Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

Resumen

Las propagaciones de superficies nucleares son una herramienta indispensable para estudiar los eventos cromosómicos durante la meiosis. Aquí demostramos un método para preparar y visualizar cromosomas meióticos durante la profase I a partir de espermacitos de peces brabra.

Resumen

La meiosis es el proceso celular clave necesario para crear gametos haploides para la reproducción sexual. Los organismos modelo han sido fundamentales para comprender los eventos cromosómicos que tienen lugar durante la profase meiótica, incluidos los eventos de emparejamiento, sinapsis y recombinación que aseguran la segregación cromosómica adecuada. Mientras que el ratón ha sido un modelo importante para entender los mecanismos moleculares subyacentes a estos procesos, no todos los eventos meióticos en este sistema son análogos a la meiosis humana. Recientemente demostramos el emocionante potencial del pez cebra como modelo de espermatogénesis humana. Aquí describimos, en detalle, nuestros métodos para visualizar cromosomas meióticos y proteínas asociadas en preparaciones de propagación cromosómica. Estas preparaciones tienen la ventaja de permitir el análisis de alta resolución de las estructuras cromosómicas. En primer lugar, describimos el procedimiento para disección de testículos de peces cebra adultos, seguido de disociación celular, lisis y propagación de los cromosomas. A continuación, describimos el procedimiento para detectar la localización de proteínas cromosómicas meióticas, mediante la detección de inmunofluorescencia, y secuencias de ácido nucleico, mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH). Estas técnicas comprenden un conjunto útil de herramientas para el análisis citológico de la arquitectura de la cromatina meiótica en el sistema de peces cebra. Los investigadores de la comunidad de peces cebra deben ser capaces de dominar rápidamente estas técnicas e incorporarlas a sus análisis estándar de la función reproductiva.

Introducción

La reproducción sexual procede a través de la combinación de dos gametos haploides, cada uno llevando la mitad del complemento cromosómico de una célula somática. La meiosis es una división celular especializada que produce gametos haploides a través de una ronda de replicación del ADN y dos rondas sucesivas de segregación cromosómica. En la profase I, los cromosomas homólogos (homólogos) deben someterse a emparejamiento, recombinación y sinapsis, el último de los cuales se caracteriza por la formación del complejo sinntántmal que comprende dos ejes homólogos puenteados por el filamento transversal, Sycp1(Figura 1A,B). La falta de ejecución adecuada de estos procesos puede conducir a la producción de gametos aneuploides, que son una causa principal de abortos espontáneos en los seres humanos¹. Nuestro conocimiento de la coordinación entre emparejamiento, recombinación y sinapsis ha sido facilitado por estudios en una amplia gama de organismos, como levadura, C. elegans,ratón, y Drosophila,entre otros^2. Si bien el proceso general de emparejamiento cromosómico homólogo seguido de segregación está bien conservado, su dependencia de la recombinación y la sinapsis y el orden de estos eventos varía.

La formación meiotica de rotura de doble cadena (DSB), que inicia una recombinación homóloga, se produce cerca de telómeros agrupados en el ramo durante el leptoteno y la sinapsis se produce poco después de^3,4. Esta configuración de la formación DSB y la iniciación de la sinapsis es también una característica de la meiosis masculina en los seres humanos pero no en el ratón^5,6,7,8, lo que sugiere que el pez cebra puede servir como modelo para la espermatogénesis humana. También hay varias ventajas prácticas de estudiar la meiosis de pez cebra. Tanto los machos como las hembras se someten a gametogénesis a lo largo de la edad adulta, sus gónadas son fácilmente accesibles, y cientos de crías se generan a partir de una sola cruz. Además, los embriones son transparentes y se desarrollan externamente, lo que facilita la detección precoz de aberraciones en el desarrollo embrionario debido a los gametos aneuploides^3,9. Las desventajas de utilizar peces cebra son que son lentos para alcanzar la madurez sexual (60 días) y la cantidad de material necesario para las propagaciones de superficie nuclear debe recogerse de 10-20 animales adultos, dependiendo de su tamaño.

Las preparaciones de propagación cromosómica meiótica son una herramienta vital para estudiar la dinámica cromosómica en todos los organismos modelo, ya que se pueden sondear las firmas clave de la dinámica cromosómica meiótica. En el pez cebra, se han diseccionado aspectos clave de la progresión del programa meiótico y de la organización nuclear mediante sondeos de propagaciones superficiales nucleares, denominadas aquí diseminas cromosómicas, con anticuerpos para la detección de inmunofluorescencia de proteínas y/o ácidos nucleicos por FISH^{3,4,9,10,11,12}. De hecho, la localización polarizada de telómeros agrupados en el ramo se puede conservar en la preparación de propagación(Figura 1C). Recientemente, hemos utilizado propagaciones cromosómicas de espermacitos de peces cebra junto con métodos de detección de fluorescencia y microscopía de superresolución para dilucidar la progresión detallada de la dinámica de los telómeros de pez cebra, el emparejamiento de cromosomas homólogos, la localización de roturas de doble cadena y la sinapsis en transiciones meióticas clave^3. Aquí presentamos métodos para preparar las propagaciones cromosómicas de los espermismocitos de los testículos de peces cebra y posteriormente mancharlos con sondas de ácido nucleico péptido fluorescente (AnP) a secuencias repetidas de telómeros y detección de inmunofluorescencia de proteínas asociadas al cromosoma.

Protocolo

Todos los métodos relacionados con el pez cebra se llevaron a cabo utilizando normas éticas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Davis.

1. Procedimiento de propagación del cromosoma

NOTA: El siguiente protocolo está diseñado para crear 4-6 diapositivas, con cientos de núcleos meióticos extendidos por diapositiva. El número de testículos utilizados dependerá del tamaño del pez. Prepárese para utilizar 20 animales a los 60 días posteriores a la fertilización (dpf) y 15 animales a los 6 meses posteriores a la fertilización (mpf). Para peces cebra grandes (por ejemplo, 12 mpf) 10 animales deben ser suficientes. Tenga en cuenta que los testículos de algunos mutantes meióticos (por ejemplo, spo11^-/-) serán algo más pequeños³. En este protocolo, un grupo de testículos se considera como una sola muestra. Se recomienda que no se preparen más de 4 muestras en paralelo.

1. Realice las siguientes soluciones antes de iniciar el procedimiento de propagación
   NOTA: Es conveniente preparar las siguientes soluciones en las cantidades especificadas para su uso en futuros experimentos de propagación.
   1. Preparar una solución de sacarosa de 0,1 M disolviendo 3,42 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada. Lleve la solución de sacarosa al pH 8 utilizando 1 M Tris-HCl que también está en pH 8. A continuación, filtre la solución de sacarosa. Conservar a temperatura ambiente.
   2. Hacer una solución salina 10x con fosfato (PBS) a una concentración final de 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na₂HPO₄ y 27,6 mM KH₂PO₄ en 1,8 L de agua destilada. Revuelva hasta que se disuelva, luego ajuste el pH a 7.3 usando NaOH y autoclave. Conservar a temperatura ambiente.
   3. Hacer una solución DNase I de 400 g/ml en agua destilada estéril. Conservar a -20oC. Se recomienda preparar 5 ml de esta solución y luego almacenar como alícuotas de 100 l.
2. Haga las siguientes soluciones el día del protocolo de difusión
   NOTA: Para la eficiencia del tiempo, lo mejor es hacer la solución de colagenasa inmediatamente después de disuado todos los testículos y luego hacer las soluciones inhibidoras de tripina y trippsina durante el tiempo que las muestras están siendo tratadas en colagenasa.
   1. Disolver 4 mg de colagenasa en 200 ml del medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco por muestra (concentración final de colagenasa del 2% p/v). Manténgase en hielo hasta que sea necesario. La colagenasa disociará a los testículos.
   2. Disolver 1,4 mg de tripsina en 200 ml de DMEM por muestra (0,7% p/v de concentración final de trippsina). Manténgase en hielo hasta que sea necesario. La trippsina ayudará a disociar las células.
   3. Disolver 10 mg de inhibidor de la tripsina en 500 ml de DMEM por muestra (concentración final del inhibidor de la trippsina del 2% p/v). Manténgase en hielo hasta que sea necesario. El inhibidor de la trippsina evita que la trippsina degrade las células.
   4. Prepare una solución de formaldehído al 1% (a partir de una solución prefabricada del 16%) con 0,15% de Triton X-100 en agua destilada estéril. Manténgase en hielo hasta que sea necesario. El 1% de formaldehído se puede preparar mientras los testículos están siendo tratados con trippsina y DNase I (es decir, durante el paso 1.4.7 del procedimiento de propagación).
      ADVERTENCIA: El formaldehído es peligroso.
3. Disección de testículos de peces cebra macho adultos
   1. Eutanasia el pez cebra macho (> 60 dpf) sumergiéndolos en agua helada. Los peces pueden mantenerse en agua helada hasta que estén listos para diseccionar, sin embargo, deben ser diseccionados tan pronto como sea posible.
      NOTA: La cepa de tipo salvaje AB se utiliza para este procedimiento, pero otras cepas de tipo salvaje también deben ser susceptibles. El tiempo más largo que hemos mantenido los peces en agua helada antes de la diselación es 3 h sin ningún efecto notable en el protocolo.
   2. Decapitar un pez a la vez con tijeras pequeñas y luego usar micro tijeras para cortar a lo largo de la línea media ventral para exponer la cavidad del cuerpo.
   3. Diseccionar los testículos usando fórceps (ver Tabla de Materiales)a 1,65x aumento bajo un microscopio. Lleve a cabo las disecciones en un plato Petri recubierto de silicona con cubierto por una piscina poco profunda de 1x PBS.
      NOTA: El testículo se encuentra entre la vejiga de baño y el intestino y aparecerá más ligero que el tejido muscular(Figura 2A). Los testículos deben tener 2 lóbulos cuando se retiran del pez cebra(Figura 2B).
   4. Retire la mayor cantidad posible de grasa y tejido circundante de los testículos. A continuación, agregue cada testículo diseccionado directamente en un tubo de 5 ml con 2 ml de DMEM y manténgalo en hielo.
      NOTA: Los pasos 1.3.3 y 1.3.4 deben dominarse antes de realizar cualquier experimento.
4. Disociación de células de testículos
   1. Precalentamiento 100 mL de solución de sacarosa de 0,1 M a 37oC.
   2. Añadir 200 ml de solución de colagenasa al tubo de 5 ml con los testículos. Mezcle la solución invirtvirtándola varias veces.
   3. Agitar suavemente los testículos en una coctelera de incubadora horizontalmente a 100 rpm a 32 oC durante 50 minutos a una hora hasta que el DMEM esté turbio y los testículos estén en pequeños trozos. Invierta rápidamente el tubo cada 10 minutos para facilitar la disociación.
   4. Para lavar la colagenasa, añadir DMEM a un volumen final de 5 ml e invertir el tubo unas cuantas veces. Pellet los testículos a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retire 3 ml del sobrenadante de modo que sólo queden 2 ml.
      NOTA: La adición, eliminación y transferencia de DMEM se realiza con pipetas de transferencia de plástico para la totalidad del procedimiento de propagación cromosómica.
   5. Repita el paso 1.4.4 dos veces más para un total de 3 lavados DMEM. No resuspenda el pellet entre lavados DMEM. Después del último lavado DMEM, retire 4 ml del sobrenadante de modo que sólo quede 1 ml.
   6. Añadir 1 ml de DMEM para un volumen total de 2 ml y añadir 200 ml de la solución de trippsina y 20 ml de solución DNase I. Invierta el tubo varias veces para mezclar la solución.
   7. Agitar horizontalmente el tubo a 32 oC durante 5-15 minutos a 100 rpm hasta que la solución DMEM contenga sólo unos pocos grumos. Invierta rápidamente el tubo cada 5 minutos para facilitar la disociación.
      NOTA: Los grumos deben ser considerablemente más pequeños después de agitar.
   8. Añadir 500 l de la solución inhibidora de la trippsina y 50 ml de solución de DNase I. Invierta el tubo unas cuantas veces para mezclar, luego gire brevemente hacia abajo a 200 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente para eliminar el líquido o los grumos que puedan adherirse a la tapa del tubo o al lado del tubo.
   9. Coloque el tubo sobre hielo y vuelva a suspender la suspensión celular pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de transferencia de plástico durante 2 minutos para facilitar la disociación de los grumos restantes. No deje que la suspensión celular entre en la bombilla de la pipeta de transferencia. Después de los 2 minutos, pipetear la suspensión de nuevo en el tubo de 5 ml.
   10. Humedezca previamente un colador de células de 100 m con DMEM y colóquelo encima de un tubo de 50 ml sobre hielo.
   11. Transfiera la suspensión celular a través del colador una gota a la vez utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Asegúrese de que la suspensión celular no entre en la bombilla de la pipeta de transferencia.
   12. Transfiera el filtrado utilizando una pipeta de transferencia de plástico a un nuevo tubo de 5 ml y añada DMEM a un volumen final de 5 ml. Asegúrese de recoger las células agrupadas unidas a la parte inferior del filtro con una pipeta de transferencia de plástico limpia. Peletlas a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   13. Retire tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet.
   14. Añadir 5 l de solución de DNase I directamente en el pellet. A continuación, mezcle el pellet con la solución DNase I raspando suavemente la parte inferior exterior del tubo 4-5 veces a lo largo de un bastidor de tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 ml. Raspar con demasiada dureza puede resultar en una reducción de los diferenciales recuperados.
   15. Añadir DMEM a un volumen final de 5 ml y mezclar la solución invirtiendo el tubo varias veces. Es común que los grumos sigan presentes después del primer tratamiento con DNase I.
   16. Reperque la suspensión de la célula a 200 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
   17. Repita los pasos 1.4.13-1.4.16 1-3 veces adicionales hasta que el pellet resuspendido no se agrupe al adición de DMEM. Después del último giro, retire tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet.
       NOTA: Espere una reducción en el tamaño del pellet con cada tratamiento DNase I; exceder 4 lavados Totales de DNase I puede resultar en una pérdida significativa de células. Si no hay pellets visibles después de los pasos de los tratamientos DNase I, no proceda con el procedimiento. Deseche cualquier DNase I no utilizado.
   18. Añadir 1 ml de 1x PBS y resuspender el pellet raspando suavemente la parte inferior exterior del tubo a lo largo de un bastidor de tubo vacío de 1,5 ml.
   19. Pellet la suspensión de la célula a 200 x g durante 5 min y luego retire tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet.
   20. Corte a 3 mm desde el final de una punta de pipeta de 200 ml para ensanchar la abertura y resuspender el pellet en una solución de sacarosa de 0,1 M pipeteando hacia arriba y hacia abajo con la punta de la pipeta cortada. Deje que la suspensión celular se sifique a temperatura ambiente durante 3 min.
5. Difusión de cromosomas en diapositivas de vidrio
   1. Recubrir un portaobjetos con 100 s de 1% de formaldehído con 0.15% Triton X-100 con el lado de una punta de pipeta. A continuación, agregue 18 l de la suspensión de la célula de sacarosa en el centro de la diapositiva en una línea recta perpendicular al borde largo. Incline la corredera hacia adelante y hacia atrás (60o) para facilitar la propagación de la suspensión celular a todas las esquinas.
   2. Coloque las diapositivas planas en una cámara de humedad abierta ligeramente agrietada(Figura 3) para evitar que la solución de formaldehído se seque. Coloque la cámara de humedad en un cajón oscuro durante la noche.
   3. Retire la tapa de la cámara de humedad y deje que los portaobjetos se sequen por completo.
   4. Coloque los portaobjetos en un frasco de Coplin y luego llene el frasco de Coplin con agua destilada e incuba durante 5 minutos con un suave temblor a temperatura ambiente.
      NOTA: Las diapositivas se pueden colocar en el frasco de Coplin en un patrón en zigzag para maximizar el número de diapositivas por tarro de Coplin. Asegúrese de que haya espacio para que el líquido pase entre todas las diapositivas.
   5. Vierta el agua y llene el frasco con 1:250 agente humectante (ver Tabla de Materiales). Lavar 2 veces durante 5 minutos cada uno con un suave temblor a temperatura ambiente.
   6. Deje que las diapositivas se sequen por completo y guárdelas a -20 oC hasta que estén manchadas.
      NOTA: El más largo que hemos almacenado diapositivas sin ninguna degradación notable de los cromosomas es de 2 meses.

2. Tinción de la sonda Telómero PNA

NOTA: Las repeticiones de telómeros se pueden teñir utilizando sondas de Telómero PNA conjugadas con fluoróforos que hibridan a las repeticiones de telómeros de hebra sprincipales (CCCTAA). Las sondas PNA tienen una columna vertebral neutra, lo que aumenta la afinidad de hibridación con el ADN cargado negativamente, lo que resulta en poco o ningún fondo. El paso de sondeo de telómeros es opcional. Para proceder a la tinción de anticuerpos, rehidrate los portaobjetos en 1x PBS como se indica en el paso 2.2.2., luego proceda directamente a "Tinción primaria de anticuerpos".

1. Haga los reactivos de la sonda PNA antes de iniciar la tinción de telómeros
   NOTA: Es conveniente preparar las siguientes soluciones en las cantidades especificadas para su uso en experimentos futuros. Las condiciones de almacenamiento se indican a continuación.
   1. Preparar 2 L de 20x solución de citrato de solución salina-sodio (SSC) con una concentración final de 3 M NaCl y 0,3 M de citrato de sodio. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
   2. Hacer 50 ml de solución de pre-hibridación que contenga ARN de transferencia a una concentración final de 50% de formamida, 5x SSC, 50 g/ml de heparina, 500 g/ml de ARN de transferencia, 0.1% Tween 20 y añadir 460 ml de ácido cítrico de 1 M para llevar la solución al pH 6. Conservar a -20oC.
      ADVERTENCIA: Formamida es peligrosa. Prepare la solución en una campana de humos.
   3. Haga 50 ml de solución de pre-hibridación preparada de la misma manera que en el paso 2.1.2 sin añadir ARN de transferencia. Conservar a -20oC.
   4. Las sondas de telómero de PNA TelC-Cy3 y TelC-Alexa647 se preparan como stocks de 50 m en formamida según las instrucciones del fabricante. Almacene las sondas PNA como alícuotas de 8 l a -80 oC.
   5. Hacer al menos 1 ml de 100 mg/ml de solución de albúmina sérica bovina (BSA) en agua destilada estéril. Conservar a -20oC. Si prepara más de 1 ml de BSA de stock, almacene la solución como alícuotas de 1 ml.
   6. Con un tubo de 2 ml, prepare 2 ml de solución de hibridación añadiendo 27 ml de 100 mg/ml de BSA y 8 ml de sonda PNA de 50 m a 1,965 ml de solución de prehibridación que contenga ARN de transferencia. Conservar en la oscuridad a -20oC.
2. Tna de telómeros de PNA tinción de la sonda
   1. Precalentar el horno de hibridación a 82oC.
   2. Rehidratar los portaobjetos con 500 ml de 1 pbS por diapositiva durante 5 minutos en una cámara de humedad a temperatura ambiente. Retire el PBS tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
   3. Caliente los portaobjetos y el tubo de 2 ml que contiene la solución de hibridación directamente sobre una superficie metálica en el horno de hibridación calentado durante 2 min.
   4. Mientras mantiene las diapositivas en la superficie metálica, agregue 100 s de la solución de hibridación por diapositiva y luego cubra las diapositivas con tapas de plástico (25 mm x 75 mm) cortadas para dar forma a una bolsa de autoclave. Deje que las diapositivas se senten a 82 oC durante 10-12 min.
   5. Colocar los portaobjetos en una cámara de humedad en la oscuridad a 37 oC durante 16-24 h. A partir de este punto y para la tinción de anticuerpos primarios y secundarios, las diapositivas deben mantenerse en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo de la señal de fluorescencia. Después del período de incubación, los reactivos para la tinción de anticuerpos se pueden preparar durante el paso 2.2.9.
   6. Retire los cubreobjetos con una punta de pipeta.
      NOTA: Para facilitar la extracción de la cubierta, se puede dispensar suavemente entre la corredera y la cubierta a medida que se levanta la cubierta.
   7. Pipetear 500 l de solución de pre-hibridación sin ARN de transferencia en cada diapositiva y colocar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
      NOTA: La solución de pre-hibridación sin ARN de transferencia no se precalienta antes de agregarse a cada diapositiva.
   8. Pipetear 500 l de solución de pre-hibridación del 50% sin ARN de transferencia en 1x PBS a cada diapositiva y colocar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
   9. Transfiera las diapositivas a un frasco de Coplin y lave 3 veces en 1PBS con agitación suave durante 15 minutos por lavado a temperatura ambiente.
   10. Retire las diapositivas del frasco de Coplin y retire el exceso de PBS tocando el lado de la diapositiva en una toalla de papel. A continuación, proceda al paso 3.2 "Tinción primaria de anticuerpos".

3. Tinción de anticuerpos

NOTA: Los anticuerpos elevados a proteínas meióticas conocidas se pueden utilizar para la detección de inmunofluorescencia en preparaciones cromosómicas de propagación. Los anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos permiten teñir múltiples proteínas simultáneamente, si los anticuerpos primarios se criaron en diferentes animales.

1. Realice las siguientes soluciones el día de la tinción de anticuerpos primarios y secundarios
   1. Hacer 1 L de PBT con 1x PBS y 0.1% Triton X-100 diluido en agua destilada. Conservar a temperatura ambiente. Esto se puede preparar con anticipación y en grandes cantidades para futuros experimentos de propagación.
   2. Preparar 500 l de bloque de anticuerpos por diapositiva a una concentración final de 2 mg/ml de BSA y 2% de suero de cabra en PBT.
   3. Para hacer 100 ml de mezcla de anticuerpos primarios o secundarios por diapositiva, añada los anticuerpos adecuados a la concentración correcta (ver Tabla de materiales)en el bloque de anticuerpos.
      NOTA: Es posible que sea necesario determinar empíricamente la concentración de anticuerpos. En la discusión, incluimos una lista de anticuerpos que hemos probado con éxito (con dilución/concentraciones) y los que hemos probado sin éxito.
2. Tinción primaria de anticuerpos
   NOTA: El conejo antihumano SCP3 y el pollo anti-zebrafish Sycp1 se utilizan típicamente para la tinción primaria de anticuerpos.
   1. Después de eliminar el exceso de PBS de las diapositivas, agregue 500 ml de bloque de anticuerpos por diapositiva y coloque los portaobjetos en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos.
   2. Retire el bloque de anticuerpos tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
   3. Añadir 100 l de mezcla de anticuerpos primarios en bloque de anticuerpos por diapositiva y cubrir las diapositivas con una cubierta de plástico hecha de una bolsa de autoclave. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad durante la noche a 4 oC.
   4. Retire los cubreobjetos con una punta de pipeta y lave los portaobjetos 2 veces durante un mínimo de 5 minutos cada uno con 1 PBS en un frasco de Coplin con un suave temblor a temperatura ambiente.
   5. Retire el PBS tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
3. Tinción secundaria de anticuerpos
   NOTA: Los anticuerpos anticonejo y antipollo de cabra conjugados a diferentes fluoróforos se utilizan para la tinción a una concentración de 1:1000.
   1. Añadir 500 l de bloque de anticuerpos por diapositiva y colocar los portaobjetos en la cámara de humedad a temperatura ambiente durante un mínimo de 5 min.
   2. Retire el bloque de anticuerpos tocando el lado de la diapositiva sobre una toalla de papel.
   3. Añadir 100 l de mezcla secundaria de anticuerpos en bloque de anticuerpos por diapositiva y cubrir las diapositivas con una cubierta de plástico hecha de una bolsa de autoclave. Colocar los portaobjetos en una cámara de humedad durante 1 h a 37 oC.
   4. Retire los cubreobjetos con una punta de pipeta y lave los portaobjetos 3 veces durante un mínimo de 5 minutos cada uno con 1 PBS en un frasco de Coplin con un suave temblor a temperatura ambiente.
   5. Enjuague los portaobjetos una vez durante un mínimo de 2 minutos con agua destilada en un frasco de Coplin con un suave temblor a temperatura ambiente.
   6. Seque al aire los portaobjetos inclinados, para facilitar el secado.
   7. Coloque 20 ml de soporte anti-fade con o sin DAPI (ver Tabla de Materiales)como 3 puntos espaciados uniformemente en los cubredes de vidrio (24 mm x 60 mm).
   8. Coloque las diapositivas boca abajo en las cubiertas de vidriolabios y luego sellar los labios de las cubiertas con esmalte de uñas en el borde superpuesto el extremo esmerilado de la diapositiva.
   9. Almacene las diapositivas preparadas a 4 oC hasta que estén listas para la toma de imágenes.

Resultados

Hemos descrito un método para preparar y visualizar las preparaciones de propagación de espermatocitos de peces cebra. Cuando se realiza correctamente, nuestro procedimiento produce núcleos bien diseminados y no superpuestos. Para recuperar estos núcleos, es importante tener la cantidad adecuada de material de partida (es decir, testículos), tratar los testículos durante un período de tiempo suficiente en trippsina y un número adecuado de tratamientos DNase I. Estos diseminados se...

Discusión

Aquí describimos métodos para sondear la ubicación de los telómeros y las proteínas asociadas al cromosoma en las propagaciones de superficies nucleares de espermatocitos aislados de los testículos de peces cebra. Esperamos que estos métodos sean aplicables para el análisis de espermacitos en otras especies de teleost con ajuste al tamaño de los testículos.

Mientras que sólo unos pocos anticuerpos han sido elevados a las proteínas meióticas de pez cebra, hemos tenido éxito utiliz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack	Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free	ThermoFisher Scientific	28908
2 mL	Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips	Corning	2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips	VWR International	16004-312
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	363696
Autoclave bag	Several commercial brands available		Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605-100	Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm	Fisher Scientific	08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed	Biotium	203775-500uL	Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1	Generated by Burgess lab	N/A	Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-500MG
Coplin jar	Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas	Roche Diagnostics	10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL	VWR International	89429-308
Formamide	Fisher Scientific	BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11039	Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11042	Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1	Santa Cruz Biotechnology	sc-8973	Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11008	Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012	Use at 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-10mL
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-100KU
Humidity chamber	Fisher Scientific	50-112-3683
Hybridization Oven	VWR International	230401V (Model 5420)
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	Model Classic C25
KCl	Fisher Scientific	P217-500
Kimwipes	Kimerbly-Clark Professional	34155	Used for the humidity chamber
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
Microscope	Several commercial brands available		Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3	Abcam	ab97672	Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1	BD Biosciences	550838	Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA	Sigma-Alrich	MABE285	Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O	Fisher Scientific	S373-500
NaCl	Fisher Scientific	S271-3
Photo-Flo 200 solution	Electron Microscopy Sciences	74257
Plastic transfer pipettes	Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647	PNA Bio Inc	F1013	Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3	PNA Bio Inc	F1002	Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36971
Rabbit anti-hRPA	Bethyl	A300-244A	Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3	Abcam	ab150292	Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51	GeneTex	GTX100469	Use at 1:300
Sodium citrate	Fisher Scientific	S279-500
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm	Fisher Scientific	50-822-353	Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit	Fisher Scientific	NC9897184	Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin	Worthington Biochemical	LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white	Sigma-Aldrich	T9253-500MG
Tween 20	Bio-Rad	170-6531	Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)	Fine Science Tools	15018-10