Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Resumo

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Resumo

A meiose é o processo celular-chave necessário para criar gametes haploides para reprodução sexual. Os organismos modelo têm sido fundamentais para entender os eventos cromossomos que ocorrem durante a profase do meioético, incluindo a combinação, a sinapse e eventos de recombinação que garantem a segregação adequada do cromossomo. Embora o mouse tenha sido um modelo importante para entender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos, nem todos os eventos meioticéticos neste sistema são análogos à meiose humana. Recentemente demonstramos o potencial excitante do zebrafish como um modelo de espermatogênese humana. Aqui descrevemos, em detalhes, nossos métodos para visualizar cromossomos meioóticos e proteínas associadas em preparações de propagação de cromossomos. Esses preparativos têm a vantagem de permitir a análise de alta resolução das estruturas cromossais. Primeiro, descrevemos o procedimento de dissecação de testículos de zebrafish adultos, seguido de dissociação celular, lise e disseminação dos cromossomos. Em seguida, descrevemos o procedimento para detectar a localização de proteínas cromossomos mestióticas, por detecção de imunofluorescência, e sequências de ácido nucleico, por fluorescência na hibridização situ (FISH). Essas técnicas compreendem um conjunto útil de ferramentas para a análise citológica da arquitetura de cromatina meiotic no sistema de zebrafish. Pesquisadores da comunidade de zebrafish devem ser capazes de dominar rapidamente essas técnicas e incorporá-las em suas análises padrão da função reprodutiva.

Introdução

A reprodução sexual prossegue através da combinação de dois gametes haploides, cada um carregando metade do complemento cromossomo de uma célula somática. Meiosis é uma divisão de células especializadas que produz gametas haploides através de uma rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação de cromossomos. Na profase I, os cromossomos homônimos (homologs) devem passar por pareamento, recombinação e sinapse, sendo este último caracterizado pela formação do complexo sinaponômico que compreende dois eixos homolog a ponteados pelo filaverso transversal, Sycp1(Figura 1A,B). A não execução desses processos pode levar à produção de gametes aneuploides, que são uma das principais causas de abortos em humanos¹. Nosso conhecimento da coordenação entre emparelhamento, recombinação e sinapse tem sido facilitado por estudos em uma ampla gama de organismos, como levedura, C. elegans,rato e Drosophila,entre outros². Embora o processo geral de emparelhamento cromossomo homônimo seguido de segregação seja bem conservado, sua dependência da recombinação e sinopse e da ordem desses eventos varia.

A formação de quebra de fio duplo meiotic (DSB), que inicia a recombinação homóloga, ocorre perto de telômeros agrupados no buquê durante leptotene e a sinopse segue logo após^3,4. Essa configuração de formação dsb e iniciação de sinapse também é uma característica da meiose masculina em humanos, mas não no rato^5,6,7,8,sugerindo que os zebrafish podem servir de modelo para a spermatogênese humana. Há também várias vantagens práticas de estudar a meio-peixe-zebra. Machos e fêmeas passam por gametogênese durante toda a idade adulta, suas gônadas são facilmente acessíveis, e centenas de descendentes são gerados a partir de uma única cruz. Além disso, os embriões são transparentes e se desenvolvem externamente, o que facilita a detecção precoce de aberrações em desenvolvimento embrionário devido aos gametes aneuploides^3,9. As desvantagens do uso de zebrafish são de que eles são lentos para atingir a maturidade sexual (~60 dias) e a quantidade de material necessário para propagações de superfície nuclear deve ser coletada de ~10-20 animais adultos, dependendo de seu tamanho.

Os preparativos de disseminação do cromossomo meioético são uma ferramenta vital para estudar dinâmicas cromossãs em todos os organismos modelo, uma vez que as principais assinaturas da dinâmica do cromossomo meioético podem ser sondadas. Em zebrafish, aspectos-chave da progressão do programa de meiotética e organização nuclear foram dissecados através da sondagem de superfícienuclear espalhadas, referidas aqui como spreads cromossomos, com anticorpos para detecção de proteínas e/ou ácidos nucleicos pelo PEIXE^3,4^,9,10,11. De fato, a localização polarizada de telômeros agrupados no buquê pode ser preservada na preparação de spread(Figura 1C). Recentemente, usamos cromossomo de espermatoósico de zebrafish, se espalha junto com métodos de detecção de fluorescência e microscopia de superresolução para elucidar a progressão detalhada da dinâmica do telômero de zebrafish, emparelhamento de cromossomo homólogo, localização de quebra de fio duplo e sinopse nas principais transições meioticas³. Aqui apresentamos métodos para preparar spreads cromossomos de espermatocitocitos dos testículos de zebrafish e, posteriormente, manchá-los com sondas de ácido nuclecítico de peptídeo fluorescente (PNA) a repetidas sequências de telômero e detecção de imunofluorescência de proteínas associadas ao cromossomo.

Protocolo

Todos os métodos envolvendo zebrafish foram realizados utilizando padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UC Davis.

1. Procedimento de propagação de cromossomo

NOTA: O protocolo a seguir foi projetado para criar slides 4-6, com centenas de núcleos meioéticos espalhados por slide. O número de testículos utilizados dependerá do tamanho do peixe. Espera-se utilizar 20 animais em ~60 dias após a fertilização (DPF) e 15 animais em ~6 meses após a fertilização (mpf). Para grandes zebrafish (por exemplo, 12 mpf) 10 animais devem ser suficientes. Saiba que os testículos de alguns mutantes meiotic (por exemplo, spo11^-/-) serão um pouco menores³. Neste protocolo, um grupo de testículos é considerado como uma única amostra. Recomenda-se que não mais do que 4 amostras sejam preparadas em paralelo.

1. Faça as seguintes soluções antes de iniciar o procedimento de disseminação
   NOTA: É conveniente preparar as seguintes soluções nas quantidades especificadas para uso em experimentos futuros de disseminação.
   1. Prepare uma solução de sacarose de 0,1 M dissolvendo 3,42 g de sacarose em 100 mL de água destilada. Traga a solução de sacarose para pH 8 usando 1 M Tris-HCl que também está no pH 8. Em seguida, filtrar esterilizar a solução de sacarose. Guarde à temperatura ambiente.
   2. Faça uma solução de estoque tampão de fosfato de 10x (PBS) para uma concentração final de 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na₂HPO₄ e 27,6 mM KH₂PO₄ em 1,8 L de água destilada. Mexa até dissolver, depois ajuste o pH para 7,3 usando NaOH e autoclave. Guarde à temperatura ambiente.
   3. Faça uma solução dnase de Dnase I de 400 μg/mL em água destilada estéril. Loja a -20 °C. Recomenda-se preparar 5 mL desta solução e, em seguida, armazenar como 100 μL alíquotas.
2. Faça as seguintes soluções no dia do protocolo de disseminação
   NOTA: Para a eficiência do tempo, é melhor fazer a solução colagenase imediatamente após a dissecação de todos os testículos e, em seguida, fazer as soluções inibidoras de trippsina e trypsin durante o tempo em que as amostras estão sendo tratadas na colagenase.
   1. Dissolva 4 mg de colagenase em 200 μL do meio eagle modificado de Dulbecco (DMEM) por amostra (concentração final de 2% w/v colagenase). Mantenha no gelo até que seja necessário. A colagenase vai dissociar os testículos.
   2. Dissolva 1,4 mg de trippsina em 200 μL de DMEM por amostra (0,7% w/v trypsin concentração final). Mantenha no gelo até que seja necessário. A trippsina ajudará a dissociar as células.
   3. Dissolva 10 mg de inibidor de trypsina em 500 μL de DMEM por amostra (2% w/v trypsin inibidor concentração final). Mantenha no gelo até que seja necessário. O inibidor da metepsina impede que a tentação dedegradar as células.
   4. Prepare uma solução de formaldeído de 1% (a partir de uma solução pré-fabricada de 16%) com 0,15% Triton X-100 em água destilada estéril. Mantenha no gelo até que seja necessário. O formaldeído de 1% pode ser preparado enquanto os testículos estão sendo tratados com trippsina e DNase I (ou seja, durante a etapa 1.4.7 do procedimento de disseminação).
      CUIDADO: O formaldeído é perigoso.
3. Dissecção de testículos de zebrafish macho adulto
   1. Eutanize zebrafish macho (> 60 dpf) submergindo-os em água gelada. Os peixes podem ser mantidos em água gelada até que estejam prontos para dissecar, porém devem ser dissecados o mais rápido possível.
      NOTA: A cepa selvagem AB é usada para este procedimento, mas outras cepas do tipo selvagem também devem ser favoráveis. O maior tempo que mantivemos peixes na água gelada antes da dissecação é de 3h sem qualquer efeito perceptível no protocolo.
   2. Decapitar um peixe de cada vez com uma tesoura pequena e, em seguida, usar micro tesouras para cortar ao longo da linha média ventral para expor a cavidade corporal.
   3. Dissecar os testículos é usando fórceps (ver Tabela de Materiais) na ampliação de 1,65x um microscópio. Realize as dissecções em uma placa de Petri revestida de silicone com coberta por uma piscina rasa de 1x PBS.
      NOTA: O testículo está localizado entre a bexiga de natação e o intestino e aparecerá mais leve que o tecido muscular (Figura 2A). Os testículos devem ter 2 lóbulos quando removidos do zebrafish (Figura 2B).
   4. Remova o máximo de gordura e tecido circundante possível. Em seguida, adicione cada teste dissecado é diretamente em um tubo de 5 mL com 2 mL de DMEM e mantenha no gelo.
      NOTA: Os passos 1.3.3 e 1.3.4 devem ser dominados antes de fazer qualquer experimento.
4. Dissociação de células de testículos
   1. Solução de sacarose pré-quente de 100 mL de 0,1 M a 37 °C.
   2. Adicione 200 μL de solução colagenase ao tubo de 5 mL com os testículos. Misture a solução invertendo-a várias vezes.
   3. Agite suavemente os testículos em um agitador de incubadora horizontalmente a 100 rpm a 32 °C por 50 min a uma hora até que o DMEM esteja nublado e os testículos estejam em pequenos pedaços. Inverta rapidamente o tubo a cada 10 min para facilitar a dissociação.
   4. Para lavar a colagenase, adicione o DMEM a um volume final de 5 mL e inverta o tubo algumas vezes. Pelotas os testículos em ~200 x g por 3 min à temperatura ambiente. Remova 3 mL do supernatant para que apenas 2 mL permaneça.
      NOTA: A adição, remoção e transferência de DMEM é feita com pipetas de transferência plástica para a totalidade do procedimento de propagação do cromossomo.
   5. Repita o passo 1.4.4 duas vezes mais para um total de 3 lava-louças DMEM. Não suspenda novamente a pelota entre as lavas DMEM. Após a última lavagem DMEM, remova 4 mL do supernatant para que apenas 1 mL permaneça.
   6. Adicione 1 mL de DMEM para um volume total de 2 mL e adicione 200 μL da solução de trypsin e 20 μL de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar a solução.
   7. Horizontalmente agite o tubo a 32 °C por 5-15 min a 100 rpm até que a solução DMEM contenha apenas alguns aglomerados. Inverta rapidamente o tubo a cada 5 min para facilitar a dissociação.
      NOTA: Os aglomerados devem ser consideravelmente menores depois de tremer.
   8. Adicione 500 μL da solução inibidora de trypsin a e 50 μL de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar, em seguida, gire brevemente para baixo em ~200 x g por 3 min à temperatura ambiente para remover líquido ou aglomerados que podem aderir à tampa do tubo ou ao lado do tubo.
   9. Coloque o tubo no gelo e resuspenda a suspensão celular, canalizando repetidamente para cima e para baixo com uma pipeta de transferência de plástico por 2 minutos para facilitar a dissociação de quaisquer aglomerados restantes. Não deixe a suspensão da célula entrar na lâmpada da pipeta de transferência. Após os 2 min, a tubulação da suspensão volta ao tubo de 5 mL.
   10. Pré-muscar um filtro de célula de 100 μm com DMEM e colocá-lo em cima de um tubo de 50 mL no gelo.
   11. Transfira a suspensão da célula através do filtro uma gota de cada vez usando uma pipeta de transferência de plástico. Certifique-se de que a suspensão celular não vá para a lâmpada da pipeta de transferência.
   12. Transfira o filtrante usando uma pipeta de transferência de plástico para um novo tubo de 5 mL e adicione O DMEM a um volume final de 5 mL. Certifique-se de coletar as células agrupadas presas à parte inferior do filtro com uma pipeta de transferência de plástico limpo. Pelotas as células em ~200 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   13. Remova o máximo de supernatant possível sem perturbar a pelota.
   14. Adicione 5 μL de solução DNase I diretamente na pelota. Em seguida, misture a pelota com a solução DNase I raspando suavemente o fundo externo do tubo 4-5 vezes ao longo de um rack vazio de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Raspar muito duramente pode resultar em uma redução de spreads recuperados.
   15. Adicione o DMEM a um volume final de 5 mL e misture a solução invertendo o tubo várias vezes. É comum que aglomerados ainda estejam presentes após o primeiro tratamento de DNase I.
   16. Pelota a suspensão celular em ~200 x g por 2 min à temperatura ambiente.
   17. Repita as etapas 1.4.13-1.4.16 adicionais 1-3 vezes até que a pelota resuspensa não se agrupe sobre a adição do DMEM. Após a última rodada, remova o máximo de supernatant possível sem perturbar a pelota.
       NOTA: Espere uma redução no tamanho da pelota a cada tratamento de DNase I; exceder 4 lava-mnase total eu pode resultar em perda significativa de células. Se nenhuma pelota for visível após o DNase I tratar etapas, não prossiga com o procedimento. Descarte qualquer DNase não utilizado.
   18. Adicione 1 mL de 1x PBS e resuspenda a pelota raspando suavemente o fundo externo do tubo ao longo de um rack de tubo vazio de 1,5 mL.
   19. Contada a suspensão celular em ~200 x g por 5 min e, em seguida, remova o máximo de supernatant possível sem perturbar a pelota.
   20. Corte ~3 mm da extremidade de uma ponta de tubulata de 200 μL para ampliar a abertura e resuspender a pelota em ~80 μL de solução de sacarose de 0,1 M, canalizando para cima e para baixo com a ponta de tubulação cortada. Deixe a suspensão celular sentar-se à temperatura ambiente por 3 min.
5. Espalhando cromossomos em slides de vidro
   1. Cubra um slide com 100 μL de 1% formaldeído com 0,15% Triton X-100 com o lado de uma ponta de pipeta. Em seguida, adicione 18 μL da suspensão da célula de sacarose no centro do slide em uma linha reta perpendicular à borda longa. Incline o slide para frente e para trás (~60°) para facilitar a propagação da suspensão celular para todos os cantos.
   2. Coloque os slides abaixados em uma câmara de umidade aberta ligeiramente rachada (Figura 3) para evitar que a solução de formaldeído seque. Coloque a câmara de umidade em uma gaveta escura durante a noite.
   3. Retire a tampa da câmara de umidade e deixe que os slides sequem completamente.
   4. Coloque os slides em um pote coplin, em seguida, encha o frasco Coplin com água destilada e incuba por 5 min com suave agitação à temperatura ambiente.
      NOTA: Os slides podem ser colocados no frasco coplin em um padrão de ziguezague para maximizar o número de slides por jarra Coplin. Certifique-se de que há espaço para o líquido passar entre todos os slides.
   5. Despeje a água e encha o frasco com 1:250 agente molhado (ver Tabela de Materiais). Lave 2 vezes por 5 min cada um com suave agitação à temperatura ambiente.
   6. Deixe os slides secarem totalmente e armazenem a -20 °C até ficarem manchados.
      NOTA: O maior tempo que armazenamos slides sem qualquer degradação perceptível dos cromossomos é de ~2 meses.

2. Telômero PNA manchade sonda

NOTA: As repetições de telômero podem ser manchadas usando sondas PNA de telômero conjugadas com fluorofóforo que hibridizam para as principais repetições de telômero de fio (CCCTAA). As sondas PNA têm uma espinha dorsal neutra, o que aumenta a afinidade de hibridização ao DNA carregado negativamente, resultando em pouco ou nenhum fundo. O passo de sondagem de telômero é opcional. Para proceder à coloração de anticorpos, reidrate slides em 1x PBS, conforme indicado na etapa 2.2.2., depois procede diretamente à "coloração primária de anticorpos".

1. Faça a sonda PNA reagentes antes de iniciar a coloração de telômero
   NOTA: É conveniente preparar as seguintes soluções nas quantidades especificadas para uso em experimentos futuros. As condições de armazenamento são anotadas abaixo.
   1. Prepare 2 L da solução de citrato salino-sódio (SSC) de 20x com uma concentração final de 3 M NaCl e citrato de sódio de 0,3 M. Autoclave e loja à temperatura ambiente.
   2. Faça 50 mL de solução de pré-hibridização contendo RNA de transferência para uma concentração final de 50% de formamide, 5x SSC, 50 μg/mL heparin, 500 μg/mL transfer RNA, 0,1% Tween 20 e adicionar 460 μL de 1 M ácido citrico para trazer a solução para pH ~6. Loja a -20 °C.
      ATENÇÃO: A formamida é perigosa. Prepare a solução em um capô de fumaça.
   3. Faça 50 mL de solução de pré-hibridização preparada da mesma forma que na etapa 2.1.2 sem adicionar RNA de transferência. Loja a -20 °C.
   4. As sondas de telômero PNA TelC-Cy3 e TelC-Alexa647 são preparadas como estoques de 50 μM em formaide de acordo com as instruções do fabricante. Armazene as sondas PNA como alíquotas de 8 μL a -80 °C.
   5. Faça pelo menos 1 mL de 100 mg/mL solução de estoque de soro bovino (BSA) em água destilada estéril. Loja a -20 °C. Se preparar mais de 1 mL de estoque BSA, armazene a solução como 1 mL aliquots.
   6. Usando um tubo de 2 mL, prepare 2 mL de solução de hibridização adicionando 27 μL de 100 mg/mL BSA e 8 μL de 50 μM PNA para 1.965 mL de solução de pré-hibridização contendo RNA de transferência. Guarde no escuro a -20 °C.
2. Coloração da sonda de telômero PNA
   1. Pré-aqueça o forno hibridização a 82 °C.
   2. Reahidrato desliza com 500 μL de 1x PBS por deslizamento por 5 min em uma câmara de umidade à temperatura ambiente. Remova o PBS tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
   3. Aqueça os slides e o tubo de 2 mL contendo a solução de hibridização diretamente em uma superfície metálica no forno de hibridização aquecido por 2 min.
   4. Mantendo os slides na superfície metálica, adicione 100 μL da solução de hibridização por slide e, em seguida, cubra os slides com tampas plásticas (~25 mm x 75 mm) cortadas para moldar um saco autoclave. Deixe os slides sentarem-se a 82 °C para 10-12 min.
   5. Coloque os slides em uma câmara de umidade no escuro a 37 °C por 16-24 h. A partir deste ponto e para a coloração primária e secundária de anticorpos, os slides devem ser mantidos no escuro para evitar fotobranqueamento do sinal de fluorescência. Após o período de incubação, os reagentes para coloração de anticorpos podem ser preparados durante a etapa 2.2.9.
   6. Remova os deslizamentos de cobertura com uma ponta de pipette.
      NOTA: Para facilitar a remoção do deslizamento de cobertura, ~50-100 μL da solução de hibridização sem RNA de transferência pode ser gentilmente dispensado entre o slide e o deslizamento de cobertura à medida que o deslizamento de cobertura está sendo levantado.
   7. Pipette 500 μL de solução pré-hibridização sem RNA de transferência para cada slide e coloque os slides na câmara de umidade por 15 min à temperatura ambiente. Remova a solução tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
      NOTA: A solução de pré-hibridização sem RNA de transferência não é pré-aquecida antes de ser adicionada em cada slide.
   8. Pipette 500 μL de 50% de solução de pré-hibridização sem RNA de transferência em 1x PBS para cada slide e coloque os slides na câmara de umidade por 15 min à temperatura ambiente. Remova a solução tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
   9. Transfira os slides para um frasco coplin e lave 3 vezes em 1x PBS com suave agitação por 15 min por lavagem à temperatura ambiente.
   10. Remova os slides do frasco coplin e remova o excesso de PBS tocando na lateral do slide em uma toalha de papel. Em seguida, prossiga para a etapa 3.2 "Coloração primária de anticorpos".

3. Coloração de anticorpos

NOTA: Anticorpos elevados a proteínas mestióticas conhecidas podem ser usados para detecção de imunofluorescência em preparações de cromossomo de propagação. Anticorpos secundários conjugados a diferentes fluoroforos permitem que múltiplas proteínas sejam manchadas simultaneamente, se os anticorpos primários foram criados em diferentes animais.

1. Faça as seguintes soluções no dia da coloração primária e secundária de anticorpos
   1. Faça 1 L de PBT com 1x PBS e 0,1% Triton X-100 diluído em água destilada. Guarde à temperatura ambiente. Isso pode ser preparado com antecedência e em grandes quantidades para futuros experimentos de disseminação.
   2. Prepare 500 μL de bloco de anticorpos por deslizamento para uma concentração final de 2 mg/mL de BSA e 2% de soro de cabra em PBT.
   3. Para fazer 100 μL de mistura primária ou secundária de anticorpos por slide, adicione os anticorpos apropriados na concentração correta (ver Tabela de Materiais) no bloco de anticorpos.
      NOTA: A concentração de anticorpos pode precisar ser determinada empiricamente. Na discussão, incluímos uma lista de anticorpos que tentamos com sucesso (com diluição/concentrações) e aqueles que tentamos sem sucesso.
2. Coloração primária de anticorpos
   NOTA: Rabbit anti-humano SCP3 e frango anti-zebrafish Sycp1 são tipicamente usados para coloração primária de anticorpos.
   1. Depois de remover o excesso de PBS dos slides, adicione 500 μL de bloco anticorpo por escorregador e coloque os slides em uma câmara de umidade a temperatura ambiente por um mínimo de 20 min.
   2. Remova o bloco de anticorpos tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
   3. Adicione 100 μL de mistura primária de anticorpos em bloco de anticorpos por slide e cubra os slides com um deslizamento de plástico feito de um saco autoclave. Coloque os slides em uma câmara de umidade durante a noite a 4 °C.
   4. Retire os deslizamentos de cobertura com uma ponta de pipeta e lave os slides 2 vezes por um mínimo de 5 minutos cada com 1x PBS em um frasco coplin com suave agitação à temperatura ambiente.
   5. Remova o PBS tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
3. Coloração secundária de anticorpos
   NOTA: Anti-coelho de cabra conjugado e anticorpos anti-frango para diferentes fluoroforóres são usados para colorir a uma concentração de 1:1000.
   1. Adicione 500 μL de bloco anticorpo por escorregador e coloque os slides na câmara de umidade à temperatura ambiente por um mínimo de 5 min.
   2. Remova o bloco de anticorpos tocando na lateral do slide em uma toalha de papel.
   3. Adicione 100 μL de mistura de anticorpos secundários em bloco de anticorpos por slide e cubra os slides com um protetor plástico feito de um saco autoclave. Coloque os slides em uma câmara de umidade por 1h a 37 °C.
   4. Retire os deslizamentos de cobertura com uma ponta de pipeta e lave os slides 3 vezes por um mínimo de 5 min cada com 1x PBS em um frasco coplin com suave agitação à temperatura ambiente.
   5. Enxágüe os slides uma vez por um mínimo de 2 min com água destilada em um frasco coplin com suave agitação à temperatura ambiente.
   6. O ar seque os slides inclinados, para facilitar a secagem.
   7. Coloque 20 μL de montador anti-fade com ou sem DAPI (ver Tabela de Materiais) como 3 pontos espaçados uniformemente em tampas de vidro (24 mm x 60 mm).
   8. Coloque os slides de frente para baixo nos deslizamentos de vidro e sele os coverslips com esmalte na borda sobrepondo a extremidade fossa do slide.
   9. Armazene os slides preparados a 4°C até ficar pronto para a imagem.

Resultados

Traçamos um método para preparar a disseminação de espermatocitos de zebrafish. Quando realizado corretamente, nosso procedimento rende núcleos bem espalhados, não sobrepostos. Para recuperar tais núcleos, é importante ter a quantidade adequada de material inicial (ou seja, testículos), tratar testículos por tempo suficiente na trippsina e um número adequado de tratamentos de DNase I. Esses spreads podem então ser manchados para telômeros e proteínas mestióticas para estuda...

Discussão

Aqui descrevemos métodos para sondar a localização de telômeros e proteínas associadas ao cromossomo na superfície nuclear se espalha de espermatocitoses isolados de testículos de zebrafish. Esperamos que esses métodos sejam aplicáveis para análise de espermatocitocitos em outras espécies teleast com ajuste ao tamanho dos testículos.

Embora apenas alguns anticorpos tenham sido elevados para proteínas meioticas de zebrafish, tivemos sucesso usando os seguintes anticorpos levantados...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack	Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free	ThermoFisher Scientific	28908
2 mL	Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips	Corning	2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips	VWR International	16004-312
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	363696
Autoclave bag	Several commercial brands available		Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605-100	Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm	Fisher Scientific	08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed	Biotium	203775-500uL	Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1	Generated by Burgess lab	N/A	Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-500MG
Coplin jar	Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas	Roche Diagnostics	10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL	VWR International	89429-308
Formamide	Fisher Scientific	BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11039	Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11042	Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1	Santa Cruz Biotechnology	sc-8973	Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11008	Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012	Use at 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-10mL
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-100KU
Humidity chamber	Fisher Scientific	50-112-3683
Hybridization Oven	VWR International	230401V (Model 5420)
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	Model Classic C25
KCl	Fisher Scientific	P217-500
Kimwipes	Kimerbly-Clark Professional	34155	Used for the humidity chamber
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
Microscope	Several commercial brands available		Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3	Abcam	ab97672	Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1	BD Biosciences	550838	Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA	Sigma-Alrich	MABE285	Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O	Fisher Scientific	S373-500
NaCl	Fisher Scientific	S271-3
Photo-Flo 200 solution	Electron Microscopy Sciences	74257
Plastic transfer pipettes	Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647	PNA Bio Inc	F1013	Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3	PNA Bio Inc	F1002	Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36971
Rabbit anti-hRPA	Bethyl	A300-244A	Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3	Abcam	ab150292	Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51	GeneTex	GTX100469	Use at 1:300
Sodium citrate	Fisher Scientific	S279-500
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm	Fisher Scientific	50-822-353	Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit	Fisher Scientific	NC9897184	Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin	Worthington Biochemical	LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white	Sigma-Aldrich	T9253-500MG
Tween 20	Bio-Rad	170-6531	Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)	Fine Science Tools	15018-10