JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.

Özet

Postsinaptik yoğunluk (PSD) içindeki sinaptik AMPA reseptörlerinin (AMPA) düzeylerindeki aktiviteye bağlı değişikliklerin öğrenme ve hafıza için hücresel bir mekanizmayı temsil olduğu düşünülmektedir. Palmitoylation ampa-Rs, yardımcı faktörler ve sinaptik iskeleler gibi birçok sinaptik proteinin lokalizasyonunu ve işlevini aktiviteye bağlı bir şekilde düzenler. AMPA'larla ilişki içinde olan ve sinaps gücünü düzenleyen, beyne özgü transmembran proteinlerini kodlayan dört genden oluşan sinaps farklılaşma (SynDIG) ailesini (SynDIG1-4) belirledik. SynDIG1, aktiviteye bağlı eksitatory sinaps gelişimi için önemli olan yan yana-transmembran bölgesinde 191 ve 192 pozisyonlarında bulunan iki sistein kalıntısında palmitoylatedtir. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, asil-PEGyl değişim jel shift (APEGS) tsay, ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak ve fare beyin lysates proteinlerin SynDIG ailesi ile yarar göstermek için.

Giriş

S-palmitoylation kararlı membran ilişkisi, protein ticareti ve protein-proteinetkileşimleridüzenleyen hedef proteinlerin geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyon 1. Palmitoyl acyltransferaz (PAT) enzimleri tarafından katalize edilen tiyoester bağlantısı ile sistein kalıntılarına 16 karbonlu palmitat moiety eklenmesini içerir. Beyindeki birçok sinaptik proteinler palmitoylated, AMPA-Rs ve PSD-95 dahil, bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar düzenlemek için, lokalizasyon, ve fonksiyon2,3,4. PSD-95 gibi sinaptik silikatüritlik ile yardımcı faktörlerin etkileşimi yoluyla PSD sinaptik AMPAR düzeylerinde değişiklikler sinaptik plastisite altında; böylece sinaptik proteinlerin palmitoylation durumunu belirleme yöntemleri sinaptik plastisite mekanizmalarına önemli bir bakış açısı sağlar.

Daha önce,ampaper5 ile ilişkilendirmek beyin özgü transmembran proteinleri kodlama dört gen (SynDIG1-4) SynDIG aile tespit . Aşırı ekspresyon veya parçalanmış sıçan hipokampal nöronlar SynDIG1 knock-down artar veya azalır, sırasıyla, AMPA-R sinaps boyutu ve sayısı ~ 50% olarak immünositokimya ve elektrofizyoloji kullanılarak tespit5. Biz syndig1 iki korunmuş yan yana transmembran Cys kalıntılar (tüm SynDIG proteinlerde bulunan) bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar, lokalizasyon ve fonksiyon6düzenlemek için palmitoylated olduğunu göstermek için acyl-biotin değişimi (ABE) tsay kullanılmıştır. ABE tsay modifikasyon ve sonraki yakınlık saflaştırma7tarafından korunan sistein biotin değişimi dayanır. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, acyl-PEGyl döviz jel vardiya (APEGS) tsay8,9,10,11,12,hangi yakınlık arınma gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein için modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Protokol, fare beyninden gelen ve uygun antikorların bulunduğu endojen membran proteinlerinin araştırılması için tanımlanmıştır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından belirlenen yönergeleri takip ve California Üniversitesi, Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Fare beyin zarlarının hazırlanması

  1. Bir giyotin aparatı kullanarak fareyi decapitate ve hızlı bir şekilde beyin dışarı diseksiyon (in <1 dk, mümkünse, diseksiyon işlemi sırasında oluşabilir palmitoylation değişiklikleri en aza indirmek için). 10 mL'lik homojenizasyon tamponu(Tablo 1)içinde bir cam homogenizer (~12 vuruş) buz üzerinde hemen homojenleştirin.
  2. Santrifüj 15 dk 1.400 x g 4 °C'de. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 710 x g'de eşit homojenizasyon tamponu ve santrifüj hacminde peleti (~6 vuruş) yeniden askıya alın.
  3. 4 °C'de 20 dakika boyunca 40.000 x g'de 1.2 adımve santrifüjdeki süpernatanları birleştirin.
  4. Supernatant atın (sitosolik fraksiyonu) ve homojenizasyon tampon peletli membran (P2) fraksiyonu resuspend.
    NOT: Numuneler daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de dondurulabilir ve saklanabilir.
  5. Protein düzeylerini quantitate için bir bicinchoninic asit (BCA) tsay gerçekleştirin. APEGS ttübünü 1,5 mL'lik bir tüpte 470 μL tampon A(Tablo 1)hacminde ~100−200 mg protein (maksimum 250 mg) ile başlayın. İzole ve santrifüj >13.000 x g 10 dk 25 °C'de çözünmez proteini çıkarmak için. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.

2. Acyl-PEGyl değişim jel-shift (APEGS) teşp

  1. Disülfür bağlarını bozun ve serbest sisteinları engelleyin.
    1. 25 mM tris (2-karboksitil)fosfin (TCEP; 25 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) kuluçkaya yatarak disülfür bağlarını bozar; Tablo 1) 55 °C'de 60 dk.
    2. 50 mM N-etilmaleimid (NEM; 12.5 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) bloksuz sisteinlar; Tablo 1) 3 saat oda sıcaklığında.
      NOT: Reaksiyon bir gecede uzatılabilir.
  2. Kloroform metanol (CM) yağış gerçekleştirin.
    1. Protein çözeltisini 1,5 mL'lik tüpten, sallanan kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüj edilebilen polipropilen veya cam tüpe aktarın. 5 mL'lik bir tüp idealdir. Dört cilt (2 mL) metanol (MeOH) ve girdap kısaca ekleyin.
    2. Kloroform ve girdap kısa bir süre iki cilt (1 mL) ekleyin.
    3. Üç cilt (1,5 mL) dH2O ve girdap kısaca ekleyin.
    4. Numuneleri 3.000 x g'de 25 °C'de 30 dk'da sallanan bir kova rotoruile santrifüj edin.
    5. Üst fazı dikkatlice çıkarın ve atın.
    6. MeOH 3 cilt (1,5 mL) ekleyin ve opak protein gözleme parçalamak için dikkatli olmak, hafifçe ama iyice karıştırın.
    7. 3.000 x g'de 25 °C'de sallanan bir kova rotorunda 10 dakika boyunca santrifüj.
    8. Bir cam serolojik pipet kullanarak, protein gözleme rahatsız etmeden mümkün olduğunca üst faz ın çok çıkarın.
    9. Peleti 1 mL MeOH ile dikkatlice durula.
    10. Hava en az 10 dakika pelet kuru.
      NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
  3. Palmitoyl-tiyoester bağlantılarının hidroksilin (NH2OH, HAM) bölünmesini gerçekleştirin.
    1. Resuspend protein ankesür 125 μL tampon A ve sonicate kısaca. Çözünmez malzemeyi çıkarmak için 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
    2. 375 μL arabellek H (HAM+; Tablo 1) veya tampon T (HAM-; Tablo 1) ve 25 °C'de 60 dk kuluçka numuneleri.
  4. Adım 2.2'de açıklanan CM yağışını tekrarlayın.
    NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
  5. Korumasız sisteinlara mPEG ekleyin.
    1. 10 mM TCEP içeren arabellek A 100 μL resuspend pelet. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
      NOT: CM yağış basamakları sırasında önemli miktarda protein kaybı nın meydana gelmiş olması normaldir. Sonraki tüm adımlar 1,5 mL'lik bir tüpte gerçekleştirilecektir ve protein hacmi maksimum ~120−130 μL'ye kadar kısıtlanacaktır. Bu son CM yağış sırasında protein kaybını azaltacaktır.
    2. 20 mM mPEG-5k ekleyin (25 μL, bir stok çözeltisinden eklendi; Tablo 1) protein numunesi ve pipetleme ile karıştırın. 25 °C'de 60 dakika boyunca inkübün ve uç abitrotasyon.
    3. Dahil edilmemiş mPEG-5k'yi kaldırmak için, bu ayarlanmış hacimleri kullanarak adım 2.2'de açıklandığı gibi CM çökeltme gerçekleştirin: 4 birim MeOH (500 μL), 2 birim kloroform (250°L) ve 3 cilt dH2O (375°L). 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.
    4. Kalın, flocculent gözleme kaçınarak, daha önce olduğu gibi dikkatle üst faz kaldırın. MeOH 1 mL ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.
    5. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 1 mL MeOH ile peleti durula. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Hava kuru pelet.
      NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
    6. Kurutulmuş peleti 50 μL tampon A'da yeniden askıya alın (TCEP veya herhangi bir azaltma maddesi olmadan). BCA protein niceliği için 5 μL ayırın. Sayısallaştırmadan sonra, uygun miktarda 4x Laemmli numune tamponu ekleyin ve ilgi proteinine bağlı olarak numuneyi 10 dakika boyunca 70−100 °C'ye ısıtın.
      NOT: Kaynama bazı membran proteinlerinin toplanmasına neden olabilir.

3. PEGylated proteinlerin Batı leke analizi

  1. Numuneyi sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezine (SDS-PAGE) yükleyin13.
    NOT: Bu protokolde %10 poliakrilamid kullanılmıştır.
  2. Batı lekeleme14için standart ayırma, aktarım ve algılama protokolleri kullanın.
  3. Pegylated ve nonPEGylated proteinlerin göreceli miktarlarını belirlemek için densitometri14 kullanın.

Sonuçlar

İlgi proteinine karşı antikorlarla immünoblotlama, HAM'in dahil olmadığı örneklere kıyasla hareket kabiliyetine göre fare beynindeki palmitoylated durumunu (non, tek başına, iki kat, vb.) ortaya çıkarır. Daha önce, SynDIG1'in ABE tsay6kullanarak iki yerde palmitoylated olduğunu göstermiştik; Ancak her iki sitenin de beyin dokusunda modifiye edilip edilmediği belirlenemedi. Burada SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylat oldu...

Tartışmalar

Önceki çalışmamızda, SynDIG1'in stabiliteyi, lokalizasyonu ve fonksiyon6'yıdüzenlemek için aktiviteye bağımlı bir şekilde iki korunmuş yan yana transmembran Kis kalıntısı (tüm SynDIG proteinlerinde bulunan) palmitoylated olduğunu göstermek için ABE tsayını kullandık. Bir sınırlama ABE tahlil avidin moieties prosedürün son adım olarak konjuge agarose reçine ile yakınlık arınma gerektirir, kantitatif analiz karmaşık sinyal önemli kaybına neden. Ayrıca, ABE tsay b...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar tavsiye ve APEGS tayini üzerinde giriş için K. Woolfrey teşekkür ederim. Bu çalışmalar, Whitehall Vakfı ve NIH-NIMH'den (1R01MH119347) E.D.'ye yapılan araştırma hibeleri ile finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Hydroxylamine (HAM)ThermoFisher26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)NOFME-050MAMW ~5000 kDa
MicrofugeEppendorf5415Ror equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM)Calbiochem34115Highly toxic.
Optical imager for densitometryAzure BiosystemsSapphire Biomolecular Imageror equivalent equipment
Polypropylene tubes with capFisher Scientific14-956-1D
Serological pipets (glass)Fisher Scientific13-678-27D
Table top centrifugeBeckmanAllegra X-15Ror equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)EMD Millipore580560

Referanslar

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  14. . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 157beyinsinapspalmitoylationAMPA resept rSynDIG1SynDIG4Prrt1Prrt2APEGS tsnosu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır