Medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células cancerosas

Resumen

El cáncer es una enfermedad letal debido a su capacidad para hacer metástasis en diferentes órganos. Determinar la capacidad de las células cancerosas para migrar e invadir bajo diversas condiciones de tratamiento es crucial para evaluar las estrategias terapéuticas. Este protocolo presenta un método para evaluar las capacidades metastásicas en tiempo real de una línea celular de cáncer de glioblastoma.

Resumen

El cáncer surge debido a la proliferación incontrolada de células iniciada por inestabilidad genética, mutaciones y factores ambientales y de estrés. Estas anomalías adquiridas en complejas redes de señalización molecular multicapa inducen la proliferación y supervivencia celular aberrante, la degradación de la matriz extracelular y la metástasis a órganos distantes. Se estima que aproximadamente el 90% de las muertes relacionadas con el cáncer son causadas por los efectos directos o indirectos de la diseminación metastásica. Por lo tanto, es importante establecer un sistema integral y altamente confiable para caracterizar los comportamientos de las células cancerosas en las manipulaciones genéticas y ambientales. Tal sistema puede dar una comprensión clara de la regulación molecular de la metástasis del cáncer y la oportunidad de desarrollo exitoso de estrategias terapéuticas estratificadas y precisas. Por lo tanto, la determinación precisa de los comportamientos de las células cancerosas, como la migración y la invasión con ganancia o pérdida de la función de los genes, permite evaluar la naturaleza agresiva de las células cancerosas. El sistema de medición en tiempo real basado en la impedancia celular permite a los investigadores adquirir continuamente datos durante todo un experimento y comparar y cuantificar instantáneamente los resultados en diversas condiciones experimentales. A diferencia de los métodos convencionales, este método no requiere fijación, tinción y procesamiento de muestras para analizar las celdas que migran o invaden. Este documento de método hace hincapié en procedimientos detallados para la determinación en tiempo real de la migración y la invasión de células cancerosas de glioblastoma.

Introducción

El cáncer es una enfermedad letal debido a su capacidad para hacer metástasis en diferentes órganos. Determinar los genotipos y fenotipos del cáncer es fundamental para comprender y diseñar estrategias terapéuticas eficaces. Décadas de investigación del cáncer han llevado al desarrollo y adaptación de diferentes métodos para determinar los genotipos y fenotipos del cáncer. Uno de los últimos avances técnicos es la medición en tiempo real de la migración e invasión celular basada en la impedancia celular. La adhesión celular a sustratos y contactos celulares juegan un papel importante en la comunicación y regulación de células a células, el desarrollo y el mantenimiento de los tejidos. Las anomalías en la adhesión celular conducen a la pérdida del contacto celular, la degradación de la matriz extracelular (ECM), y la ganancia de capacidades migratorias e invasoras por las células, todas las cuales contribuyen a la metástasis de las células cancerosas a diferentes órganos^1,,2. Hay varios métodos disponibles para determinar la migración celular (curación de heridas y ensayos de cámara Boyden) y la invasión (ensayo de cámara Matrigel-Boyden)^3,4,5. Estos métodos convencionales son semicuantitativos porque las células necesitan ser etiquetadas con un tinte fluorescente u otros tintes antes o después del experimento para medir los fenotipos celulares. Además, se necesitan interrupciones mecánicas en algunos casos para crear una herida para medir la migración de células al sitio de la herida. Además, estos métodos existentes consumen mucho tiempo, requieren mucha mano de obra y miden los resultados en un solo momento. Además, estos métodos son propensos a realizar mediciones inexactas debido a un manejo inconsistente durante el procedimiento experimental^6.

A diferencia de los métodos convencionales, el sistema de análisis celular en tiempo real mide la impedancia celular en tiempo real sin necesidad de daño mecánico o previo o postmanchado de las células. Más importante aún, la duración de un experimento puede ampliarse para que los efectos biológicos puedan determinarse de una manera dependiente del tiempo. La ejecución del experimento es eficiente en el tiempo y no requiere mucha mano de obra. El análisis de datos es relativamente simple y preciso. En comparación con otros métodos, este método es una de las mejores mediciones en tiempo real para medir la migración celular y la invasión^6,7,8,9.

Giaever y Keese fueron los primeros en describir la medición basada en impedancia de una población celular en la superficie de los electrodos^10. El sistema de análisis celular en tiempo real funciona en el mismo principio. El área de cada pozo de microplaca está aproximadamente 80% cubierta con una serie de microelectrodos de oro. Cuando el área de superficie del electrodo está ocupada por células debido a la adherencia o propagación de las células, la impedancia eléctrica cambia. Esta impedancia se muestra como el índice celular, que es directamente proporcional a las células que cubren el área de la superficie del electrodo después de que penetren en la membrana microporosa (el tamaño del poro mediano de esta membrana es de 8 m)¹¹.

Crk y CrkL son proteínas adaptadoras que contienen dominios SH2 y SH3 y desempeñan un papel importante en diversas funciones celulares, como la regulación del citoesqueleto, la transformación celular, la proliferación, la adhesión, la transición epitelial-mesenquimal, la migración, la invasión y la metástasis mediante la mediación de interacciones proteína-proteína en muchas vías de señalización^{1,12,13,14,15,16,17, 18}. Por lo tanto, es importante determinar las capacidades migratorias e invasivas dependientes de Crk/CrkL de las células cancerosas. Se realizó un análisis celular en tiempo real para determinar las capacidades migratorias e invasivas de las células de glioblastoma tras la desconexión genética de Crk y CrkL.

Este documento de método describe mediciones detalladas de la migración mediada por Crk- y CrkL y la invasión de células de glioblastoma humano.

Protocolo

NOTA: Todos los materiales de cultivo celular deben ser estériles y todo el experimento debe realizarse en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles.

1. Cultivo y Electroporación de la Línea Celular de Glioblastoma U-118MG

1. Cultivo de la línea celular U-118MG en 5% de suero bovino fetal (FBS) que contiene el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco (medio de cultivo) y mantener a 37 oC en una atmósfera húmeda que contiene 5% de incubadora de CO₂ (condiciones de cultivo).
2. Utilice 70– 80% confluente de células sanas para la electroporación.
3. Para la cosecha de células, lave las células que crecen en platos de cultivo con 1x PBS y agregue 2 ml de 0.05% trypsin-EDTA. Colocar en la incubadora durante 30 s y retirar la tripina-EDTA. Recoger las células en el medio de cultivo en un tubo de 15 ml.
4. Cuente las células usando un contador de células automatizado de mano, células centrífugas a 100 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante.
5. Suspenda el pellet celular en el medio de cultivo y tome 600.000 células para cada condición en un tubo de microcentrífuga. Ajuste el número de celda en función de los diseños experimentales y las tasas de crecimiento.
6. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga y agregue 800 ml de solución salina con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Gire hacia abajo usando una minicentrífuga durante 30 s y deseche el sobrenadante.
7. Añadir 60 l de tampón de resuspensión R al pellet de célula y añadir los siRNAs (es decir, siRNA no objetivo, siRNA Crk, SiRNA CrkL, o ambos siRNAs Crk y CrkL) a una concentración de 6 M al tubo de microcentrífuga respectivo. Mézclalos suavemente tocando.
8. Electroporato de 10 l de células con un sistema de electroporación a 1.350 V durante 10 ms con tres pulsos y transfiera las células electroporadas a 5 ml del medio de cultivo. Repita la electroporación para el resto de las células preparadas para cada condición.
9. Complete todas las electroporaciones respectivas. Transfiera las células electroporadas en dos platos de 35 mm por condición y escenifique las en condiciones de cultivo durante 3 días.
10. En el tercer día, tratar todas las células electroporadas en 0.5% FBS que contienen DMEM (medio sérico bajo) durante 6 h antes de la medición de impedancia celular real.

2. Preparación del Sistema de Análisis celular en tiempo real, placas de invasión y migración celular (CIM) y células electroporatadas U-118MG para chapado

1. Coloque el sistema de análisis celular en tiempo real en una incubadora de CO₂ en condiciones de cultivo de 5 a 6 horas antes del inicio del experimento para estabilizar el sistema a las condiciones de cultivo.
2. Para el ensayo de invasión, placa de 50 l de DMEM (medio plano) que contiene gel de matriz extracelular (ECM) a 0,1 g/l en cada pocal de la cámara superior de la placa CIM. Para evitar tener burbujas de aire, utilice el método de pipeteo inverso. Retirar inmediatamente 30 l de gel ECM, dejando 20 l en el pozo.
3. Después del recubrimiento de gel ECM, mantenga la placa en la incubadora en condiciones de cultivo durante 4 horas con la tapa puesta. Durante el recubrimiento y secado en gel ECM, tomar medidas preventivas para evitar el contacto directo de los electrodos de la cámara superior de las placas con las manos, las superficies del gabinete de bioseguridad o la incubadora de CO_2.
4. Para configurar el programa de medición de impedancia, haga doble clic en el icono de software asociado (consulte Tabla de materiales)para abrir la aplicación de software del sistema (unidad de control). Cada cuna tiene una ventana individual con diferentes pestañas para establecer las condiciones experimentales, el intervalo de tiempo y la duración de la medición de impedancia, y el análisis de datos.
5. En la pestaña Diseño, establezca pozos cuadruplicados para cada condición biológica y establezca mediciones de impedancia celular en dos pasos en la pestaña Programación. El primer paso es para una medición de línea base de una sola vez (un barrido con un intervalo de 1 min), y el segundo paso es medir la impedancia de celda en las respectivas cunas individuales para un experimento real. Para la migración, utilice 145 barridos con un intervalo de 10 minutos y, para la invasión, 577 barridos con un intervalo de 10 minutos, configurados individualmente) en las respectivas cunas individuales.
6. Una h antes del inicio de la medición de la impedancia celular, añadir 160 l de DMEM con 10% FBS como quimioatraer en los pozos de la cámara inferior de la placa. Montar la cámara superior que contiene los pozos recubiertos con gel ECM o los pozos sin recubrimiento con la cámara inferior para medir la invasión y la migración, respectivamente.
7. Llene los pozos en la cámara superior con 50 ml de medio sérico bajo y colóquelos en la base del sistema. Compruebe si la unidad de control reconoce todos los pozos haciendo clic en la pestaña Mensaje. Si el mensaje se muestra como OK, la placa de la base está lista para el experimento.
8. Preincubar las placas completamente embaladas en la incubadora en condiciones de cultivo durante 1 h antes de las mediciones en la base del sistema de análisis celular en tiempo real, que es esencial para la aclimatación de una placa embalada a las condiciones de cultivo celular.
9. Para la cosecha de células tratadas con medio sérico bajo, intente las células como en el paso 1.3, recórtelas en un medio sérico bajo y cuente las células como en el paso 1.4.
10. Después de contar, centrífuga de células a 100 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
11. Resuspenda 800.000 células en 800 s de medio sérico bajo para los ensayos de migración e invasión. Además, resuspenda 300.000 células en 2 ml de medio de cultivo y semillas en un plato de 35 mm para el análisis de manchas occidentales para confirmar el derribo regulado de Crk y CrkL.

3. Lectura de línea de base, separación de las células y medición y visualización de impedancia celular

1. Mida la lectura de línea base haciendo clic en el botón Inicio de la base. La línea de base debe leerse después de preincubar las placas durante 1 h en la cuna del sistema de análisis celular en tiempo real en condiciones de cultivo en la incubadora de CO₂ y antes de sembrar las células a los pozos respectivos en la cámara superior.
   NOTA: Una vez que se hace clic en el botón inicio de la base, la unidad de control le preguntará si desea guardar el archivo experimental. Después de guardar el archivo, el analizador de base mide la impedancia de celda de línea base como se establece en el programa inicialmente y entra en un modo de pausa hasta que se vuelve a hacer clic en el botón Inicio de la base para medir la impedancia de celda en el segundo paso.
2. Saque ambas placas para la migración y la invasión desde las cunas después de la medición de línea de base y guárdelas en el gabinete de bioseguridad.
3. Semilla de 100 l de células (100.000 células) en cuadruplicados para cada condición biológica en la cámara superior de la placa CIM en los respectivos pozos, según se programó en la unidad de control de la base mediante pipeteo inverso para evitar burbujas de aire.
4. Después de la sembración, mantenga la placa debajo de un gabinete de bioseguridad durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten uniformemente hasta el fondo. Transfiera la placa de nuevo a la base respectiva y haga clic en el botón de inicio de la base para comenzar a medir la impedancia de la celda según lo programado en el segundo paso de 2.5.
5. Después del último barrido, el experimento finaliza y los resultados se guardan automáticamente.
6. En la pestaña Análisis de datos, visualice los cambios en la impedancia de celda como índice de celda de una manera dependiente del tiempo durante o después de la finalización del experimento. Cada una de las condiciones respectivas de los cuadrúlicados se puede visualizar individualmente o como promedios y / o desviaciones estándar haciendo clic en los cuadros de opción para la desviación media y estándar.
7. Para exportar datos de índice de celda a un archivo de hoja de cálculo, abra un archivo de hoja de cálculo vacío, coloque el cursor en el centro de la ventana Análisis de datos y haga clic con el botón derecho. En el cuadro de diálogo que aparece, elija la opción Copiar datos en formatode lista y pegue los datos en la hoja de cálculo abierta.
8. Ajuste el tiempo en los datos sin procesar para representar la hora de inicio real de la medición de impedancia de celda. La hora de inicio del segundo paso se establece como cero.
   NOTA: La unidad de control tiene la opción de obtener el índice de celda con o sin normalización (es decir, índice de celda normalizado) y visualizar los resultados como una presentación gráfica de una manera dependiente del tiempo. En este ejemplo, los datos de índice de celda se exportan sin normalización para su procesamiento y presentación gráfica.
9. Suelte el experimento haciendo clic en el botón Liberar en cada base.

Resultados

Se ha sugerido que Crk y CrkL son importantes para la migración celular y la invasión en diferentes líneas celulares de cáncer^13,,17. Aunque las proteínas Crk y CrkL son estructural y funcionalmente similares entre sí y juegan funciones superpuestas esenciales^16,,19,20,21, muchos estudios de derribo de genes para Crk y CrkL no han...

Discusión

La medición en tiempo real de la migración e invasión celular utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real es un proceso de monitoreo simple, rápido y continuo con múltiples ventajas significativas sobre los métodos tradicionales que proporcionan datos en un solo punto de tiempo. Al igual que con los métodos tradicionales, las condiciones experimentales deben optimizarse para cada línea celular para el sistema de análisis celular en tiempo real, ya que cada línea celular puede ser diferente en tér...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk siRNA	Dharmacon	J-010503-10
CrkL siRNA	Ambion	ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)	ATCC	302002	Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	51030285	CO2 incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Non-targeting siRNA	Dharmacon	D-001810-01	siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)	LI-COR Biosciences		Western blot imaging system
RTCA software	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc		Instrument used for experiment
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for experiment