fase móvil consiste en 0.1% TFA en agua desionizada y acetonitrilo puro, con gradientes de acetonitrilo de 20-90% a 286 nm durante 13 min. Analizar cada muestra en triplicado. Mida la concentración de la solución de dipéptidoutilizando utilizando la curva de calibración previamente establecida(Figura 2). Para las especificaciones de cromatografía, véase Shchelokov et al.55.

Resultados

La adsorción de un dipéptido en el dióxido de titanio nanocristalino se estudió en las condiciones biocompatibles en un rango de temperatura de 0 a 40 oC. La adsorción experimental de dipéptidos (A, mmol/g) en la superficie de un dióxido de titanio se evaluó como

figure-results-383

Donde C0 y Ce ...

Discusión

La adsorción de soluciones para la construcción de isotermas requiere un tiempo más largo para el equilibrio debido a restricciones cinéticas y sorbentes con una superficie específica alta. Además, se debe considerar la inestabilidad de los solos, los agregados de nanopartículas, la cristalinidad, la distribución del tamaño de las nanopartículas, el pH de la solución y la competencia por la adsorción al adsorción de aminoácidos. Sin embargo, la construcción de isotermas de adsorción utilizando el método ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Rusa para la Investigación Básica (Concesión No. 15-03-07834-a).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acidTCI Chemicals4432-31-9MES, >98%
AcetonitrilePanreac AppliChemHPLC grade
Chromatography vialsglass
Dipeptide Ile-HisBachem4000894
Double-distilled waterDDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD"J.P. Selecta30008655 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detectorShimadzu, LC-20 ProminenceHPLC
IsopropanolSigma-Aldrich (Merck)67-63-099.70%
LabSolutions LiteShimadzu223-60410Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanateAcros Organics103-72-0PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax columnZORBAX LC150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filterVladfilter25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tubepolypropylene
Thermostat TC-502BrookfieldRefrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
TriethylamineSigma-Aldrich (Merck)121-44-8TEA; 99%
Trifluoroacetic acidPanreac AppliChem163317TFA, 99%

Referencias

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