המחקר של פפטיד קצר ספיחה על פתרון מפוזרים חלקיקים אורגניים באמצעות שיטת המחסור

Summary

הצעד הראשון בתוך ההבנה של ביואוכאל-אורגני אינטראקציה שלב מוצק הוא חושף קבועים פיזיקליים הבסיסיים שניתן להעריך על ידי הקמת is, מערכת הספיחה. ספיחה מן השלב הנוזלי מוגבל על ידי קינטיקה, קיבולת פני השטח, pH, ו ספיחה תחרותי, אשר כל צריך להיחשב בזהירות לפני הגדרת ניסוי ספיחה.

Abstract

היסודות של אינטראקציות אורגניים-אורגני הם חשובים באופן ביקורתי בגילוי ופיתוח של הביוממשקים הרומן הקלה לניצול ביוטכנולוגיה ורפואה. מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי חלבונים אינטראקציה עם משטחים באמצעות אתרי ספיחה מוגבלת. שברי חלבונים כגון חומצות אמינו ופפטידים ניתן להשתמש עבור מידול אינטראקציה בין משטחים ביולוגיים מורכבים קרו ו אורגניים. במהלך שלושת העשורים האחרונים פותחו שיטות חוקיות ורגישות רבות כדי למדוד את יסודות הכימיה הפיזית של האינטראקציות האלה: איזותרמי טיטור calorimetry (התקשורת החשמלית), משטח התהודה של המשטח (spr), קוורץ מיקרו איזון גביש (qcm), השתקפות פנימית מוחלטת (טיטור), ומחליש השתקפות

הטכניקה הפשוטה והזולה ביותר למדידת הספיחה היא שיטת המחסור, שם השינוי בריכוז sorbate (דלדול) לאחר מגע עם הפתרון-מפוזר sorכופפים מחושב והניחו להיות ספיחה. מבוסס על נתוני מחסור לספק את כל הנתונים פיזיקליים בסיסיים. עם זאת, ספיחה מתוך פתרונות דורש שעות ארוכות יותר בגלל הגבלות קינטי ו סורבנטים עם שטח מסוים גבוה המשטח, מה שהופך אותו כמעט בלתי ישימה משטחי המטוס קבוע מאקרוסקופי. יתר על כן, גורמים כגון חוסר יציבות של sols, ננו-חלקיק אגרגטים, אחרים-סורבנטים crystallinity, התפלגות ננו-חלקיק גודל, pH של הפתרון, ותחרות עבור adsorption צריך להיחשב תוך לימוד פפטידים adsorption. מחסור בנתונים הבנייה מספק נתונים כימיה פיזיים מקיפה עבור פשוטו כמשמעו כל sorbate מסיסים עדיין נשאר המתודולוגיה הנגישה ביותר, כפי שהוא אינו דורש הגדרות יקרות. מאמר זה מתאר פרוטוקול בסיסי למחקר ניסיוני של פפטיד ספיחה על תחמוצת אורגנית מכסה את כל הנקודות הקריטיות המשפיעות על התהליך.

Introduction

במשך 50 השנים האחרונות האינטראקציה בין משטחים אורגניים ופפטידים משכו הרבה תשומת לב בשל חשיבותו הגבוהה במדעי החומר ורפואה. מחקר ביו-רפואי מתמקד בתאימות וביציבות של משטחים ביו-אורגניים, שיש להם השלכות ישירות לרפואה משובי, הנדסת רקמות^1,2,3, והשרשה^4,5,6,7. מכשירים ביומטריים עכשוויים, כגון חיישנים ומפעילים, מבוססים על חלבונים פונקציונליים מקיבוע על תחמוצת וליכים משטחים^{8,9,10,11,12,13}. שיטות טיהור מודרניות לייצור חלבונים מסתמכות לעתים קרובות על תכונות של אינטראקציה ביואלוכאל בתוך הזרם לטיהור והפרדה¹⁴.

בין תחמוצות אורגניים מרובות, תחמוצת טיטניום נשאר מנוצל ביותר בשילוב עם מצעים רלוונטיים ביולוגית^15,16. מחקר באזור של ממשקי ביולוגי מבוססי TiO₂התמקדה בהקמת מחייב חזק וספציפי של חלבונים ופפטידים מבלי לשנות את המאפיינים הביולוגיים שלהם מבנית. בסופו של דבר, המטרה העיקרית היא שכבת צפיפות גבוהה של פני השטח של biomolecules עם יציבות גבוהה ופונקציונליות מוגברת אשר יקדם את היצירה של יישומים מבוססי טיטניום ביו ורפואיים¹⁷.

טיטניום וסגסוגות שלה כבר נעשה שימוש נרחב כמו חומר השתל כירורגי עבור לפחות שישה עשורים משום משטח TiO₂ שכבה עם עובי של כמה ננומטר הוא עמיד בפני קורוזיה ומציג רמה גבוהה של תאימות רבים ב vivo יישומים^18,19,20. טיטניום דו-חמצני נחשב גם למצע אי-אורגנית המופק ביומינרליזציה, שם הנוקלאוציה וצמיחה בפאזה אורגנית המלווה בחלבונים ופפטידים עשויים לספק חומרים עם תכונות קטליטיים ואופטיות מבטיחות^21,22,23,24.

לאור הרלוונטיות הגבוהה של האינטראקציה בין חומרים אורגניים וbiomolecules באופן כללי, חלבון-TiO₂ אינטראקציות בפרט, יש כבר הרבה מחקר כדי לטפל מניפולציה ושליטה של הספיחה של חלבונים על TiO₂. בשל מחקרים אלה, נחשפו כמה מאפיינים בסיסיים של האינטראקציה הזאת, כגון קינטיקה של ספיחה, כיסוי פני השטח, ומערך ביולוגי, המעניק תמיכה ניכרת להתקדמות נוספת בביו-ממשקים^5,13.

עם זאת, מורכבות החלבון מוסיפה הגבלות משמעותיות על נחישות והבנה מלאה של האינטראקציה ברמה המולקולרית של חלבון עם משטחים אורגניים. בהנחה כי biomolecules אינטראקציה עם משטחים אורגניים באמצעות אתרים מוגבלים, כמה חלבונים עם מבנים ידועים רצפי חומצות אמינו הופחת הרכיבים שלהם-פפטידים וחומצות אמינו-אשר נחקרו בנפרד. כמה פפטידים אלה הפגינו פעילות משמעותית, מה שהופך אותם נושא ייחודי של לימודי ספיחה ללא צורך הפרדת חלבון הקודם^{25,26,27,28,29,30}.

אפיון כמותי של פפטיד ספיחה על TiO₂ או משטחים אורגניים אחרים ניתן להשיג באמצעות שיטות פיזיות כי הותאמו במיוחד עבור biomolecules בעשורים האחרונים. שיטות אלה כוללות איזותרמי טיטור קלורימטריה, (spr), גביש קוורץ מיקרו-מאזן (qcm), השתקפות פנימית מלאה (טיטור), ומחליש את ההשתקפות הכוללת השתקפות (atr), שכולם מאפשרים זיהוי של חוזק הספיחה על-ידי מתן נתוני מפתח תרמודינמיים: הקבוע המחייב, אנרגיה חופשית של גיבס, אנתלפיה ואנטרופיה³¹.

הספיחה של biomolecules אל החומר האורגני עשוי להתבצע בשתי דרכים: 1) באופן מושלם, כמו גם שיטת דלדול להשתמש חלקיקים התפזרו בכריכה הפתרון למשטחים מאקרוסקופי קבוע; 2) SPR, QCM, TIRF, ו ATR להשתמש משטחים מאקרוסקופיים שונה עם חומר לא אורגני, כגון זכוכית מצופה זהב או שבבי מתכת, קריסטלים קוורץ, קריסטלים גופרתי אבץ, ו PMMA אסימונים, בהתאמה.

איזותרמי טיטור קלורימטריה היא שיטה פיזית נטולת תוויות המודד את החום המופק או נצרך על-ידי טיטור של פתרונות או תערובות הטרוגניות. תאים קלוריטריים רגישים לזהות אפקטי חום קטנים כמו 100 ננוג'לס, מה שהופך את המדידה של חום ספיחה על משטחים ננו-חלקיק אפשרי. התנהגות תרמית של sorbate במהלך תוספת רציפה-titration, מספק פרופיל תרמודינמי מלא של האינטראקציה חשיפת enthalpy, מחייב קבוע, ואנטרופיה בטמפרטורה נתונה^{32,33,34,35,36}.

ספקטרוסקופית משטח (SPR) ספקטרוסקופיה היא טכניקה אופטית תלויית-שטח המבוססת על מדידת מדד השבירה של התקשורת בקרבת משטח למדה. זוהי שיטה בזמן אמת, ללא תווית עבור ניטור ספיחה הפיך ועובי שכבת ספיחה. ניתן לחשב את הקבוע המחייב מהשיוך וקצבי הדיסוציאציה. ניסויים adsorption שבוצעו בטמפרטורות שונות עשויים לספק מידע על התלות בטמפרטורה של אנרגיית ההפעלה ברציפות פרמטרים תרמודינמיים אחרים^37,38,39.

גביש הקוורץ מיקרומאזן (QCM) מודד את השינוי בתדירות הנדנוד של גבישים פיזואלקטריים במהלך תהליכי הספיחה והספיחה. ניתן להעריך את קבוע האיגוד מיחס הקבועים של שיעור הספיחה והדסורזיה. Qcm משמש מדידות המסה יחסית ולכן, אין צורך כיול^25,27,40. QCM משמש לספיחה משני הגזים והנוזלים. הטכניקה הנוזלית מאפשרת QCM לשמש ככלי ניתוח לתיאור התצהיר על משטחים ששונו באופן שונה⁴¹.

השתקפות פנימית מלאה (TIRF) היא טכניקה אופטית הפנים אופטי המבוסס על המדידה של הזריחה של האדסוורההואנפלאז מתרגש עם גלי אוונסי ביטוי פנימי. השיטה מאפשרת זיהוי של מולקולות פלורסנט המכסים את פני השטח עם עוביים על סדר של עשרות nanometers, ולכן הוא משמש במחקר של macromolecular ספיחה על משטחים שונים^42,43. במעקב באתרו של הדינמיקה של הקרינה הפלואורסצנטית על ספיחה ו desorption לספק את קינטיקה ספיחה ומכאן נתונים תרמודינמיים^42,43.

השתקפות כוללת של מחליש (ATR) שימש את השימוש על ידי רודפין-לנגיוטה כדי ליצור שיטת ליזין מבוסס על הלהקות ליזין ספקטרל ב 1,600 ו 1,525 ס"מ^-1. זוהי הפעם הראשונה כי קבוע הכריכה עבור פפטיד ב-TiO₂ נקבע באמצעות שיטה באתרו אינפרא אדום⁴⁴. טכניקה זו הייתה יעילה ביצירת ספיחה איזוטרציאמים עבור פפטידים רב ליזין⁴⁵ ו חומצות אמינו חומצה חומצי⁴⁶.

שלא כמו השיטות הנ ל, שבו הפרמטר ספיחה נמדד באתרו, בניסוי קונבנציונאלי את כמות הספיחה biomolecules נמדד על ידי שינוי הריכוז לאחר פני השטח יצרה קשר עם הפתרון. בגלל הריכוז של sorbate נרקב ברוב המכריע של המקרים ספיחה, שיטה זו נקראת שיטת דלדול. מדידות הריכוז דורשות שיטת ניתוח אנליטית מאומתת, שעשויה להתבסס על המאפיין האנליטי הפנימי של sorbate או מבוסס על התיוג^47,48,49,50 או לדבטיזציה^51,52 ממנו.

ניסויים ספיחה באמצעות qcm, spr, tirf, או atr דורשים הכנת פני השטח המיוחד של שבבים וחיישנים המשמשים למחקרים ספיחה. משטחים מוכנים צריך לשמש פעם ולדרוש שינוי על ידי החלפת adsorbate, בשל הידרציה בלתי נמנעת של משטח תחמוצת או כימוזיה אפשרי של sorbate. רק מדגם אחד בכל פעם יכול להיות מופעל באמצעות החום, qcm, spr, tirf, או atr, ואילו בשיטת דלדול אחד יכול להפעיל עשרות דגימות, שעבורן הכמות מוגבלת רק על ידי קיבולת התרמוסטט ואת הזמינות אחרים-סורבנטים. דבר זה חשוב במיוחד בעת עיבוד אצוות או ספריות של מולקולות ביו-אקטיביות גדולות. חשוב מכך, שיטת המחסור אינה דורשת ציוד יקר אלא תרמוסטט בלבד.

עם זאת, למרות היתרונות הבולטים שלו שיטת הדלדול דורש תכונות פרוצדורליים מורכבים שעלולים להיראות מסורבלת. מאמר זה מציג כיצד לבצע מחקר מקיף כימי פיסיוכימיה של dipeptide ספיחה על TiO₂ באמצעות שיטת דלדול וכתובות בעיות שחוקרים יכולים להתמודד בעת ביצוע ניסויים רלוונטיים.

Protocol

1. הכנת פתרונות מניות דיפפטיד ודילול

1. הכנת תמיסת דיפפטיד 16 מ"מ
   1. מקום 0.183 g של דיפפטיד (Ile-שלו) (ראה טבלת חומרים) במבחנה סטרילי בדיקה פולימריים, לדלל ל 35 mL עם מים כפולים מזוקקים (ddw), ומתמוסס בטמפרטורת החדר (RT) תחת ערבוב נמרץ.
      הערה: אם הדיפפטיד אינו מתמוסס ב-DDW תוך כדי ערבוב, הניחו את התמיסה הדיפפטיד לתוך אמבט קולי וsonicate לכמה דקות.
   2. הכנת פתרון 50 mM של 2-(N-מורגולינו) מאגר חומצה ethanesulfonic על ידי המסת 0.533 g של יבש 2-(N-מורגוולסטינו) חומצה ethanesulfonic ב 50 מ ל של ddw במבחנה סטרילי. להכין 50 mM נתרן הידרוקסיד הפתרון על ידי המסת 200 mg של נתרן הידרוקסיד ב 100 mL של DDW.
   3. להתאים את ה-pH של הפתרון dipeptide מראש כדי 7.4 על ידי הוספה בזהירות (titration microliter מיקרוליטר) 50 mM MES, או 50 mM נתרן הידרוקסידי ל 16 הפתרון dipeptide, ערבוב ב RT וניטור ה-pH עם מד pH. לאחר התאמת ה-pH, יוצקים את הפתרון לתוך גליל מדידה, לשטוף את צינור הבדיקה, ולמלא את גליל מדידה עם DDW ל 40 mL לעשות ריכוז סופי של 16 מ"מ.
2. הכנת דיפפטיד מתמיסה של 16 מ"מ במניה
   1. הכינו מדיקות פפטיד עם ריכוזים בין 0.4 ו 12.0 mM על ידי דילול 16 הפתרון dipeptide m עם DDW. לדוגמה, כדי להכין פתרון מסוג dipeptide בעובי 8 מ"מ, הוסף 7 מ ל עד 10 מ ל של הפתרון הדיפפטיד של 16 מ"מ. לאחר דילול, להתאים את ה-pH כדי 7.4 על ידי הוספת 50 mM MES או 50 מילימטר NaOH ירידה על ידי ירידה לפתרון dipeptide (ראה שלב 1.1.3). לאחר התאמת ה-pH, יוצקים את הפתרון לתוך גליל מדידה, לשטוף את צינור הבדיקה, ולמלא את גליל מדידה עד 20 מ ל עם DDW כדי להפוך את הריכוז dipeptide 8 מ"מ.
      הערה: מדלל אחרים 16 פתרון מניות dipeptide מילימטר עם ריכוזים של 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0, ו 12.0 מ"מ, מוכנים בהתאם לאיור 1. ההתאמה של כל התמיסה dipeptide pH כדי 7.4 מתואר בשלב 1.1.3.

2. הכנת טיטניה סול

1. להכין פתרון 10 מ"מ של מאגר MES על ידי המסת 1.066 g של MES ב 500 mL של DDW. להתאים את ה-pH כדי 7.4 עם הידרוקסיד נתרן יבש על ערבוב וניטור ה-pH עם מד pH.
2. טוחנים 200 מ"ג של nanocryסטולמן TiO₂ בחומר מליטה לפחות 5 דקות (ראה טבלת חומרים).
3. שוקלים 40 מ"ג של חלקיקים טיטניום דו תחמוצת הקרקע לתוך בקבוקון מעבדה. הכניסו את הבקבוקון לאמבט הsonication (ראו טבלת חומרים) באמצעות דוכן המעבדה.
4. הוסף 20 מ מ של 10 מ"מ מאגר MES לתוך הבקבוקון עם TiO₂ ו sonicate באמבטיה אולטראסוניות (5 L, 40 kHz, 120 W) עבור 20 דקות.

3. ערבוב וחום

1. הגדר את התרמוסטט (ראה טבלת חומרים) לטמפרטורות הרצויות (כלומר, 0.00, 10.00, 20.00, 30.00, או 40.00 ° c).
2. הוסף 1 מ ל של sonicated sol של TiO₂ לתוך בבקבוקונים מסומנים ספיחה. מניחים את מבחנות ספיחה מסומנים נגד דילול דיפפטיד המקביל במכשיר ציפה מאולתר עשוי פוליסטירן מוקצף הבלטת קצף. מניחים את המכשיר ציפה עם הבקבוקונים מסומנים ודיפפטיד המקביל לתוך התרמוסטט לפחות 5 דקות.
3. הוסף 1 מ ל של כל דילול dipeptide כדי בקבוקון ספיחה מסומן המקביל, וודא כי כל הפתרונות ערבוב יש את אותה טמפרטורה. שמור את הסדרה של דגימות ספיחה המתקבלים על התרמוסטט ב 0.00, 10.00, 20.00, 30.00, או 40.00 ° צ' עבור 24 שעות כדי להשיג את שיווי משקל ספיחה.
   הערה: ללחוץ בזהירות את כל הדגימות של הדיבולים שהתקבלו לפני הכנסתו לתרמוסטט.
4. מדי פעם לערבב את TiO 2 דיספרסיות על ידי באופן ידני לטלטל אותם במהלך_{התרמותיים} .

4. סינון הדגימות התרמוד,

1. כדי למנוע הפחתת משקל הטמפרטורה הנגרמת לקחת דגימה אחת בכל פעם מתרמוסטט לסינון.
2. קח דגימה של פתרון dipeptide מכל בקבוקון זכוכית עם מזרק, דרך מחט מזרק. הסר את המחט מן המזרק ולשים על מסנן מזרק (ראה טבלת חומרים) כדי לסנן את הפתרון dipeptide לתוך בקבוקון זכוכית. חזור על הסינון עם הדגימות האחרות.
3. לנתח את הפילטרט לפי סעיף 5.
   הערה: אל צנטריפוגה את הדגימות, כי זה לוקח כמה דקות ועלול לגרום לשינוי בשיווי משקל הריכוז.

5. ניתוח הוראות לדריפיקציה ואנליזה

1. להפוך פתרון 50 mL של חומצה trifluoroacetic (TFA) ב acetonitrile. הוסף 0.34 mL של TFA בצילינדר מדידה ולהתאים את נפח הפתרון ל 50 mL עם acetonitrile ב RT.
   התראה: עבודה עם TFA תחת מכסה המנוע עם אוורור פליטה, כי חומצה trifluoroacetic מזיקה כאשר שאפה, גורם כוויות עור חמורות, והוא רעיל אורגניזמים ימיים גם בריכוזים נמוכים⁵³.
2. הכינו את פתרון הדריבטיזציה (כלומר, אידמן מגיב⁵⁴) על ידי הצבת 299 μl של פניאיל isothiocyanate ו 347 μl של triethylamine בצילינדר הדרגתי וכוונון נפח הפתרון 50 mL עם acetonitrile ב RT.
3. לפני ניתוח האבחון הגבוה של הכרומטוגרפיה הנוזלית, למעשה הדגימות מהמגיב הכימית של אדמן בדגימות הכרומטוגרפיה. מערבבים 400 μL של המדגם עם 400 μL של מגיב הכימית של דמן. לחמם את המדגם ב 60 ° c עבור 15 דקות. לאחר החימום, לנטרל את המדגם עם 225 μL של הפתרון TFA ולחכות כמה דקות כדי לצנן את המדגם כדי RT.
4. השתמש בניתוח האבחון (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את ריכוז הפתרון הדיפפטיד לפני ואחרי ספיחה. הניחו את מבחנות הכרומטוגרפיה בעזרת הפתרונות שנותחו לתוך האבחון האוטומטי והתחילו לנתח את הדגימות בתנאים הנחוצים, הנקבעו על-ידי התוכנה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: השלב הנייד מורכב מ-0.1% TFA במים מפוהים ובאספניטריל טהור, עם מעברי הצבע של acetonitrile מ 20-90% ב 286 nm עבור 13 דקות.. לנתח כל מדגם בטרילקאט למדוד את הריכוז פתרון דיפפטיד באמצעות עקומת כיול שהוקמה בעבר (איור 2). למפרטי כרומטוגרפיה ר' שכלקוב ואח '⁵⁵.

תוצאות

ספיחה של דיפפטיד על nanocryסטולמן טיטניום דו-חמצני נחקר בתנאים הביוגרפים בטווח טמפרטורות של 0-40 ° c. ספיחה ניסיונית דיאטנית (A, mmol/g) על פני השטח של תחמוצת טיטניום הוערך כמו

כאשר c_0<...

Discussion

ספיחה מתוך פתרונות עבור בנייה is, דורש זמן רב יותר עבור הרמה עקב הגבלות הקינטי ומסורבי עם שטח מסוים גבוה הקרקע. יתר על כן, חוסר יציבות של sols, ננו-חלקיק אגרגטים, crystallinity, התפלגות ננו-חלקיק גודל, pH של הפתרון, ואת התחרות עבור ספיחה צריך להיחשב בזמן ספיחה חומצות אמינו. עם זאת, הבנייה is, ספיחה באמצעות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid	TCI Chemicals	4432-31-9	MES, >98%
Acetonitrile	Panreac AppliChem		HPLC grade
Chromatography vials			glass
Dipeptide Ile-His	Bachem	4000894
Double-distilled water			DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD"	J.P. Selecta	3000865	5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector	Shimadzu, LC-20 Prominence		HPLC
Isopropanol	Sigma-Aldrich (Merck)	67-63-0	99.70%
LabSolutions Lite	Shimadzu	223-60410	Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2			Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate	Acros Organics	103-72-0	PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column	ZORBAX LC		150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter	Vladfilter		25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube			polypropylene
Thermostat TC-502	Brookfield		Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine	Sigma-Aldrich (Merck)	121-44-8	TEA; 99%
Trifluoroacetic acid	Panreac AppliChem	163317	TFA, 99%