Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

Resumen

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Resumen

El enfoque de montaje ascendente para la construcción de células sintéticas es una herramienta eficaz para aislar e investigar procesos celulares en un entorno de imitación celular. Además, el desarrollo de sistemas de expresión sin células ha demostrado la capacidad de reconstituir los procesos de producción, transcripción y traducción de proteínas (ADN-ARN-proteína) de manera controlada, aprovechando la biología sintética. Aquí describimos un protocolo para preparar un sistema de expresión libre de células, incluyendo la producción de un potente lisado bacteriano y encapsular este liso dentro de vesículas unilamelares gigantes a base de lípidos ricos en colesterol (GUVs) (es decir, liposomas estables), para formar células sintéticas. El protocolo describe los métodos para preparar los componentes de las células sintéticas, incluida la producción de lisatos bacterianos activos, seguido de una preparación detallada paso a paso de las células sintéticas basada en un método de transferencia de emulsión de agua en aceite. Estos facilitan la producción de millones de células sintéticas de una manera sencilla y asequible con una alta versatilidad para producir diferentes tipos de proteínas. Las células sintéticas obtenidas se pueden utilizar para investigar la producción de proteínas/ARN y la actividad en un entorno aislado, en evolución dirigida, y también como una plataforma de administración controlada de fármacos para la producción bajo demanda de proteínas terapéuticas dentro del cuerpo.

Introducción

Las células sintéticas son partículas similares a células artificiales, imitando una o varias funciones de una célula viva, como la capacidad de dividir, formar interacciones de membrana y sintetizar proteínas basadas en un código genético^1,,2,3. Las células sintéticas que encierran sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) poseen una alta modularidad debido a su capacidad para producir varias proteínas y secuencias de ARN después de alteraciones en la plantilla de ADN. Presentando una alternativa atractiva a los enfoques actuales de la producción de proteínas, los sistemas CFPS se basan en lisato celular, componentes purificados o componentes sintéticos e incluyen toda la maquinaria de transcripción y traducción necesaria para la síntesis de proteínas como ribosomas, ARN polimerasa, aminoácidos y fuentes de energía (por ejemplo, 3-fosfoglicérido y trifosfato de adenina)^4,5,6,7,8,9. La encapsulación de un sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite la producción simple y eficiente de proteínas sin depender de una célula viva¹⁰. Además, esta plataforma permite la síntesis de péptidos que pueden degradarse dentro de las células naturales, la producción de proteínas tóxicas para las células vivas, y modificar las proteínas con aminoácidos no naturales^11,,12. Las células sintéticas se han utilizado como modelo para fines de investigación que investigan los componentes celulares mínimos necesarios para permitir la vida celular desde una perspectiva evolutiva^1,,13. Las células sintéticas también se han utilizado para construir e implementar circuitos genéticos y como modelos para la evolución dirigida^14,,15,,16. Otros estudios se han centrado en la capacidad de las células sintéticas para imitar la actividad biológica de las células naturales, con el objetivo de reemplazar las células naturales dañadas, como las células beta en pacientes con diabetes^17. Además, la capacidad de estas células sintéticas encapsulantes CFPS para producir una variedad de proteínas terapéuticas ilustra su potencial para ser incorporadas en el uso clínico¹⁸.

Aquí describimos un protocolo de abajo hacia arriba a escala de laboratorio(Figura 1) para la producción de ARN y células sintéticas productoras de proteínas basadas en un sistema CFPS encapsulado en una vesícula lipídica. Esto muestra el uso potencial de plataformas celulares sintéticas como nuevos sistemas de administración de fármacos para la producción in situ de un fármaco de proteína terapéutica in vivo¹⁹. Estudios anteriores han investigado la optimización de la reacción CFPS y los procesos de preparación de lisato celular^4,8,20. Además, se han aplicado varias técnicas para la preparación de liposomas del tamaño de una célula, como los métodos de estabilización de gotas microfluídicas y a base de polímeros^21,22,23, que también difieren en la composición lipídica de los liposomas^24,25,26. En el protocolo presentado, las células sintéticas se producen utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite y el proceso de encapsulación se lleva a cabo a bajas temperaturas (<4 oC)^{5,10,24,27,28}. Se ha constatado que estas condiciones leves son favorables para conservar la integridad biofuncional de la maquinaria molecular, a saber, ribosomas y proteínas^27,,29,,30. La composición lipídica de las partículas consiste en colesterol y 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (POPC). La primera se encuentra en todas las membranas celulares de los mamíferos y es esencial para la estabilidad, rigidez y reducción de la permeabilidad de la membrana, y la segunda imita la composición de fosfolípidos de mamíferos^11,,13. La transcripción celular y la maquinaria molecular de traducción se extraen de la cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que se transforma con plásmido pAR1219 sobreexpresando la polimerasa de ARN T7 para aumentar la potencia de CFPS y la síntesis de proteínas. Este sistema se ha utilizado para producir proteínas diagnósticas y terapéuticas, con pesos moleculares de hasta 66 kDa in vitro e in vivo^19,,31. El siguiente protocolo proporciona un método simple y eficaz para la producción del sistema celular sintético, que puede abordar una amplia gama de cuestiones fundamentales asociadas con la síntesis de proteínas en la naturaleza y también se puede utilizar para aplicaciones de administración de fármacos.

Protocolo

NOTA: La ilustración del protocolo de producción de las células sintéticas completas se presenta en la Figura 1. Según las necesidades del usuario, la expresión proteica (sección 3.2) y la formación de células sintéticas (sección 4) partes del protocolo también se pueden llevar a cabo de forma independiente (con algunas adaptaciones).

1. Preparación del lisado S30-T7

1. Placa de raya de la bacteria E. coli BL21(DE3) transformada con el ARN T7 polimerasa que expresa pAR1219 plásmido en una placa de agar LB complementado con 50 g/ml de ampicilina para obtener colonias individuales.
2. Preparar una solución de arranque: Inocular una sola colonia en 5 ml de LB-media suplementado con 50 g/ml de ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y crezca durante la noche utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm y 37 oC. Preparar duplicados.
3. Inocular cada arrancador de 5 ml por separado en 500 ml de medios de tuberculosis suplementados con ampicilina de 50 g/ml en un matraz Erlenmeyer de 2 L con deflectores y cultivarlo utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm y 37 oC hasta que alcance la OD₆₀₀ de 0,8-1. Supervise periódicamente utilizando un espectrofotómetro.
4. Añadir 2-3 mL de 100 mM de stock de IPTG (para llegar a 0.4 - 0.6 mM) para la inducción de la expresión de la polimerasa de ARN T7 y continuar creciendo el cultivo hasta que alcance OD₆₀₀.4.
5. Transfiera la solución de cada matraz Erlenmeyer a dos tubos de centrífuga esterilizados de 250 ml.
6. Centrifugar cada uno a 7.000 x g durante 10 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
   NOTA: En esta etapa, el pellet bacteriano se puede almacenar a -20 oC durante unos días antes de pasar a los siguientes pasos.
7. Vuelva a suspender cada pellet en 250 ml de tampón de lisado s30 frío (4 oC) y centrífuga a 7.000 x g durante 10 min a 4 oC.
   NOTA: El tampón de lisato S30 se utiliza para mantener la estabilidad de las proteínas después de que la lisis celular se realiza utilizando el homogeneizador en el paso 1.9. A partir de este paso adelante, todos los pasos hasta la 1.12 deben llevarse a cabo de forma consecutiva y rápida.
   NOTA: Antes de continuar con el siguiente paso, enfríe previamente las puntas y los viales de 1,5 mililitros que serán necesarios para almacenar el lisado
8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender todos los pellets juntos en 15 ml de tampón de lisado frío S30. Filtrar la suspensión con una almohadilla de gasa.
   NOTA: 15 ml de solución se debe al volumen mínimo homogeneizador. Debe tenerse en cuenta que la concentración de bacterias también es importante.
9. Homogeneizar a una presión de trabajo de 15.000 psi, con una presión de aire de 4 bar (dos pasadas) para rotura celular. Evite la dilución de la solución para un lisado más concentrado y activo.
10. Añadir 100 ml de TDT de 0,1 M (CAUTION) por 10 ml de la suspensión homogeneizada.
11. Centrifugar la suspensión a 24.700 x g durante 30 min a 4oC.
12. Realice el siguiente paso rápidamente para preservar la actividad de lisado: divida el sobrenadante uno por uno en alícuotas de 200 ml en viales preenfriados de 1,5 ml e inmediatamente congele con nitrógeno líquido. Conservar a -80oC para su uso posterior.
    ADVERTENCIA: La TDT se clasifica como Irritante y Harmful y, por lo tanto, debe tratarse con cuidado.

2. Preparación de lípidos en solución de aceite

1. Disolver el POPC y el colesterol en cloroformo (CAUTION) por separado, cada uno a una concentración final de 100 mg/ml. Vórtice cada vial por separado.
   1. Combinar los componentes en un vial de vidrio de 2 ml: añadir 50 ml de POPC en cloroformo, 50 ml de colesterol en cloroformo y 500 ml de aceite mineral. Para 100 l de células sintéticas, se requieren 2 viales de lípidos en aceite.
   2. Vórtice, y luego calentar durante aproximadamente 1 h a 80 oC en una campana química para evaporar el cloroformo. Asegúrese de que se ha producido una evaporación completa siguiendo el tiempo/condiciones especificados y supervisando el volumen de la solución.
      NOTA: La solución resultante de lípidos en aceite se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de dos semanas. Para mejorar los resultados, se recomienda utilizar una preparación fresca antes de cada experimento. Las relaciones de lípidos y colesterol se pueden alterar de acuerdo con la composición de membrana deseada. Una alta concentración de colesterol puede conducir a la formación de agregados en la solución celular sintética final.
      ADVERTENCIA: El cloroformo se clasifica como irritante y dañino y, por lo tanto, debe tratarse con cuidado y en zonas con extracción de humos.

3. Preparaciones de soluciones externas, preinternas y de alimentación

1. Preparación de soluciones de stock
   1. Prepare las soluciones de stock enumeradas en la Tabla 2 utilizando agua ultrapura (UPW).
      NOTA: Las soluciones de stock deben prepararse con antelación y almacenarse a -20 oC hasta su uso posterior. El reactivo 7 tiende a formar agregados. La calefacción a 37 oC reducirá la agregación. La agregación leve no afectará significativamente a la reacción. La solución del reactivo 8 es lechosa y turbia.
2. Solución exterior
   1. Disolver la glucosa en DNase/RNase-free H₂O a una concentración final de 200 mM.
   2. Para 100 ml de solución interna, prepare 1,6 ml de solución externa.
3. Solución preinterna
   1. Añadir reactivos 1-14 según las cantidades y la concentración enumeradas en el Cuadro 2. Por ejemplo, para un volumen de celda sintética final de 100 ml, prepare 100 ml de solución interna.
      NOTA: UPW debe añadirse para completar el volumen final requerido. En esta etapa, la mezcla se puede almacenar a 4oC durante unas horas.
4. Solución de alimentación
   1. Añada todos los reactivos de acuerdo con las cantidades y la concentración enumeradas en la Tabla 3.
      NOTA: Utilice la relación 1:1 de la solución de alimentación: solución interna. Para un volumen de células sintéticas final de 100 ml, prepare 100 ml de solución de alimentación. Se recomienda preparar un pequeño exceso de volumen de solución externa, interior y de alimentación.

4. Preparación de células sintéticas

NOTA: Los siguientes volúmenes se ajustan para la preparación de 100 l de células sintéticas.

1. Células sintéticas que producen proteínas
   1. En un tubo de 15 ml, coloque 12 ml de la solución externa y agregue lentamente, encima una capa, de 500 ml de lípidos en solución de aceite. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
   2. Para finalizar la preparación interna de la solución: mezclar los ingredientes internos de la solución en hielo triturado a un volumen final de 100 l descongelando y añadiendo S30-T7 Lysate (reactivo 15) y plásmido de ADN (reactivo 16) a la mezcla almacenada.
   3. Al segundo vial de vidrio de 2 ml con 500 ml de lípidos en solución de aceite, añadir 100 ml de la solución interna. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante 1 minuto y vórtice por otro minuto en el nivel cinco.
      1. Incubar durante 10 minutos sobre hielo triturado y añadir lentamente la emulsión resultante en la parte superior de la fase de aceite en el tubo de 15 ml (a partir de 4.1.1).
   4. Centrífuga durante 10 min a 100 x g y 4oC y luego centrífuga durante 10 min a 400 x g y 4oC. Al final de la centrifugación, se debe observar un pellet en la parte inferior del tubo.
      NOTA: El uso de un rotor de centrífuga de cubo oscilante se prefiere aquí para adquirir una mejor cobertura de una segunda capa de lípidos durante el paso de las gotas de agua en aceite a través de la interfase. En caso de que no haya pellet observable, la velocidad de centrifugación se puede aumentar a 1000 x g. De lo contrario, consulte la sección Discusión que hace referencia a la gravedad específica de la solución externa.
   5. Extraiga el pellet.
      1. Retire el exceso de capa de aceite.
      2. Utilice una punta de pipeta recortada cargada con aproximadamente 400 ml de solución externa para extraer el pellet. Liberar la solución externa mientras pasa a través de la fase de aceite con el fin de recoger sólo el pellet en la fase acuosa.
         1. Limpie la punta después de la extracción del pellet para evitar la transferencia de restos de aceite y transfiera el pellet a un tubo limpio de 1,5 ml.
   6. Centrífuga durante 10 min a 1.000 x g y 4oC, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 ml de solución de alimentación (1:1 relación de soluciones internas: de alimentación).
      NOTA: Aquí también se puede utilizar un rotor de centrífuga de ángulo fijo.
   7. Para la expresión proteica, incubar durante 2 horas a 37 oC sin agitar.
      NOTA: El tiempo óptimo de incubación varía entre diferentes proteínas.
   8. Evaluar la cantidad de proteína producida utilizando un método adecuado de acuerdo con las propiedades de la proteína objetivo.
2. Grupos de control recomendados
   1. Solución interna y confirmación de actividad de lisado
      1. Preparar una solución interna completa (con ADN y lisato S30-T7).
      2. Incubar inmediatamente la reacción anterior utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm o un termomezclador a 1200 rpm, a una temperatura constante de 37oC durante 2 h.
         NOTA: Ajuste el tiempo de incubación para que coincida con el tiempo de incubación de las células sintéticas.
   2. Células sintéticas
      1. Grupo de control negativo: Preparar el protocolo presentado en 4.1 con solución interna sin ADN.
      2. Control positivo: Prepare el protocolo presentado en 4.1 con una solución interna que contenga una codificación de plásmido T7 para un gen reportero.
         NOTA: Agregue un grupo de control positivo compuesto por un gen de reportero, como sfGFP, junto con los grupos de prueba para garantizar el paso de eficiencia de encapsulación.

Resultados

Presentamos un protocolo para la preparación de células sintéticas encapsulando un sistema S30-T7 CFPS basado en BL21 E. coli dentro de las vesículas lipídicas. En la Figura 2se presenta una descripción esquemática del proceso de preparación que incluye una imagen de cada etapa. El éxito del proceso de preparación de células sintéticas depende del rendimiento adecuado de cada etapa y se realiza mediante diferentes parámetros. El protocolo debe ajustarse para adaptarse a...

Discusión

Este protocolo introduce un método simple y asequible para la producción de grandes cantidades de células sintéticas productoras de proteínas. El rendimiento de las células activas depende de una ejecución cuidadosa y precisa del protocolo con énfasis en varios pasos críticos. En la sección de preparación de lisados de este método, es esencial alcanzar la densidad bacteriana adecuada antes de la lisis celular para lograr una cantidad suficiente de proteínas en el lisato bacteriano. En segundo lugar, el proce...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.