Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral

Resumen

La palmitoylación implica la incorporación de una mitad de palmitato de 16 carbonos a los residuos de cisteína de proteínas diana de una manera reversible. Aquí, describimos un enfoque bioquímico, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitoylación de cualquier proteína de interés en los cascos cerebrales de ratón.

Resumen

Alteraciones dependientes de la actividad en los niveles de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro de la densidad postsináptica (PSD) se cree que representan un mecanismo celular para el aprendizaje y la memoria. La palmitoylation regula la localización y la función de muchas proteínas sinápticas, incluyendo AMPA-R, factores auxiliares y andamios sinápticos de una manera dependiente de la actividad. Identificamos la familia de genes inducidos por la diferenciación de la sinapsis (SynDIG) de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los ACAR y regulan la fuerza de la sinapsis. SynDIG1 se palmitoylated en dos residuos de cisteína ubicados en las posiciones 191 y 192 en la región de la yuxta-transmembrana importante para el desarrollo de sinapsis excitatoria dependiente de la actividad. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitilación de cualquier proteína de interés y demostrar su utilidad con la familia de proteínas SynDIG en los cascos cerebrales de ratón.

Introducción

La S-palmitoylation es una modificación post-traduccional reversible de las proteínas diana que regula la asociación estable de membranas, el tráfico de proteínas y las interacciones proteína-proteína¹. Implica la adición de una mitad de palmitato de 16 carbono a los residuos de cisteína a través del enlace tioéster catalizado por las enzimas palmitoyl acyltransferase (PAT). Muchas proteínas sinápticas en el cerebro son palmitoylated, incluyendo AMPA-Rs y PSD-95, de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización, y la función^2,3,4. Las alteraciones en los niveles de LOS AFOR sinápticos en el PSD a través de la interacción de factores auxiliares con andamios sinápticos como el PSD-95 subyace en la plasticidad sináptica; por lo tanto, los métodos para determinar el estado de palmitoylación de las proteínas sinápticas proporcionan una visión importante de los mecanismos de plasticidad sináptica.

Anteriormente, identificamos la familia SynDIG de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los AmpARs^5. La sobreexpresión o desmontaje de SynDIG1 en las neuronas del hipocampo de ratas disociadas aumenta o disminuye, respectivamente, el tamaño y el número de la sinapsis AMPA-R en un 50 % según se detecte mediante inmunocitoquímica y electrofisiología⁵. Utilizamos el ensayo de intercambio de acilina de acilo (ABE) para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función^6. El ensayo ABE se basa en el intercambio de biotina en cisteínas protegidas por la modificación y posterior purificación de afinidad⁷. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acyl-PEGyl (APEGS)^8,9,10,11,12, que no requiere purificación de afinidad y en su lugar utiliza cambios en la movilidad del gel para determinar el número de modificaciones para una proteína de interés. El protocolo se describe para la investigación de proteínas de membrana endógenas del cerebro del ratón para los que se dispone de anticuerpos adecuados.

Protocolo

Todos los procedimientos de animales siguieron las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis.

1. Preparación de membranas cerebrales de ratón

1. Decapitar el ratón usando un aparato de guillotina y diseccionar el cerebro rápidamente (en <1 min, si es posible, para minimizar los cambios de palmitoylación que pueden ocurrir durante el procedimiento de disección). Homogeneizar inmediatamente en 10 ml de tampón de homogeneización(Tabla 1) en un homogeneizador de vidrio (12 golpes) sobre hielo.
2. Centrifugar los lysates durante 15 min a 1.400 x g a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo sobre hielo. Resuspenda el pellet (6 golpes) en un volumen igual de tampón de homogeneización y centrífuga a 710 x g durante 10 min a 4 oC.
3. Combine los sobrenadores del paso 1.2 y centrífuga a 40.000 x g durante 20 min a 4 oC.
4. Deseche el sobrenadante (fracción citosólica) y resuspenda la fracción de membrana peletada (P2) en el tampón de homogeneización.
   NOTA: Las muestras pueden congelarse y almacenarse a -80 oC para su uso posterior.
5. Realizar un ensayo de ácido bicincino (BCA) para cuantificar los niveles de proteína. Para el ensayo APEGS, comience con una proteína de 100 a 200 mg (máximo 250 mg) en un volumen de 470 ml de tampón A(Tabla 1) en un tubo de 1,5 ml. Sonicar y centrifugar a >13.000 x g durante 10 min a 25oC para eliminar la proteína insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 ml.

2. Ensayo de intercambio de gel de Acyl-PEGyl (APEGS)

1. Interrumpe los enlaces de disulfuro y bloquea las cisteínas libres.
   1. Interrumpir los enlaces de disulfuro mediante la incubación en 25 mM tris(2-carboxiletyl)fosfina (TCEP; 25 l, añadido a partir de una solución de stock; Tabla 1) durante 60 min a 55oC.
   2. Bloquear las cisteínas libres de bloques con 50 mM de N-etilmaleimida (NEM; 12,5 l, añadidos a partir de una solución de stock; Tabla 1) a temperatura ambiente durante 3 h.
      NOTA: La reacción se puede extender durante la noche.
2. Realice precipitaciones de metanol de cloroformo (CM).
   1. Transfiera la solución proteica de un tubo de 1,5 ml a un tubo de polipropileno o de vidrio que se puede centrifugar en un rotor de cubo oscilante a una velocidad modesta. Un tubo de 5 ml es ideal. Agregue cuatro volúmenes (2 ml) de metanol (MeOH) y vórtice brevemente.
   2. Agregue brevemente dos volúmenes (1 ml) de cloroformo y vórtice.
   3. Agregue brevemente tres volúmenes (1,5 ml) de dH₂O y vórtice.
   4. Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 30 min a 25 oC en un rotor de cucharón oscilante.
   5. Retire y deseche cuidadosamente la fase superior.
   6. Añadir 3 volúmenes (1,5 ml) de MeOH y mezclar suavemente pero a fondo, teniendo cuidado de no fragmentar el panqueque de proteína opaca.
   7. Centrífuga a 3.000 x g durante 10 min a 25oC en un rotor de cucharón oscilante.
   8. Usando una pipa serológica de vidrio, eliminar la mayor parte de la fase superior posible sin alterar el panqueque de proteína.
   9. Enjuague cuidadosamente el pellet con 1 ml de MeOH.
   10. Seque al aire el pellet durante al menos 10 min.
       NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC.
3. Realizar escote de enlaces palmitóilo-tioester con hidroxilamina (NH₂OH, HAM).
   1. Resuspenda el precipitado proteico en 125 ml de tampón A y sonice brevemente. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC para eliminar el material insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 ml.
   2. Añadir 375 sl de tampón H (HAM+; Tabla 1) o tampón T (HAM-; Tabla 1) e incubar muestras durante 60 min a 25oC.
4. Repita la precipitación CM descrita en el paso 2.2.
   NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC.
5. Añadir mPEG a las cisteas desprotegidas.
   1. Resuspenda el gránulo en 100 ml de tampón A que contenga 10 mM TCEP. Transfiera a un tubo de 1,5 ml.
      NOTA: Es normal que se haya producido una pérdida significativa de proteína durante los pasos de precipitación de CM. Todos los pasos subsiguientes se realizarán en un tubo de 1,5 ml, limitando el volumen de proteína a un máximo de 120 a 130 l. Esto reducirá la pérdida de proteínas durante la precipitación final del CM.
   2. Añadir 20 mM mPEG-5k (25 l, añadidos desde una solución de stock; Tabla 1) a la muestra de proteínas y mezclar por pipeteo. Incubar durante 60 min a 25oC con rotación de extremo sobre extremo.
   3. Para eliminar mPEG-5k no incorporado, realice la precipitación CM como se describe en el paso 2.2 utilizando estos volúmenes ajustados: 4 volúmenes de MeOH (500 l), 2 volúmenes de cloroformo (250 l) y 3 volúmenes de dH₂O (375 ol). Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC.
   4. Retire cuidadosamente la fase superior como antes, evitando el panqueque grueso y floculante. Añadir 1 mL de MeOH y mezclar suavemente pero a fondo. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC.
   5. Retire cuidadosamente el sobrenadante y enjuague el pellet con 1 ml de MeOH. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC. Pellets secos al aire.
      NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC.
   6. Resuspenda el gránulo seco en 50 ml de tampón A (sin TCEP ni ningún agente reductor). Reservar 5 l para la cuantificación de proteínas BCA. Después de la cuantificación, añadir una cantidad adecuada de 4x Tampón de muestra de Laemmli y, dependiendo de la proteína de interés, potencialmente calentar la muestra a 70 o 100 oC durante 10 min.
      NOTA: La ebullición puede causar la agregación de algunas proteínas de membrana.

3. Análisis de manchas occidentales de proteínas PEGylated

1. Cargue la muestra en un gel de electroforesis de gel de poliacrilamida dodecilo sulfato sódico (SDS-PAGE)¹³.
   NOTA: En este protocolo se utilizó 10% poliacrilamida.
2. Utilice protocolos estándar de separación, transferencia y detección para western blotting¹⁴.
3. Utilice densitometría¹⁴ para determinar las cantidades relativas de proteínas PEGylated frente a proteínas no PEGylated.

Resultados

La inmunoblotación con anticuerpos contra la proteína de interés revela el estado palmitilado (no, por separado, doblemente, etc.) en los efectos cerebrales del ratón según lo determinado por el cambio de movilidad en comparación con las muestras en las que no se incluyó el HAM. Anteriormente, habíamos demostrado que SynDIG1 estaba palmitoylated en dos sitios utilizando el ensayo ABE⁶; sin embargo, no pudimos determinar si ambos sitios fueron modificados en...

Discusión

En nuestro trabajo anterior, utilizamos el ensayo ABE para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función^6. Una limitación es que el ensayo ABE requiere purificación de afinidad con resinas de agarosa conjugadas con mitades de avidina como el paso final en el procedimiento, lo que resulta en una pérdida sig...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydroxylamine (HAM)	ThermoFisher	26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
Microfuge	Eppendorf	5415R	or equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM)	Calbiochem	34115	Highly toxic.
Optical imager for densitometry	Azure Biosystems	Sapphire Biomolecular Imager	or equivalent equipment
Polypropylene tubes with cap	Fisher Scientific	14-956-1D
Serological pipets (glass)	Fisher Scientific	13-678-27D
Table top centrifuge	Beckman	Allegra X-15R	or equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)	EMD Millipore	580560