JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Palmitoylation влечет за собой включение 16-углеродного пальмитата moiety к цистеину остатков целевых белков в обратимым образом. Здесь мы описываем биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка, интересующее в мышиных лизатах мозга.

Аннотация

Считается, что изменения, зависящие от активности в уровнях синаптических рецепторов АМРА (АМРАР) в течение постсинаптической плотности (PSD), представляют собой клеточный механизм обучения и памяти. Palmitoylation регулирует локализацию и функцию многих синаптических белков, включая АМРА-Rs, вспомогательные факторы и синаптические леса в активности-зависимым образом. Мы определили синапсовую дифференциацию индуцированного гена (SynDIG) семейства из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами и регулируют силу синапсов. SynDIG1 является palmitoylated на двух остатков цистеина, расположенных на позициях 191 и 192 в регионе juxta-transmembrane важно для деятельности-зависимых возбуждания синапсов развития. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обменный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка интерес и продемонстрировать свою полезность с семейством SynDIG белков в мышиных мозговых лизатах.

Введение

S-palmitoylation является обратимой пост-трансляционной модификации целевых белков, которая регулирует стабильную мембранную ассоциацию, торговлю белками и белково-белковые взаимодействия1. Она включает в себя добавление 16-углеродного пальмитата moiety к остаткам цистеина через тиостер связи катализировали palmitoyl acyltransferase (PAT) ферментов. Многие синаптические белки в головном мозге palmitoylated, в том числе АМРА-Rs и PSD-95, в активности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации, и функции2,3,4. Изменения в уровнях синаптической АМРАРов в PSD через взаимодействие вспомогательных факторов с синаптической эшафот, таких как PSD-95 лежит в основе синаптической пластичности; Таким образом, методы определения состояния пальмитоилации синаптических белков дают важное представление о механизмах синаптической пластичности.

Ранее мы определили семейство SynDIG из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами5. Переэкспрессия или нокдаун SynDIG1 в диссоциированных крысиных гиппокампальных нейронов увеличивается или уменьшается, соответственно, ampA-R размер синапса и число на 50%, как обнаружено с помощью иммуноцитохимии и электрофизиологии5. Мы использовали ацил-биотин обмена (ABE) анализ, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности зависимых образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. ABE ассси опирается на обмен биотина на цистеины защищены модификации и последующей очистки сродства7. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ8,9,10,11,12, который не требует очистки сродства и вместо этого использует изменения в подвижности геля, чтобы определить количество изменений для белка интерес. Протокол описан для исследования эндогенных мембранных белков из мозга мыши, для которых доступны подходящие антитела.

протокол

Все процедуры для животных следовали руководящим принципам, установленным Национальными институтами здравоохранения (NIH) и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе.

1. Подготовка мембран мозга мыши

  1. Обезглавливать мышь с помощью аппарата гильотины и быстро вскрыть мозг (в 1 мин, если это возможно, чтобы свести к минимуму изменения пальмитоилации, которые могут произойти во время процедуры вскрытия). Гомогенизировать сразу в 10 мл буфера гомогенизации(Таблица 1) в стеклянном гомогенизаторе (12 ударов) на льду.
  2. Центрифуга лисаты в течение 15 мин при 1400 х г при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую трубку на льду. Приостановите гранулы (6 ударов) в равном объеме буфера гомогенизации и центрифуги на уровне 710 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  3. Смешайте супернацианты со ступени 1.2 и центрифугу при 40 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах По Цельсию.
  4. Откажитесь от супернатанта (цитосоликофракции) и отбросите фракцию гранулированной мембраны (P2) в буфере гомогенизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть флэш-заморожены и храниться при -80 градусов по Цельсию для последующего использования.
  5. Выполните анализ бисинхониновой кислоты (BCA) для количественной оценки уровня белка. Для aPEGS анализ, начните с белка 100-200 мг (максимум 250 мг) в объеме 470 л буфера А (Таблица 1) в трубке 1,5 мл. Соникат и центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию, чтобы удалить нерастворимый белок. Перенесите растворимый белок в новую трубку 1,5 мл.

2. Acyl-PEGyl обмен гель-сдвиг (APEGS) асссе

  1. Нарушить дисульфидные связи и блокировать свободные цистеина.
    1. Нарушить дисульфидные связи путем инкубации в 25 мм три (2-карбоксехил) фосфин (TCEP; 25 Л, добавленный из акционерного раствора; Таблица 1) в течение 60 мин при 55 градусах По цельсии.
    2. Блок свободных цистеина с 50 мМ N-этилмалеймид (NEM; 12,5 л, добавленный из бульонного раствора; Таблица 1) при комнатной температуре 3 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может быть продлена на ночь.
  2. Выполните хлороформметаное (СМ) осадки.
    1. Перенесите белковый раствор из 1,5 мл трубки в полипропилена или стеклянную трубку, которую можно центрифугировать в размахивающем роторе ведра с небольшой скоростью. Идеально подходит для трубки 5 мл. Добавьте четыре тома (2 мл) метанола (MeOH) и вихрь кратко.
    2. Добавьте два тома (1 мл) хлороформа и вихря кратко.
    3. Добавьте три тома (1,5 мл) dH2O и вихрь кратко.
    4. Centrifuge образцы на 3000 х г в течение 30 мин при 25 градусов по Цельсию в размахивая ротор ведро.
    5. Тщательно удалите и отбросьте верхнюю фазу.
    6. Добавьте 3 тома (1,5 мл) MeOH и аккуратно перемешайте, но тщательно, стараясь не фрагментировать непрозрачный белковый блин.
    7. Центрифуга при 3000 х г в течение 10 мин при 25 градусах По Цельсию в размахивающем роторе ведра.
    8. Используя стеклянный серологический пипетка, удалите как можно больше верхней фазы, не нарушая белок блин.
    9. Тщательно промыть гранулы с 1 мл MeOH.
    10. Воздух сушить гранулы, по крайней мере 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия.
  3. Выполните расщепление пальмитоил-тиоэстерных связей с гидроксиламином (NH2OH, HAM).
    1. Повторное протеина осаждается в 125 л буфера А и снотворно езлит. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию, чтобы удалить нерастворимый материал. Перенесите растворимый белок в новую трубку 1,5 мл.
    2. Добавьте 375 л буфера H (HAM; Таблица 1) или буфер T (HAM-; Таблица 1) и инкубировать образцы в течение 60 мин при 25 градусах Цельсия.
  4. Повторите осадки СМ, описанные в шаге 2.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия.
  5. Добавьте mPEG в незащищенные цистеина.
    1. Повторное удаление гранул в 100 л буфера А, содержащего 10 мМ TCEP. Перенесите на трубку 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально для значительной потери белка, которые произошли во время см осадков шаги. Все последующие шаги будут выполняться в трубке объемом 1,5 мл, что ограничивает объем белка максимум в 120-130 мл. Это позволит уменьшить потерю белка во время окончательного осадков СМ.
    2. Добавить 20 мМ mPEG-5k (25 л, добавленный из запасного раствора; Таблица 1) к образцу белка и перемешать путем пипетки. Инкубировать в течение 60 мин при 25 градусах Цельсия с конечным вращением.
    3. Для удаления неинкорпорированных mPEG-5k, выполнить СМ осадков, как описано в шаге 2.2 с использованием этих скорректированных объемов: 4 тома MeOH (500 л), 2 тома хлороформа (250 л), и 3 тома dH2O (375 л). Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию.
    4. Тщательно удалите верхнюю фазу, как и раньше, избегая густой, flocculent блин. Добавить 1 мл MeOH и аккуратно перемешать, но тщательно. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию.
    5. Тщательно удалите супернатант и промыть гранулы с 1 мл MeOH. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию. Воздух сухой гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия.
    6. Приостановите высушенные гранулы в 50 злбуфера А (без TCEP или какого-либо редукционного агента). Резерв 5 ЗЛ для количественной оценки белка BCA. После количественной оценки добавьте соответствующее количество 4x буфера образца Laemmli и, в зависимости от интересующего белка, потенциально нагреть образец до 70-100 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кипение может привести к агрегации некоторых мембранных белков.

3. Западный анализ поблужей PEGylated белков

  1. Загрузите образец на гель натрия dodecyl sulfate polyacrylamide гель электрофорес (SDS-PAGE) гель13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе было использовано 10% полиакриламид.
  2. Используйте стандартные протоколы разделения, передачи и обнаружения для западных blotting14.
  3. Используйте денситометрию14 для определения относительного количества PEGylated по сравнению с неПЕГилатированных белков.

Результаты

Иммуноблоттинг с антителами против белка интереса показывает palmitoylated состояние (не, посредственный, вдвойне и т.д.) в мышиных мозговых лисатов, как определяется сдвиг мобильности по сравнению с образцами, в которых HAM не был включен. Ранее мы продемонстрировали, что SynDIG1...

Обсуждение

В нашей предыдущей работе, мы использовали анализ ABE, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 является palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. Огр...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят К. Вулфри за советы и вклад в aPEGS. Эти исследования финансировались за счет научно-исследовательских грантов E.D. от Фонда Уайтхолла и NIH-NIMH (1R01MH19347).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Hydroxylamine (HAM)ThermoFisher26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)NOFME-050MAMW ~5000 kDa
MicrofugeEppendorf5415Ror equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM)Calbiochem34115Highly toxic.
Optical imager for densitometryAzure BiosystemsSapphire Biomolecular Imageror equivalent equipment
Polypropylene tubes with capFisher Scientific14-956-1D
Serological pipets (glass)Fisher Scientific13-678-27D
Table top centrifugeBeckmanAllegra X-15Ror equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)EMD Millipore580560

Ссылки

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  14. . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

157SynDIG1SynDIG4Prrt1Prrt2APEGS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены