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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il primo passo nella comprensione dell'interazione tra biomolecola e fase solida inorganica sta rivelando costanti fisico che possono essere valutate stabilendo isotermim di adsorbidimento. L'assorbemento dalla fase liquida è limitato da cinetica, capacità superficiale, pH e adsorbimento competitivo, che tutti dovrebbero essere considerati con cautela prima di impostare un esperimento di adsorbimento.

Abstract

I fondamenti delle interazioni inorganico-organiche sono di fondamentale importanza nella scoperta e nello sviluppo di nuovi biointerfaccia adatti all'utilizzo nella biotecnologia e nella medicina. Studi recenti indicano che le proteine interagiscono con le superfici attraverso siti di adsorbizione limitati. Frammenti proteici come aminoacidi e peptidi possono essere utilizzati per la modellazione dell'interazione tra macromolecole biologiche complesse e superfici inorganiche. Nel corso degli ultimi tre decenni, sono stati sviluppati molti metodi validi e sensibili per misurare i fondamentali della chimica fisica di tali interazioni: calorimetria isotermica di titore (ITC), risonanza del plasmone superficiale (SPR), microbilanciamento del cristallo di quarzo (QCM), fluescenza di riflessione interna totale (TIRF) e spettroscopia di riflessione totale attenuata (ATR).

La tecnica più semplice e conveniente per la misurazione dell'adsorption è il metodo di deplezione, in cui il cambiamento nella concentrazione di sorbate (esaurimento) dopo il contatto con il sorbente disperso nella soluzione viene calcolato e considerato adsorbito. Gli isotermi di adsordimento basati sui dati di esaurimento forniscono tutti i dati fisici di base. Tuttavia, l'adsorbimento da soluzioni richiede tempi di equilibratura più lunghi a causa di restrizioni cinetiche e sorbenti con un'area di superficie elevata specifica, rendendola quasi inapplicabile alle superfici piane fisse macroscopiche. Inoltre, fattori come l'instabilità dei sol, gli aggregati di nanoparticelle, la cristallinità sorbente, la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle, il pH della soluzione e la concorrenza per l'adsorpazione, dovrebbero essere considerati durante lo studio dei peptidi. La costruzione isotermica dei dati di esaurimento fornisce dati chimici fisici completi per letteralmente ogni sorbate solubile, ma rimane la metodologia più accessibile, in quanto non richiede configurazioni costose. Questo articolo descrive un protocollo di base per lo studio sperimentale dell'adsorbimento dei peptidi sull'ossido inorganico e copre tutti i punti critici che influenzano il processo.

Introduzione

Negli ultimi 50 anni l'interazione tra superfici inorganiche e peptidi ha attirato molta attenzione a causa della sua grande importanza nella scienza dei materiali e nella medicina. La ricerca biomedica si concentra sulla compatibilità e la stabilità delle superfici bioinorganiche, che hanno implicazioni dirette per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale1,2,3e l'impianto4,5,6,7.7 I dispositivi bioreattivi contemporanei, come sensori e attuatori, si basano su proteine funzionali immobilizzate su superfici semiconduttori di ossido8,9,10,11,12,13. Le moderne pratiche di purificazione per la produzione di proteine spesso si basano sulle proprietà di interazione delle biomolecole nella purificazione e separazione a valle14.

Tra i molteplici ossidi inorganici, il biossido di titanio rimane il più utilizzato in combinazione con substrati biologicamente rilevanti15,16. La ricerca nel settore delle biointerfacce basate su TiO2si è concentrata sulla creazione di un legame forte e specifico di proteine e peptidi senza modificarne le proprietà biologiche e strutturali. In definitiva, l'obiettivo principale è uno strato ad alta densità superficiale di biomolecole con alta stabilità e una maggiore funzionalità che faranno progredire la creazione di applicazioni biotecnologiche e mediche a base di titanio17.

Il titanio e le sue leghe sono stati ampiamente utilizzati come materiale protesico chirurgico per almeno sei decenni perché uno strato di superficie TiO2 con uno spessore di pochi nanometri è resistente alla corrosione e presenta un alto livello di biocompatibilità in molte applicazioni in vivo18,19,20. Il biossido di titanio è anche ampiamente considerato un substrato inorganico prodotto in biomineralizzazione, dove la nucleazione e la crescita in fase inorganica accompagnata da proteine e peptidi possono fornire materiali con promettenti proprietà catalitiche e ottiche21,22,23,24.

Data l'elevata rilevanza dell'interazione tra materiali inorganici e biomolecole in generale e interazioni proteina-TiO2 in particolare, sono state registrate molte ricerche per affrontare la manipolazione e il controllo dell'adsorto delle proteine su TiO2. A causa di questi studi, sono state rivelate alcune proprietà fondamentali di questa interazione, come la cinetica adsorbiente, la copertura superficiale e la conformazione di biomolecola, dando un supporto sostanziale per ulteriori progressi nelle biointerfacce5,13.

Tuttavia, la complessità delle proteine aggiunge notevoli restrizioni alla piena determinazione e comprensione dell'interazione a livello molecolare di una proteina con le superfici inorganiche. Supponendo che le biomolecole interagiscano con le superfici inorganiche attraverso siti limitati, alcune proteine con strutture note e sequenze di amminoacidi sono state ridotte ai loro componenti-peptidi e aminoacidi-che sono studiati separatamente. Alcuni di questi peptidi hanno dimostrato un'attività significativa, che li rende un soggetto unico di studi di adsorbizione senza la necessità di precedente separazione delle proteine25,26,27,28,29,30.

La caratterizzazione quantitativa dell'adsorbimento dei peptidi su TiO2 o su altre superfici inorganiche può essere realizzata mediante metodi fisici che sono stati adattati specificamente per le biomolecole negli ultimi decenni. Questi metodi includono la calorimetria di titola isotermica (ITC), la risonanza del plasmone superficiale (SPR), il microbilanciamento di cristallo di quarzo (QCM), la fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) e la spettroscopia di riflessità totale attenuata (ATR) attenuata, che consentono il rilevamento della forza di adsorptiontion fornendo dati termodinamici chiave: Legatura costante, energia libera da gibblla, enthalpy e31.

L'adsorbizione delle biomolecole al materiale inorganico può essere realizzato in due modi: 1) ITC e il metodo di esaurimento utilizzare particelle disperse in una soluzione che lega alle superfici macroscopiche fisse; 2) SPR, QCM, TIRF e ATR utilizzano superfici macroscopiche modificate con materiale inorganico, come vetro rivestito in oro o trucioli metallici, cristalli di quarzo, cristalli di solfuro di zinco e chip PMMA, rispettivamente.

La calorimetria di titola isotermica (ITC) è un metodo fisico privo di etichette che misura il calore prodotto o consumato al titolazione di soluzioni o miscele eterogenee. Le cellule calorimetriche sensibili rilevano effetti di calore fino a 100 nanojoule, rendendo possibile la misurazione del calore di adsorbinte sulle superfici delle nanoparticelle. Il comportamento termico del sorbate durante l'addizione continua, fornisce un profilo termodinamico completo dell'interazione rivelando l'enthalpy, la costante di legame e l'entropia ad una determinata temperatura32,33,34,35,36.

La spettroscopia di risonanza del plasmone superficiale (SPR) è una tecnica ottica sensibile alla superficie basata sulla misurazione dell'indice di rifrazione del supporto in prossimità della superficie studiata. Si tratta di un metodo in tempo reale e senza etichette per il monitoraggio di adsorbimento reversibile e spessore strato adsorbito. La costante di rilegatura può essere calcolata in base ai tassi di associazione e di dissociazione. Gli esperimenti di adsordimento effettuati a temperature diverse possono fornire informazioni sulla dipendenza dalla temperatura dell'energia di attivazione e in sequenza altri parametri termodinamici37,38,39.

Il metodo QCM (Quarzo Crystal Microbalance) misura il cambiamento della frequenza oscillante dei cristalli piezoelettrici durante i processi di adsorbimento e desorption. La costante di associazione può essere valutata dal rapporto tra le costanti del tasso di adsorption e desorption. QCM viene utilizzato per misurazioni di massa relative e pertanto non ha bisogno di calibrazione25,27,40. QCM viene utilizzato per l'adsorbimento da gas e liquido. La tecnica liquida permette a QCM di essere utilizzata come strumento di analisi per descrivere la deposizione su superfici variamente modificate41.

La fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) è una tecnica ottica ottica delicata basata sulla misurazione della fluorescenza dei fluorofori ad assorbimento eccitata con onde evanescenti riflesse internamente. Il metodo consente il rilevamento di molecole fluorescenti che coprono la superficie con spessori nell'ordine di decine di nanometri, motivo per cui viene utilizzato nello studio dell'adsorbizione macromolecolare su varie superfici42,43. Il monitoraggio in situ delle dinamiche di fluorescenza su adsorption e desorption forniscono la cinetica adsorbiente e quindi i dati termodinamici42,43.

La riflettanza totale attenuata (ATR) è stata utilizzata da Roddick-Lanzilotta per stabilire gli isotermi di adsorbizione lisina basati sulle bande spettrali di lisina a 1.600 e 1.525 cm-1. Questa è la prima volta che la costante di legame per un peptide su TiO2 è stata determinata utilizzando un metodo infrarosso in situ44. Questa tecnica è stata efficace nello stabilire gli isotermi per i peptidi di polilisina45 e gli amminoacidi acidi46.

A differenza dei metodi di cui sopra, dove il parametro di adsorption è misurato in situ, in un esperimento convenzionale la quantità di biomolecole adsorbite viene misurata dal cambiamento di concentrazione dopo che la superficie ha contattato la soluzione. Poiché la concentrazione di un sorbate decade in una stragrande maggioranza dei casi di adsorption, questo metodo è indicato come il metodo di esaurimento. Le misurazioni della concentrazione richiedono un saggio analitico convalidato, che può essere basato su una proprietà analitica intrinseca del sorbate o basato sull'etichettatura47,48,49,50 o derivazione51,52 dello stesso.

Gli esperimenti di adsorbimenti con QCM, SPR, TIRF o ATR richiedono una speciale preparazione superficiale dei chip e dei sensori utilizzati per gli studi di adsorbimenti. Le superfici preparate devono essere utilizzate una sola volta e richiedono un cambiamento al momento del passaggio dell'adsorbate, a causa dell'inevitabile idratazione della superficie di ossido o dell'eventuale chemisorption di un sorbate. È possibile eseguire un solo campione alla volta utilizzando ITC, QCM, SPR, TIRF o ATR, mentre nel metodo di esaurimento è possibile eseguire decine di campioni, per i quali la quantità è limitata solo dalla capacità del termostato e dalla disponibilità del termostato. Ciò è particolarmente importante quando si elaborano grandi lotti di campioni o librerie di molecole bioattive. È importante sottolineare che il metodo di esaurimento non richiede attrezzature costose, ma solo un termostato.

Tuttavia, nonostante i suoi evidenti vantaggi, il metodo di deplezione richiede caratteristiche procedurali complesse che possono sembrare ingombranti. Questo articolo presenta come eseguire uno studio fisico completo di pubblicità dipeptide su TiO2 utilizzando il metodo di esaurimento e affronta i problemi che i ricercatori possono affrontare quando eseguono esperimenti pertinenti.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni e diluizioni di dissidi

  1. Preparazione della soluzione dipeptide da 16 mM
    1. Mettere 0,183 g di un dipeptide (Ile-His) (vedi Tabella dei Materiali)in una provetta polimerica sterile, diluire a 35 mL con acqua a doppia distillazione (DDW) e sciogliere a temperatura ambiente (RT) con agitazione vigorosa.
      NOTA: Se il dipeptide non si dissolve in DDW mentre si agita, mettere la soluzione dipeptide in un bagno ad ultrasuoni e sonicare per alcuni minuti.
    2. Preparare una soluzione da 50NmM di tampone di acido etanofonico (MES) da 50 mM con 0,533 g di acido etanosonico 2-( N-morpholino) in 50 mL di DDW nella provetta sterile.N Preparare una soluzione di idrossido di sodio da 50 mM sciogliendo 200 mg di idrossido di sodio in 100 mL di DDW.
    3. Regolare il pH della soluzione di peptide predisso a 7,4 aggiungendo con attenzione (titore di microlitro) 50 mM MES, o idrossido di sodio 50 mM alla soluzione dipeptide da 16 mM, agitando la RT e monitorando il pH con un misuratore di pH. Dopo aver regolato il pH, versare la soluzione in un cilindro di misura, risciacquare la provetta e riempire il cilindro con DDW a 40 mL per fare una concentrazione finale di 16 mM.
  2. Preparazione delle diluizioni didipeptiche da una soluzione di stock da 16 mM
    1. Preparare le diluizioni dei peptidi con concentrazioni comprese tra 0,4 e 12,0 mM diluindo la soluzione di peptide da 16 m m con DDW. Ad esempio, per preparare una soluzione di peptide da 8 mM, aggiungere 7 mL di DDW a 10 mL della soluzione dipeptide da 16 mM. Dopo la diluizione, regolare il pH a 7,4 aggiungendo 50 mM MES o 50 mM NaOH goccia a goccia alla soluzione dipeptide (vedere il passaggio 1.1.3). Dopo aver regolato il pH, versare la soluzione in un cilindro di misura, risciacquare la provetta e riempire il cilindro di misura fino a 20 mL con DDW per rendere la concentrazione dipeptide 8 mM.
      NOTA: altre diluizioni di 16 mM di peptide stock soluzione con concentrazioni di 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0, e 12.0 mM, sono preparati in conformità con Figura 1. La regolazione di ogni pH della soluzione dipeptide a 7.4 è descritta nel passaggio 1.1.3.

2. Preparazione di titania sol

  1. Preparare una soluzione da 10 mM di buffer MES sciogliendo 1,066 g di MES in 500 mL di DDW. Regolare il pH a 7,4 con idrossido di sodio secco mescolando e monitorando il pH con il misuratore di pH.
  2. Macinare 200 mg di nanocristallo TiO2 in un mortaio per almeno 5 min (vedi Tabella dei Materiali).
  3. Pesare 40 mg di nanoparticelle di biossido di titanio di terra in un pallone da laboratorio. Mettere il pallone nel bagno di sonicazione (vedi Tabella dei materiali)utilizzando il supporto di laboratorio.
  4. Aggiungere 20 mL di 10 mM MES buffer nel flacone con TiO2 e sonicare in un bagno ad ultrasuoni (5 L, 40 kHz, 120 W) per 20 min.

3. Miscelazione e termosta

  1. Impostare il termostato (vedere Tabella dei materiali) alle temperature desiderate (ad esempio, 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 o 40,00 gradi centigradi).
  2. Aggiungere 1 mL del sol sonicato di TiO2 alle fiale adsorbenti marcate. Posizionare le fiale di adsortiazione contrassegnate contro la corrispondente diluizione dipeptide in un dispositivo di galleggiamento improvvisato in schiuma di polistirolo estruso. Posizionare il dispositivo di galleggiamento con le fiale marcate e le corrispondenti diluizioni dipeptide nel termostato per almeno 5 min.
  3. Aggiungere 1 mL di ogni diluizione dipeptide alla corrispondente fiala di adsorption marcata, assicurandosi che tutte le soluzioni di miscelazione abbiano la stessa temperatura. Mantenere la serie di campioni di adsortioni ottenuti sul termostato a 0,00, 10.00, 20.00, 30.00, o 40.00 C per 24 h per raggiungere l'equilibrio di adsorptioni.
    NOTA: Scuotere con cautela tutti i campioni di dispersioni ottenute prima di metterli nel termostato.
  4. Occasionalmente mescolare le dispersioni TiO2 agitandole manualmente durante la termorazione.

4. Filtrazione dei campioni termodati

  1. Al fine di evitare la riordinamento indotta dalla temperatura estrarre un campione alla volta dal termostato per la filtrazione.
  2. Prendere un campione della soluzione dipeptide da ogni fiala di vetro con una siringa, attraverso un ago di siringa. Togliere l'ago dalla siringa e mettere sul filtro della siringa (vedi Tabella dei materiali) per filtrare la soluzione dipeptide nella fiala di vetro. Ripetere la filtrazione con gli altri campioni.
  3. Analizzare il filtrato in conformità con la sezione 5.
    NOTA: Non centrifugare i campioni, perché richiede pochi minuti e può causare un cambiamento nell'equilibrio di concentrazione.

5. Derivazione e analisi HPLC

  1. Crea una soluzione da 50 mL di acido trifluoroacetico (TFA) in acetonitrile. Aggiungere 0,34 mL di TFA nel cilindro di misura e regolare il volume della soluzione a 50 mL con acetonitrile a RT.
    AVVISO: Lavorare con il TFA sotto una cappa fumata con ventilazione dello scarico, perché l'acido trifluoroacetico è dannoso quando viene inalato, provoca gravi ustioni cutanee ed è tossico per gli organismi acquatici anche a basse concentrazioni53.
  2. Preparare la soluzione di derivazione (ad esempio, Edman reagente54) mettendo 299 l di isothiocyanate fenile e 347 L di triethylamine in un cilindro graduato e regolando il volume della soluzione a 50 mL con acetonittile a RT.
  3. Prima dell'analisi della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), derivai i campioni con il reagente di Edman nelle fiale della cromatografia. Mescolare 400 l del campione con 400 l di Reagente di Edman. Riscaldare il campione a 60 gradi centigradi per 15 min. Dopo il riscaldamento, neutralizzare il campione con 225 l-l della soluzione TFA e attendere qualche minuto per raffreddare il campione in RT.
  4. Utilizzare l'analisi HPLC (vedere Tabella dei materiali) per determinare la concentrazione della soluzione dipeptide prima e dopo l'adsorbimento. Posizionare le fiale cromatografiche con le soluzioni analizzate nell'autocampione HPLC e iniziare ad analizzare i campioni con le condizioni necessarie, impostate dal software (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: La fase mobile è costituita dallo 0,1% Di TFA in acqua deionizzata e acetonitrile pura, con gradienti di acetonitrile dal 20-90% a 286 nm per 13 min. Misurare la concentrazione della soluzione dipeptide utilizzando la curva di calibrazione stabilita in precedenza (Figura 2). Per le specifiche di cromatografia vedere Shchelokov et al.55.

Risultati

L'adsorbimento di un dipeptide sul biossido di titanio nanocristalliè è stato studiato in condizioni biocompatibili in un intervallo di temperatura di 0-40 gradi centigradi. L'adsorption sperimentale di dipeptide (A, mmol/g) sulla superficie di un biossido di titanio è stato valutato come

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Dove C0 ...

Discussione

L'adsorbimento da soluzioni per la costruzione di isotermi richiede un tempo più lungo equilibrato per il tempo equilibrato a causa di restrizioni cinetiche e sorbenti con un'alta superficie specifica. Inoltre, l'instabilità dei sol, gli aggregati di nanoparticelle, la cristallinità, la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle, il pH della soluzione e la concorrenza per l'assorbimento dovrebbero essere considerati durante l'assorbimento degli amminoacidi. Tuttavia, adsorgendo costruzione isoterma utilizzand...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Fondazione russa per la ricerca di base (Grant no.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acidTCI Chemicals4432-31-9MES, >98%
AcetonitrilePanreac AppliChemHPLC grade
Chromatography vialsglass
Dipeptide Ile-HisBachem4000894
Double-distilled waterDDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD"J.P. Selecta30008655 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detectorShimadzu, LC-20 ProminenceHPLC
IsopropanolSigma-Aldrich (Merck)67-63-099.70%
LabSolutions LiteShimadzu223-60410Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanateAcros Organics103-72-0PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax columnZORBAX LC150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filterVladfilter25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tubepolypropylene
Thermostat TC-502BrookfieldRefrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
TriethylamineSigma-Aldrich (Merck)121-44-8TEA; 99%
Trifluoroacetic acidPanreac AppliChem163317TFA, 99%

Riferimenti

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