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요약

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.

초록

암은 유전 불안정성, 돌연변이 및 환경 및 그밖 긴장 요인에 의해 시작된 세포의 통제되지 않는 증식 때문에 생깁니다. 복잡한, 다층 분자 신호 네트워크에서 이 취득한 이상은 비정상적인 세포 증식 및 생존, 세포외 매트릭스 분해 및 먼 기관에 전이를 유도합니다. 암 관련 죽음의 대략 90%는 전이성 보급의 직접 또는 간접적인 효력에 기인하기 위하여 추정됩니다. 따라서 유전 적 및 환경 적 조작에 따라 암 세포 행동을 특성화하는 매우 신뢰할 수있는 포괄적 인 시스템을 구축하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템은 암 전이의 분자 조절에 대한 명확한 이해와 계층화 되고 정확한 치료 전략의 성공적인 개발을위한 기회를 제공 할 수 있습니다. 그러므로, 유전자의 기능의 이득 또는 손실과 가진 이동 및 침략과 같은 암세포 행동의 정확한 측정은 암세포의 공격적인 본질의 평가를 허용합니다. 세포 임피던스를 기반으로 한 실시간 측정 시스템을 통해 연구원은 전체 실험 중에 지속적으로 데이터를 수집하여 다양한 실험 조건에서 결과를 즉시 비교및 정량화할 수 있습니다. 기존의 방법과 달리 이 방법은 마이그레이션하거나 침입하는 셀을 분석하기 위해 고정, 염색 및 샘플 처리를 필요로 하지 않습니다. 이 방법 논문은 교모 세포종 암세포의 이동 및 침입의 실시간 측정을위한 상세한 절차를 강조한다.

서문

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 암 유전자형 및 표현형을 결정하는 것은 효과적인 치료 전략을 이해하고 설계하는 데 매우 중요합니다. 암 연구의 수십 년은 암 유전자형 및 표현형을 결정하기 위하여 다른 방법의 발달 그리고 적응으로 이끌어 냈습니다. 최신 기술 개발 중 하나는 세포 임피던스에 기초한 세포 이동 및 침입의 실시간 측정입니다. 기질 및 세포 세포 접촉에 대한 세포 접착은 세포 간 통신 및 조절, 개발 및 조직의 유지 보수에 중요한 역할을 합니다. 세포 접착의 이상은 세포 접촉의 손실로 이끌어 내고, 세포외 매트릭스 (ECM)의 저하, 세포에 의한 철새 및 침입 능력의 이득, 모두는 다른 기관에 암세포의 전이에기여1,,2. 세포 이동(상처 치유 및 보이든 챔버 분석)과 침략(Matrigel-Boyden 챔버 분석)3,,4,,5를결정하는 다양한 방법이 사용 가능하다. 이러한 종래의 방법은 세포 표현형을 측정하기 위해 실험 전후에 형광 염료 또는 기타 염료로 표지되어야 하기 때문에 반정적이다. 또한, 기계적 중단은 상처 부위로세포의 이동을 측정하기 위한 상처를 만들기 위한 경우에 필요하다. 또한 이러한 기존 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 한 번에 결과를 측정합니다. 또한, 이러한 방법은 실험절차6 동안 일관되지 않은 취급으로 인해 부정확한 측정을 하는 경향이 있다.

기존의 방법과 달리 실시간 세포 분석 시스템은 세포의 사전 또는 포스트 염색 및 기계적 손상없이 실시간으로 세포 임피던스를 측정합니다. 더 중요한 것은 생물학적 효과가 시간에 따라 결정될 수 있도록 실험 기간을 연장할 수 있다는 것입니다. 실험을 실행하는 것은 시간 효율적이며 노동 집약적이지 않습니다. 데이터 분석은 비교적 간단하고 정확합니다. 다른 방법에 비해,이 방법은 세포 이동 및 침입을측정하는 가장 좋은 실시간 측정 중 하나입니다6,7,,8,,9.

Giaever 및 Keese는전극(10)의표면에 대한 세포 집단의 임피던스 기반 측정을 최초로 기술했다. 실시간 셀 분석 시스템은 동일한 원리로 작동합니다. 각 마이크로 플레이트의 면적은 약 80%가 금 마이크로 전극으로 덮여 있습니다. 전극 표면적이 셀의 준수 또는 확산으로 인해 셀에 의해 점유되면 전기 임피던스가 변경됩니다. 이러한 임피던스는 전극 표면적을 덮는 세포에 정비례하는 세포 지수로서 표시되며, 이는 미세다공성 멤브레인을 관통한 후(이 멤브레인의 중간 기공 크기는 8 μm)11.

Crk 및 CrkL은 SH2 및 SH3 도메인을 포함하는 어댑터 단백질이며 세포골격 조절, 세포 변형, 증식, 접착, 상피-중간엽 전이, 이동, 침략 및 전이와 같은 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 하며 많은 신호 경로에서 단백질-단백질 상호작용을 많이 중재함으로써,,14,1,,,12,,14, 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14, 14 , 14 , 14 , 14 ,14,1614 18. 따라서, 암세포의 Crk/CrkL 의존적 철새 및 침습적 능력을 결정하는 것이 중요하다. 실시간 세포 분석은 Crk 및 CrkL의 유전자 녹다운 시 교모세포종 세포의 철새 및 침습 능력을 결정하기 위해 수행되었다.

이 방법 논문은 Crk- 및 CrkL 매개 이동 및 인간 교모세포종 세포의 침입의 상세한 측정을 설명합니다.

프로토콜

참고: 모든 세포 배양 물질은 멸균되어야 하며 전체 실험은 멸균 조건하에서 생물 안전 성 캐비닛에서 수행되어야합니다.

1. U-118MG 교모세포종 세포선의 배양 및 전기화

  1. U-118MG 세포주를 5% 태아 소 혈청(FBS)에서 배양하여 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)(배양 배지)를 함유하고 5%CO2 인큐베이터(culture conditions)를 함유하는 습한 분위기에서 37°C에서 유지한다.
  2. 전기 천공에 70- 80% 컨립 건강 세포를 사용하십시오.
  3. 수확 세포를 위해, 1x PBS로 배양 접시에서 성장하는 세포를 세척하고 0.05 % 트립신-EDTA의 2 mL을 추가합니다. 인큐베이터에 30 s를 놓고 트립신-EDTA를 제거합니다. 배양 배지에서 세포를 15 mL 튜브로 수집하였다.
  4. 핸드헬드 자동 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산하고, 100 x g에서 원심 분리 세포를 5 분 동안 계산하고, 상급을 폐기한다.
  5. 배양 배지에서 세포 펠릿을 중단하고 각 조건에 대해 600,000개의 세포를 미세원원지 튜브로 취합니다. 실험 설계 및 성장 속도에 따라 세포 수를 조정합니다.
  6. 세포 현탁액을 미세 원심 분리튜브로 옮기고 덜베코의 인산 완충식식염수(DPBS)를 800 μL추가합니다. 30s의 미니 원심 분리기를 사용하여 스핀 다운하고 상급을 버립니다.
  7. 60 μL의 재서스펜션 버퍼 R을 세포 펠릿에 추가하고 siRNAs(즉, 비표적화 siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA, 또는 CrkL siRNA 둘 다)를 각각의 미세원심분리튜브에 6 μM의 농도로 첨가한다. 두드리면 부드럽게 섞으세요.
  8. 전기포레이트 10 μL의 전기포레이트 세포는 1,350V에서 3개의 펄스로 10ms에 대해 배양 배지의 5 mL로 전기포기 세포를 전달한다. 각 조건에 대해 제조된 나머지 세포에 대해 전기 를 반복합니다.
  9. 모든 전기 를 완료합니다. 조건당 2개의 35 mm 접시로 전기 포지셔닝 된 세포를 옮기고 3 일 동안 배양 조건하에서 배양하십시오.
  10. 셋째 날에, 실제 세포 임피던스 측정 전에 6시간 동안 DMEM(low serum 배지)을 함유하는 0.5% FBS로 모든 전기 포이터세포를 치료한다.

2. 실시간 세포 분석 시스템, 세포 침입 및 이동 (CIM) 플레이트 및 도금용 전기 기재 U-118MG 셀 의 준비

  1. 실험 개시 전 5-6시간 의 배양 조건 하에서CO2 인큐베이터에 실시간 세포 분석 시스템을 배치하여 배양 조건에 시스템을 안정화한다.
  2. 침략 분석의 경우, CIM 플레이트의 상부 챔버의 각 웰에서 0.1 μg/μL에서 세포외 매트릭스(ECM) 겔을 함유하는 DMEM(일반 배지)의 플레이트 50 μL. 기포가 발생하지 않도록 하려면 역피펫팅 방법을 사용하십시오. 즉시 ECM 젤 30 μL을 제거하고 20 μL을 우물에 남깁니다.
  3. ECM 겔 코팅 후, 뚜껑을 닫고 4시간 동안 배양 조건 하에서 인큐베이터에 플레이트를 보관한다. ECM 겔 코팅 및 건조 동안, 판의 상부 챔버의 전극이 손, 생체 안전 성 캐비닛의 표면 또는CO2 인큐베이터와 직접 접촉하지 않도록 예방 조치를 취하십시오.
  4. 임피던스 측정 프로그램을 설정하려면 연결된 소프트웨어 아이콘(재료 표참조)을 두 번 클릭하여 시스템 소프트웨어 응용 프로그램(제어 장치)을 엽니다. 각 크래들은 실험 조건, 임피던스 측정 시간 간격 및 기간 및 데이터 분석을 설정하는 서로 다른 탭이 있는 개별 창이 있습니다.
  5. 레이아웃 탭에서 각 생물학적 조건에 대해 유정을 4배로 설정하고 일정 탭 아래에 2단계 셀 임피던스 측정값을 설정합니다. 첫 번째 단계는 일회성 기준선 측정(1분 간격으로 1회 스윕)을 위한 것이고, 두 번째 단계는 실제 실험을 위해 각각의 개별 크래들에서 세포 임피던스를 측정하는 것이다. 마이그레이션의 경우 10분 간격으로 145개의 스윕을 사용하고, 침공의 경우 각 개별 크래들에서 10분 간격으로 577개의 스윕을 개별적으로 설정합니다.
  6. 세포 임피던스 측정이 시작되기 전에 1h, 플레이트의 하부 챔버의 우물에서 화학력으로 10% FBS로 DMEM의 160 μL을 추가한다. ECM 겔 코팅 웰또는 코팅되지 않은 웰을 포함하는 상부 챔버를 하부 챔버와 함께 조립하여 각각 침략 및 이동을 측정합니다.
  7. 상부 챔버의 우물을 낮은 혈청 배지 50 μL로 채우고 시스템의 요람에 넣습니다. 메시지 탭을 클릭하여 제어 부에서 모든 웰을 인식하는지 확인합니다. 메시지가 확인됨으로표시되면 크래들의 플레이트가 실험에 사용할 준비가 된 것입니다.
  8. 세포 배양 조건에 포장된 플레이트의 적응에 필수적인 실시간 세포 분석 시스템 크래들에서 측정하기 전에 1시간 동안 배양 조건 하에서 완전히 포장된 플레이트를 배양조건하에서 사전 인큐베이터에 서있다.
  9. 낮은 혈청 배지로 처리된 수확 세포의 경우, 1.3단계에서와 같이 세포를 트립시니화하고, 낮은 혈청 배지에서 수집하고, 1.4단계에서와 같이 세포를 카운트한다.
  10. 세기 후, 원심분리세포를 100 x g에서 5분 동안 폐기하고 상한자를 버린다.
  11. 이동 및 침입 세포에 대한 낮은 혈청 배지의 800 μL에서 800,000 개의 세포를 다시 중단시. 또한, 300,000 개의 세포를 배양 배지와 종자 에서 35 mm 접시에 재중단하여 서양 얼룩 분석을 통해 Crk 및 CrkL의 조절 된 녹다운을 확인합니다.

3. 기준선 판독, 셀 파종 및 세포 임피던스 측정 및 시각화

  1. 크래들 시작 버튼을 클릭하여 기준선 판독값을 측정합니다. 기준선은CO2 인큐베이터에서 배양 조건 하에서 실시간 세포 분석 시스템의 요람에서 1시간 동안 플레이트를 사전 인큐베이팅한 후, 상부 챔버내의 각각의 웰에 세포를 파종하기 전에 판독되어야 한다.
    참고: 크래들 시작 버튼을 클릭하면 제어 장치가 실험 파일을 저장할지 여부를 묻습니다. 파일을 저장한 후 크래들 분석기는 프로그램에 설정된 대로 기준 셀 임피던스를 측정하고 크래들 시작 버튼을 다시 클릭하여 두 번째 단계에서 셀 임피던스를 측정할 때까지 일시 중지 모드로 들어갑니다.
  2. 베이스라인 측정 후 요람에서 이동 및 침입을 위해 두 플레이트를 모두 꺼내 생체 안전 캐비닛에 보관하십시오.
  3. 종자 100 μL의 세포(100,000 세포)는 기포를 피하기 위해 역피펫팅에 의해 크래들의 제어부에 프로그래밍된 바와 같이 각각의 웰즈에 있는 CIM 플레이트의 상부 챔버내의 각 생물학적 상태에 대해 4배로 증가한다.
  4. 파종 후, 세포가 바닥까지 고르게 정착할 수 있도록 플레이트를 실온에서 30분 동안 생체 안전 성 캐비닛 아래에 보관하십시오. 플레이트를 각 크래들로 다시 전송하고 크래들 시작 버튼을 클릭하여 2.5의 두 번째 단계에서 프로그래밍된 대로 셀 임피던스 측정을 시작합니다.
  5. 마지막 스윕 이 끝나면 실험이 완료되고 결과가 자동으로 저장됩니다.
  6. 데이터 분석 탭에서 실험 을 완료하는 동안 또는 완료 후 시간에 따라 셀 인덱스로 셀 임피던스의 변화를 시각화합니다. 각 쿼드런플리케이트 조건은 평균 및 표준 편차에 대한 옵션 상자를 클릭하여 개별적으로 또는 평균 및/또는 표준 편차로 시각화할 수 있습니다.
  7. 셀 인덱스 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내려면 빈 스프레드시트 파일을 열고 데이터 분석 창 중간에 커서를 배치하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다. 표시되는 대화 상자에서 데이터 복사 옵션을 목록 형식으로 복사하고데이터를 열린 스프레드시트에 붙여넣습니다.
  8. 원시 데이터의 시간을 조정하여 셀 임피던스 측정의 실제 시작 시간을 나타냅니다. 두 번째 단계 시작 시간은 0으로 설정됩니다.
    참고: 제어 부는 정규화 유무에 관계없이 셀 인덱스를 가져오고 시간 의존적 방식으로 결과를 그래픽 프리젠테이션으로 시각화할 수 있는 옵션을 갖습니다. 이 예제에서는 처리 및 그래픽 프레젠테이션을 위해 정규화 없이 셀 인덱스 데이터를 내보내게 됩니다.
  9. 각 크래들에서 릴리즈 버튼을 클릭하여 실험을 해제합니다.

결과

Crk 및 CrkL은 상이한 암 세포주13,,17에서세포 이동 및 침입에 중요하다고 제안되었다. Crk 및 CrkL 단백질은 구조적으로 그리고 기능적으로 서로 유사하고 필수적인 중첩함수16,,19,,20,,21을재생하지만, Crk 및 CrkL에 대한 많은 유전자 녹다운 연구는 Crk, CrkL 또는 ?...

토론

실시간 셀 분석 시스템을 사용하여 세포 이동 및 침입의 실시간 측정은 단일 시점에서 데이터를 제공하는 기존의 방법에 비해 여러 가지 중요한 장점을 가진 간단하고 빠르며 지속적인 모니터링 프로세스입니다. 기존의 방법과 마찬가지로, 각 세포주들은 기질, 성장, 세포 간 접촉, 및 철새에 대한 접착측면에서 다를 수 있기 때문에 실시간 세포 분석 시스템을 위한 각 세포주마다 실험 조건을 최?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

우리는 실시간 세포 분석 시스템 데이터에 대한 그녀의 기술 지원에 대한 올리비아 펑크 에게 감사드립니다. 우리는 또한이 원고를 편집 어린이 자비 캔자스 시티의 의료 쓰기 센터에 감사드립니다. 이 작품은 소아암 연구를위한 톰 Keaveny 부여 기금에 의해 지원되었다 (TP에) 어린이 자비 병원 중서부 암 얼라이언스 파트너 자문 위원회 자금 (TP에).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinetThermoFisher Scientific1300 Series Class II, Type A2
CIM platesCell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk siRNADharmaconJ-010503-10
CrkL siRNAAmbionID: 3522 and ID: 3524
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)ATCC302002Culture medium used for cell culture
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco21-031-CVDPBS used to wash the cells
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermoFisher Scientific51030285CO2 incubator
MatrigelBD Bioscience354234Extracellular matrix gel
Neon electroporation systemThermoFisher ScientificMPK5000Electroporation system
Neon transfection system 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Electroporation kit
Non-targeting siRNADharmaconD-001810-01siRNA for non targated control
Odyssey CLx (Imaging system)LI-COR BiosciencesWestern blot imaging system
RTCA softwareCell Analysis Division of Agilent Technologies, IncInstrument used for experiment
ScepterMilliporeC85360Handheld automated cell counter
Trypsin-EDTAGibco25300-054
U-118MGATCCATCC HTB15Cell lines used for experiments
xCELLigence RTCA DPCell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc380601050Instrument used for experiment

참고문헌

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