Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas

Resumo

O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar a capacidade das células cancerígenas de migrare e invadir diversas condições de tratamento é crucial para avaliar estratégias terapêuticas. Este protocolo apresenta um método para avaliar as habilidades metastáticas em tempo real de uma linha de células cancerígenas do glioblastoma.

Resumo

O câncer surge devido à proliferação descontrolada de células iniciada por instabilidade genética, mutações e fatores ambientais e outros fatores de estresse. Essas anormalidades adquiridas em redes de sinalização molecular complexas e multicamadas induzem a proliferação e sobrevivência de células aberrantes, degradação da matriz extracelular e metástase em órgãos distantes. Estima-se que aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer sejam causadas pelos efeitos diretos ou indiretos da disseminação metastática. Por isso, é importante estabelecer um sistema altamente confiável e abrangente para caracterizar comportamentos de células cancerígenas em manipulações genéticas e ambientais. Tal sistema pode dar uma clara compreensão da regulação molecular da metástase do câncer e da oportunidade para o desenvolvimento bem-sucedido de estratégias terapêuticas estratificadas e precisas. Assim, a determinação precisa de comportamentos de células cancerígenas como migração e invasão com ganho ou perda de função de genes permite avaliar a natureza agressiva das células cancerosas. O sistema de medição em tempo real baseado na impedância celular permite que os pesquisadores adquiram continuamente dados durante todo um experimento e comparem e quantifiquem instantaneamente os resultados em várias condições experimentais. Ao contrário dos métodos convencionais, este método não requer fixação, coloração e processamento de amostras para analisar células que migram ou invadem. Este artigo do método enfatiza procedimentos detalhados para determinação em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas de glioblastoma.

Introdução

O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar genótipos e fenótipos do câncer é fundamental para compreender e projetar estratégias terapêuticas eficazes. Décadas de pesquisa sobre câncer levaram ao desenvolvimento e adaptação de diferentes métodos para determinar genótipos e fenótipos do câncer. Um dos mais recentes desenvolvimentos técnicos é a medição em tempo real da migração celular e invasão baseada na impedância celular. A adesão celular a substratos e contatos celulares desempenham um papel importante na comunicação e regulação celular-célula, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Anormalidades na adesão celular levam à perda do contato celular-celular, degradação da matriz extracelular (ECM) e ganho de capacidades migratórias e invasoras por células, que contribuem para a metástase de células cancerosas para diferentes órgãos^1,2. Vários métodos estão disponíveis para determinar a migração celular (cicatrização de feridas e ensaios da câmara de Boyden) e invasão (ensaio de câmara Matrigel-Boyden)^3,4,5. Esses métodos convencionais são semiquantitativos porque as células precisam ser rotuladas com um corante fluorescente ou outros corantes antes ou depois do experimento para medir fenótipos celulares. Além disso, são necessárias interrupções mecânicas em alguns casos para a criação de uma ferida para medir a migração das células para o local da ferida. Além disso, esses métodos existentes são demorados, intensivos em mão-de-obra e medem os resultados em apenas um ponto de tempo. Além disso, estes métodos são propensos a fazer medições imprecisas devido ao manuseio inconsistente durante o procedimento experimental⁶.

Ao contrário dos métodos convencionais, o sistema de análise celular em tempo real mede a impedância celular em tempo real sem exigir danos pré ou pós-coloração e mecânicos das células. Mais importante, a duração de um experimento pode ser estendida para que os efeitos biológicos possam ser determinados de forma dependente do tempo. Executar o experimento é eficiente em tempo e não é trabalhoso. Analisar dados é relativamente simples e preciso. Comparado a outros métodos, este método é uma das melhores medidas em tempo real para medir a migração e invasão celular^6,7,8,9.

Giaever e Keese foram os primeiros a descrever a medição baseada em impedância de uma população celular na superfície dos eletrodos¹⁰. O sistema de análise celular em tempo real funciona com o mesmo princípio. A área de cada poço de microplacas é aproximadamente 80% coberta com uma matriz de microeletrodos de ouro. Quando a área da superfície do eletrodo é ocupada por células devido à adesão ou disseminação das células, a impedância elétrica muda. Esta impedância é exibida como o índice celular, que é diretamente proporcional às células que cobrem a área da superfície do eletrodo depois de penetrarem na membrana microporosa (o tamanho médio dos poros desta membrana é de 8 μm)¹¹.

Crk e CrkL são proteínas adaptoras que contêm domínios SH2 e SH3 e desempenham papéis importantes em várias funções celulares, como regulação de citoesqueleto, transformação celular, proliferação, adesão, transição epitelial-mesenquimal, migração, invasão e metástase por mediação de interações proteína-proteína em muitas,^{1,12,13,14,15,}16^,17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 ,^{1717 18}. Por isso, é importante determinar as capacidades migratórias e invasivas dependentes de Crk/CrkL das células cancerígenas. A análise celular em tempo real foi realizada para determinar as habilidades migratórias e invasivas das células de glioblastoma após a derrubada genética de Crk e CrkL.

Este artigo do método descreve medições detalhadas da migração mediada por Crk e CrkL e invasão de células de glioblastoma humanas.

Protocolo

NOTA: Todos os materiais de cultura celular precisam ser estéreis e todo o experimento deve ser realizado em um gabinete de biossegurança em condições estéreis.

1. Cultura e Eletroporação da Linha Celular de Glioblastoma U-118MG

1. Cultura A linha celular U-118MG em 5% de soro bovino fetal (FBS) contendo o DMEM (meio de cultura) de Dulbecco e manter a 37 °C em uma atmosfera úmida contendo 5% de incubadora de CO₂ (condições de cultura).
2. Use células saudáveis de 70% a 80% para eletroporação.
3. Para colher células, lave as células que crescem em pratos de cultura com 1x PBS e adicione 2 mL de 0,05% de trypsin-EDTA. Coloque na incubadora por 30 s e remova a trypsin-EDTA. Coletar células no meio de cultura em um tubo de 15 mL.
4. Conte as células usando um contador de celular automatizado portátil, células centrífugas a 100 x g por 5 min, e descarte o supernadante.
5. Suspenda a pelota celular no meio de cultura e leve 600.000 células para cada condição em um tubo de microcentrífuga. Ajuste o número da célula dependendo de projetos experimentais e taxas de crescimento.
6. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge e adicione 800 μL de soro fisiológico de Dulbecco (DPBS). Gire para baixo usando uma minicentrifuge para 30 s e descarte o sobrenadante.
7. Adicione 60 μL de tampão de resuspensão R à pelota celular e adicione os siRNAs (ou seja, siRNA siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA, ou crke e crkL siRNAs) em uma concentração de 6 μM ao respectivo tubo de microcentrífuga. Misture-os suavemente batendo.
8. Eletropora 10 μL de células com sistema de eletroporação a 1.350 V para 10 ms com três pulsos e transferir as células eletroporadas para 5 mL do meio de cultura. Repita a eletroporação para o resto das células preparadas para cada condição.
9. Complete toda a eletroporação respectiva. Transfira as células eletroporadas em dois pratos de 35 mm por condição e as aculte em condições de cultura por 3 dias.
10. No terceiro dia, trate todas as células eletroporadas em 0,5% fbs contendo DMEM (meio de soro baixo) por 6 h antes da medição de impedância celular real.

2. Preparação do Sistema de Análise celular em tempo real, placas de invasão e migração de células (CIM) e células U-118MG eletroporadas para chapeamento

1. Coloque o sistema de análise celular em tempo real em uma incubadora de CO₂ em condições de cultura 5-6 h antes do início do experimento para estabilizar o sistema às condições de cultura.
2. Para o ensaio de invasão, placa de 50 μL de DMEM (meio liso) contendo gel de matriz extracelular (ECM) a 0,1 μg/μL em cada poço da câmara superior da placa CIM. Para evitar ter bolhas de ar, use o método de pipetting reverso. Remova imediatamente 30 μL de gel ECM, deixando 20 μL no poço.
3. Após o revestimento em gel ECM, mantenha a placa na incubadora em condições de cultura por 4h com a tampa ligada. Durante o revestimento e secagem em gel ECM, tome medidas preventivas para evitar o contato direto dos eletrodos da câmara superior das placas com as mãos, as superfícies do gabinete de biossegurança ou a incubadora de CO_2.
4. Para configurar o programa de medição de impedância, clique duas vezes no ícone de software associado (ver Tabela de Materiais)para abrir a aplicação do software do sistema (unidade de controle). Cada berço possui uma janela individual com guias diferentes para definir as condições experimentais, o intervalo e duração da medição de impedância e a análise dos dados.
5. Na guia Layout, configure poços quadruplicatos para cada condição biológica e defina as medidas de impedância celular em duas etapas na guia Agendar. O primeiro passo é para uma medição única da linha de base (uma varredura com um intervalo de 1 min), e o segundo passo é medir a impedância celular em respectivos berços individuais para um experimento real. Para migração, use 145 varreduras com intervalo de 10 minutos, e para invasão, 577 varreduras com um intervalo de 10 minutos, individualmente definido) em respectivos berços individuais.
6. Uma h antes do início da medição de impedância celular, adicione 160 μL de DMEM com 10% de FBS como quimioatrativo nos poços da câmara inferior da placa. Monte a câmara superior contendo os poços revestidos com gel ECM ou poços não revestidos com a câmara inferior para medir a invasão e a migração, respectivamente.
7. Encha os poços da câmara superior com 50 μL de meio sérumo baixo e coloque-os no berço do sistema. Verifique se todos os poços são reconhecidos pela unidade de controle clicando na guia Mensagem. Se a mensagem for exibida como OK,a placa no berço está pronta para o experimento.
8. Pré-incubar as placas completamente embaladas na incubadora em condições de cultura por 1h antes das medições no berço do sistema de análise celular em tempo real, o que é essencial para a climatização de uma placa embalada às condições de cultura celular.
9. Para as células de colheita tratadas com baixo meio sérumo, trippiize as células como na etapa 1.3, colete-as em meio sérumo baixo e conte as células como na etapa 1.4.
10. Após a contagem, as células centrífugas a 100 x g por 5 min e descartam o sobrenadante.
11. Resuspender 800.000 células em 800 μL de baixo meio sérumo para os ensaios de migração e invasão. Além disso, resuspenda 300.000 células em 2 mL de meio de cultura e sementes em um prato de 35 mm para análise de manchas ocidentais para confirmar o knockdown regulado de Crk e CrkL.

3. Leitura da linha de base, semeamento das células e medição e visualização de impedância celular

1. Meça a leitura da linha de base clicando no botão Iniciar do berço. A linha de base deve ser lida após a pré-incubação das placas por 1 h no berço do sistema de análise celular em tempo real sob condições de cultura na incubadora de CO₂ e antes de semear as células para os respectivos poços na câmara superior.
   NOTA: Uma vez que o botão iniciar é clicado, a unidade de controle perguntará se deve salvar o arquivo experimental. Depois que o arquivo é salvo, o analisador de berço mede a impedância celular da linha de base conforme definido no programa inicialmente e entra em um modo de pausa até que o botão iniciar do berço seja clicado novamente para medir a impedância celular na segunda etapa.
2. Retire ambas as placas para migração e invasão dos berços após a medição da linha de base e mantenha-as no gabinete de biossegurança.
3. Sementes 100 μL de células (100.000 células) em quadruplicatos para cada condição biológica na câmara superior da placa CIM nos respectivos poços como programados na unidade de controle do berço por pipetação reversa para evitar bolhas de ar.
4. Após a semeada, mantenha a placa um armário de biossegurança por 30 min à temperatura ambiente para permitir que as células se acomodem uniformemente até o fundo. Transfira a placa de volta para o respectivo berço e clique no botão de início do berço para começar a medir a impedância celular conforme programado na segunda etapa de 2.5.
5. Após a última varredura, o experimento é concluído, e os resultados são salvos automaticamente.
6. Na guia Análise de Dados, visualize as alterações na impedância celular como índice celular de forma dependente do tempo durante ou após a conclusão do experimento. Cada uma das respectivas condições dos quadruplicatos pode ser visualizada individualmente ou como médias e/ou desvios padrão clicando nas caixas de opção para desvio médio e padrão.
7. Para exportar dados de índice de célula para um arquivo de planilha, abra um arquivo de planilha vazio, coloque o cursor no meio da janela análise de dados e clique com o botão direito do mouse. Na caixa de diálogo que aparece, escolha a opção Copiar dados em formato de listae cole os dados na planilha aberta.
8. Ajuste o tempo nos dados brutos para representar o tempo real de início da medição de impedância celular. O tempo de início do segundo passo é definido como zero.
   NOTA: A unidade de controle tem a opção de obter o índice celular com ou sem normalização (ou seja, índice celular normalizado) e visualizar os resultados como uma apresentação gráfica de forma dependente do tempo. Neste exemplo, os dados do índice celular são exportados sem normalização para processamento e apresentação gráfica.
9. Solte o experimento clicando no botão Liberar em cada berço.

Resultados

Foi sugerido que crk e CrkL são importantes para migração celular e invasão em diferentes linhas de células cancerígenas^13,17. Embora as proteínas Crk e CrkL sejam estruturalmente e funcionalmente semelhantes umas às outras e joguem funções sobrepostas essenciais^{16,,19,,20,21}, muitos estudos de knockdown genético para Crk e C...

Discussão

A medição em tempo real da migração e invasão de células usando o sistema de análise celular em tempo real é um processo de monitoramento simples, rápido e contínuo com múltiplas vantagens significativas sobre os métodos tradicionais que fornecem dados em um único ponto de tempo. Assim como os métodos tradicionais, as condições experimentais devem ser otimizadas para cada linha celular para o sistema de análise celular em tempo real, pois cada linha celular pode ser diferente em termos de sua adesão ao ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk siRNA	Dharmacon	J-010503-10
CrkL siRNA	Ambion	ID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)	ATCC	302002	Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	51030285	CO2 incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Non-targeting siRNA	Dharmacon	D-001810-01	siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)	LI-COR Biosciences		Western blot imaging system
RTCA software	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc		Instrument used for experiment
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for experiment