Modelado de metástasis cerebrales a través de inyección intracraneal e imágenes de resonancia magnética

Resumen

El modelado intracraneal de metástasis cerebral se complica por la incapacidad para controlar el tamaño del tumor y la respuesta al tratamiento con métodos precisos y oportunos. La metodología presentada combina la inyección de tumores intracraneales con el análisis de imágenes por resonancia magnética, que cuando se combina, cultiva inyecciones precisas y consistentes, monitorización animal mejorada y mediciones precisas del volumen tumoral.

Resumen

La propagación metastásica del cáncer es una consecuencia desafortunada de la progresión de la enfermedad, los subtipos de cáncer agresivos y/o el diagnóstico tardío. Las metástasis cerebrales son particularmente devastadoras, difíciles de tratar y confieren un mal pronóstico. Si bien la incidencia precisa de metástasis cerebrales en los Estados Unidos sigue siendo difícil de estimar, es probable que aumente a medida que las terapias extracraneales continúan siendo más eficaces en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, es necesario identificar y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para tratar la metástasis en este sitio. Con este fin, la inyección intracraneal de células cancerosas se ha convertido en un método bien establecido en el que modelar la metástasis cerebral. Anteriormente, la incapacidad para medir directamente el crecimiento tumoral ha sido un obstáculo técnico para este modelo; sin embargo, el aumento de la disponibilidad y la calidad de las modalidades de imágenes de animales pequeños, como la resonancia magnética (RM), están mejorando enormemente la capacidad de monitorear el crecimiento tumoral con el tiempo e inferir cambios dentro del cerebro durante el período experimental. En este documento, se demuestra la inyección intracraneal de células tumorales mamarias murinas en ratones inmunocompetentes seguidos de resonancia magnética. El enfoque de inyección presentado utiliza anestesia de isoflurano y una configuración estereotáctica con un taladro automatizado controlado digitalmente e inyección de aguja para mejorar la precisión y reducir los errores técnicos. La RMN se mide con el tiempo utilizando un instrumento 9.4 Tesla en la Universidad Estatal de Ohio James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Las mediciones del volumen tumoral se demuestran en cada momento mediante el uso de ImageJ. En general, este enfoque de inyección intracraneal permite la inyección precisa, el monitoreo diario y las mediciones precisas del volumen tumoral, que combinadas mejoran en gran medida la utilidad de este sistema modelo para probar nuevas hipótesis sobre los controladores de metástasis cerebrales.

Introducción

Las metástasis cerebrales son 10 veces más frecuentes que los tumores adultos del sistema nervioso central primario^1,y se han notificado en casi todos los tipos de tumores sólidos con cáncer de pulmón, cáncer de mama y melanoma que presentan la mayor incidencia^2. Independientemente del sitio del tumor primario, el desarrollo de metástasis cerebral conduce a un mal pronóstico a menudo asociado con deterioro cognitivo, dolores de cabeza persistentes, convulsiones, cambios de comportamiento y/o personalidad^1,,3,,4,,5. En términos de cáncer de mama, ha habido muchos avances en la prevención y tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, el 30% de las mujeres diagnosticadas con cáncer de mama desarrollarán metástasis, y de las que padecen enfermedad en estadio IV, aproximadamente el 7% (SEER 2010-2013) tienen metástasis cerebral^6,,7. Las opciones de tratamiento actuales para la metástasis cerebral implican resección quirúrgica, radiocirugía estereotáctica y/o radioterapia cerebral completa. Sin embargo, incluso con esta terapia agresiva, la mediana de supervivencia para estos pacientes es un corto de 8-11^{meses 7,8,9}. Estas sombrías estadísticas apoyan firmemente la necesidad de identificar e implementar estrategias terapéuticas nuevas y eficaces. Por lo tanto, al igual que con todos los tipos de cáncer que hacen metástasis en el cerebro, es esencial modelar adecuadamente la metástasis cerebral asociada al cáncer de mama (BCBM) en el laboratorio para asegurar avances significativos en el campo.

Hasta la fecha, los investigadores han utilizado una variedad de metodologías para estudiar mecanismos de metástasis en el cerebro, cada uno con claras ventajas y limitaciones^10,,11. Los métodos experimentales de metástasis, como la vena de cola y la inyección intracardiaca, propagan las células tumorales por todo el cuerpo y pueden resultar en una inmensa carga tumoral en otros sitios metastásicos dependiendo de las células inyectadas. Estos resultados son entonces confusos si estudian específicamente la metástasis en el cerebro. El método de inyección de la arteria intracarótida es ventajoso, ya que se dirige específicamente a la siembra cerebral de las células tumorales, pero está limitado, ya que puede ser técnicamente difícil de realizar. La resección ortotópica del tumor primario se considera a menudo el modelo clínicamente más relevante de metástasis, ya que recapitula toda la cascada metastásica. Sin embargo, este enfoque implica períodos de espera prolongados para que se produzca metástasis espontánea con tasas dramáticamente más bajas de metástasis cerebral en comparación con los otros sitios metastásicos como el ganglio linfático, el pulmón y el hígado. A menudo, los animales deben ser retirados de los estudios debido a la carga tumoral en estos otros sitios metastásicos antes del desarrollo de metástasis cerebral. Otros métodos que involucran líneas celulares trópicas del cerebro son eficaces en la metástasis en el cerebro; sin embargo, estos modelos son limitados en que toman tiempo para desarrollarse y a menudo pierden su tropismo con la propagación. Dadas estas limitaciones, los investigadores han utilizado rutinariamente el método de inyección intracraneal para modelar la metástasis del cáncer en el cerebro^11,12,13,14 con diversas metodologías^{15,16,17,18,19}. Se reconoce que este enfoque tiene limitaciones de manera similar, lo más importante en que no permite la investigación de los primeros pasos metastásicos incluyendo la intravasación fuera del tumor primario, la penetración a través de la barrera hematoencefálica, y el establecimiento dentro del cerebro. Sin embargo, permite a los investigadores probar (1) qué factores derivados del tumor median el crecimiento dentro del cerebro (por ejemplo, manipulación genética de un factor oncogénico en las células tumorales), (2) cómo los cambios en el microambiente metastásico alteran el crecimiento del cáncer en este sitio (por ejemplo, la comparación entre ratones transgénicos con componentes estromales alterados) y (3) la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas sobre el crecimiento de lesiones establecidas.

Dada la utilidad potencial del modelo de inyección intracraneal, es absolutamente necesario reducir el error técnico durante la inyección y controlar con precisión el crecimiento tumoral con el tiempo. El método descrito en este documento implica la dosificación continua de la anestesia por gas inhalado, y la implantación directa de células tumorales en el parénquima cerebral mediante un taladro estereotáctico y un soporte de inyección. La administración de anestesia de gas permite ajustar con precisión la profundidad y la longitud de la anestesia, así como garantizar una recuperación rápida y suave. Un sistema de inyección de aguja y taladro automatizado controlado digitalmente mejora la precisión del lugar de inyección y reduce los errores técnicos que a menudo incurren en los métodos de perforación e inyección a mano libre. El uso de imágenes por resonancia magnética (RM) aumenta aún más la precisión en el control del crecimiento tumoral, el volumen tumoral, la respuesta tisular, la necrosis tumoral y la respuesta al tratamiento. La RMN es la modalidad de imagen de elección para los tejidos blandos^20,,21. Esta técnica de diagnóstico por imágenes no utiliza radiación ionizante y se prefiere sobre la Tomografía Computarizada (TC), especialmente para varias sesiones de diagnóstico por imágenes durante el transcurso de un estudio. La RMN tiene una gama mucho mayor de contraste de tejido blando disponible que la TC o la ecografía (USG) y presenta la anatomía con mayor detalle. Es más sensible y específico para las anomalías dentro del propio cerebro. La RMN se puede realizar en cualquier plano de imagen sin tener que mover físicamente el sujeto como es el caso en la imagen óptica 2D USG o 2D. Es importante mencionar que el cráneo no atenúa la señal de RMN como en otras modalidades de diagnóstico por imágenes. La RMN permite la evaluación de estructuras que pueden ser oscurecidas por artefactos de hueso en TC o USG. Una ventaja adicional es que hay muchos agentes de contraste disponibles para la RMN, lo que mejora el límite de detección de lesiones, con relativamente baja toxicidad o efectos secundarios. Es importante destacar que la RMN permite el monitoreo en tiempo real a diferencia de la evaluación histológica en el momento de la necropsia, que es limitada en el descifrado del volumen tumoral. Otras modalidades de diagnóstico por imágenes, como las imágenes bioluminiscentes, son eficaces para la detección y el seguimiento tempranos de tumores a lo largo del tiempo; sin embargo, este método requiere manipulación genética (por ejemplo, etiquetado de luciferasa/GFP) de las líneas celulares y no permite mediciones volumétricas. La RMN es más ventajosa, ya que refleja la monitorización del paciente y se sabe que el análisis volumétrico aguas abajo de las imágenes de RMN está fuertemente correlacionado con el tamaño del tumor histológico en la necropsia^22. La monitorización en serie con detección de RMN también aumenta el seguimiento clínico de las deficiencias neurológicas, en caso de que surjan.

En general, el método presentado de inyección de tumores intracraneales estereotácticos seguido de una resonancia magnética en serie nos permite producir resultados fiables, predecibles y medibles para estudiar los mecanismos de metástasis cerebral en el cáncer.

Protocolo

Todos los métodos descritos en este documento han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad Estatal de Ohio (P.I. Gina Sizemore; Protocolo #2007A0120). Se siguen todas las políticas de cirugía de supervivencia de roedores IACUC, incluyendo el uso de técnicas estériles, suministros, instrumentos, así como la eliminación de pieles y la preparación estéril del sitio de la incisión.

1. Inyección intracraneal de células de cáncer de mama

NOTA: El método descrito en el presente documento utilizaba la línea celular del tumor mamario murino DB7 derivada de un tumor MMTV-PyMT primario²³. Estudios previos han establecido la inyección intracraneal de células DB7 como modelo de BCBM con histología que imita la de la enfermedad humana¹². Es importante destacar que los ratones FVB/N inmunes-competentes se utilizan para este modelo, ya que las células DB7 se derivaron de esta cepa de ratón. Como este es un modelo de cáncer de mama, ratones hembra adultos se utilizan para estos estudios.

1. Preparen las células.
   1. En una capucha estéril, aspire los medios de las placas de cultivo celular utilizando técnicas estándar.
   2. Lave las células con 1x DPBS y pruebe utilizando el protocolo del fabricante.
   3. Añadir un volumen adecuado de medios que contengan FBS para detener la reacción de la tripsina y determinar la concentración de las células utilizando un hemociclo o método preferido.
   4. Células de pellets a 300 x g durante 4 min a 4oC.
   5. Aspirar medios, lavar con 1x DPBS, volver a girar a 300 x g durante 4 min a 4oC.
   6. Células resuspendidas en 1x DPBS a una concentración adecuada, aproximadamente 50.000 células por volumen inyectable de 2 l.
      NOTA: El número de celda depende de la agresividad de la línea y debe ser determinado por el investigador. Usamos rutinariamente 2 l, pero el uso de volúmenes <6 l se informa^{15,16,17,18,19}. Los volúmenes bajos son cruciales para mantener la precisión.
   7. Coloque las células resuspendidas sobre hielo hasta que se inyecten para mantener la viabilidad.
2. Prepare ratones para la cirugía.
   1. Para ratones con piel: retire el pelaje del cráneo, ya sea por crema/loción depilatoria o por afeitado. Hacer esto dentro de 24-48 h antes de la cirugía, ya que realizar este paso demasiado cerca de la cirugía puede interferir con la calidad de la piel y la fuerza de la sutura.
      NOTA: Se utilizaron ratones FVB/N femeninos con un peso aproximado de 25 g debido al estudio del cáncer de mama metastásico, una enfermedad predominantemente femenina.
   2. Administrar analgésicos según lo determinado por el IACUC y el veterinario asistente: una inyección subcutánea de Buprenorfina SR-LAB (0,05-0,1 mg/kg de dosis, Buprenorfina en stock: 0,5 mg/ml para una dosis de 0,0025-0,088 ml) al menos 24 horas antes de la cirugía para proporcionar hasta 72 h de analgesia, que puede repetirse 48-72 h después de la primera dosis, si es necesario. También administrar AINE (20% ibuprofeno en agua potable, p. ej., 1 mg/5 ml) al menos 24-48 h antes de la cirugía y continuar durante 2-7 días después de la cirugía para proporcionar un mínimo de 72 h de analgesia postoperatoria.
      NOTA: En la Universidad Estatal de Ohio, Buprenorphine SR-LAB es administrado por el personal veterinario de Recursos Animales del Laboratorio Universitario, ya que es una sustancia controlada.
3. Preparar unidades estereotácticas para la cirugía.
   1. Encienda todas las máquinas de anestesia, básculas Digitales Vernier e inyectores digitales.
      NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben limpiarse y esterilizarse adecuadamente antes de la cirugía.
   2. Utilice máquinas anestésicas con un accesorio de cámara de inducción en un armario de seguridad biológica (Figura 1A).
   3. Asegúrese de que todos los tubos de las máquinas de anestesia están conectados a los marcos estereotácticos (Figura 1B, inserción 1C) y las abrazaderas en los tubos están abiertos para todas las unidades que se utilizan. Cierre las abrazaderas de los tubos que van a marcos estereotácticos que no se utilizarán para la cirugía.
   4. Ajuste las máquinas de anestesia al caudal de cono de nariz recomendado por el fabricante en función del peso del ratón (por ejemplo, 25 g de peso animal: caudal del cono de la nariz 34 ml/min).
      NOTA: El soporte para la cabeza incluido en esta configuración estereotáctica se recomienda solo para ratones adultos. Asegúrese de que se siguen las recomendaciones del fabricante incluidas con la configuración estereotáctica.
   5. Asegúrese de que el anestésico adecuado (p. ej., isoflurano) precargado en la jeringa esté unido a la máquina de anestesia (Figura 1B).
      NOTA: El exceso de cebado de la jeringa puede causar demasiada anestesia a los ratones durante la cirugía y provocar una sobredosis de anestesia.
   6. Prepare los taladros girando el bloqueo de etapa, insertando un adaptador de broca y una broca de 1 mm en cada taladro y bloquee el taladro apretando manualmente el bloqueo de bits.
   7. Adjunte taladros a los fotogramas estereotácticos (Figura 1C).
   8. Limpie las jeringas Hamilton con 5 lavados alternos de 1x DPBS, luego 70% etanol, luego una vez más en 1x DPBS. Deje a un lado hasta que el animal esté preparado para inyección.
   9. Ajuste el inyector digital para que se entregue a una velocidad de 0,4 l/min y un objetivo de 2 l. Esta velocidad y volumen permiten una introducción lenta de células tumorales en el cerebro, lo que reduce la presión y el daño asociado.
4. Coloque ratones en fotogramas estereotácticos.
   1. Anestfetizar ratones (por ejemplo, isoflurano) utilizando la cámara de inducción antes mencionada.
   2. Mantenga los ratones durante todo el procedimiento en un plano anestésico profundo. El porcentaje de anestesia administrada por la máquina depende de una serie de factores que incluyen: caudal, grado de estimulación y temperatura corporal. Monitorear a los ratones con frecuencia durante todo el procedimiento para la profundidad de la anestesia mediante la evaluación de las respiraciones rítmicas (el animal no está jadeando); falta de reflejo palpebral (aleteo de los párpados cuando se estimula con un aplicador de punta de algodón); y falta de pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del otro (retirada de la extremidad sobre el estímulo nocivo de pellizcar los dedos de los dedos de los dedos).
      NOTA: Diferentes cepas de ratones tendrán una respuesta diferente a la anestesia.
   3. Después de que los ratones estén en un plano anestésico profundo y apropiado, transfiera los ratones a la unidad estereotáctica. Utilice una almohadilla de calentamiento mientras el ratón está en la máquina estereotáctica para mantener la temperatura corporal y un plano anestésico adecuado.
      NOTA: Para lograr un perfil bajo utilizamos calentadores de mano activados por aire colocados dentro de una caja de punta de pipeta invertida (caja elevadora del ratón en la Figura 1D).
   4. Abra la boca del ratón y coloque los dientes en la vaguada de la barra de la boca situada en la pieza de la nariz en el marco estereotáctico (Figura 2A). Deslice el cono nasal sobre la nariz/boca del ratón(Figura 2B).
      1. Coloque los ratones con la cabeza nivelada en la barra de la boca. Abra suavemente la boca con el extremo romo de un aplicador de punta de algodón y deslícelo en su lugar. Asegúrese de que el cono de la nariz esté completamente sobre la nariz del ratón o que la anestesia no se administrará correctamente. El cono nasal no se enganchará con la nariz si los dientes no están sentados dentro de esta ranura (Inset Figura 2A).
   5. Con un hisopo de algodón estéril, coloque el lubricante para los ojos en cada uno de los ojos del ratón. La aplicación de lubricante ocular mitiga el secado de la córnea y reduce la posibilidad de daño corneal y complicaciones postoperatorias relacionadas con el traumatismo corneal.
   6. Estabilice el cráneo del ratón presionando la barra de la oreja izquierda contra el canthus medial de la oreja izquierda, encerrándolo en su lugar usando el tornillo en el marco estereotáctico. A continuación, deslice la barra de la oreja derecha contra el canthus medial de la oreja derecha y atornillar firmemente en el marco estereotáctico (Figura 2B).
      NOTA: Asegúrese de que la cabeza del ratón esté nivelada y recta al colocar las barras de los oídos. Si la cabeza está torcida o en ángulo, la inyección estará en el lugar incorrecto en el cerebro. Las barras de los oídos deben apretarse SOLAMENTE hasta que el cráneo se inmovilice al estimular con sondeo manual moderado.
5. Haz una ventana calvarial.
   1. Preparar y limpiar el cuero cabelludo con 3x pasadas alternas cada una de una solución de betadina y 70% etanol. Debido a la proximidad del sitio quirúrgico a los ojos, utilice la solución de betadina sobre el exfoliante quirúrgico.
   2. Usando un bisturí estéril, haz una incisión de 3 mm a través de la piel a lo largo del aspecto medio central del cráneo (siguiendo la línea de sutura sagital). El sangrado en la incisión debe ser mínimo. En caso de que ocurra, aplique una presión constante y firme en el lugar del sangrado con un aplicador de punta de algodón estéril durante >30 segundos.
   3. Identifique y oriente la broca perpendicular al bregma (Figura 2C), asegurándose de restablecer la escala digital de Vernier a cero.
   4. Mueva el taladro 2 mm lateralmente a la sutura sagital y 1 mm antes a la sutura coronal(Figura 2C). Para la reproducibilidad, asegúrese de que la ubicación a la izquierda o a la derecha de la línea de sutura sagital siga siendo consistente para todos los animales.
   5. Gire el taladro a su velocidad más alta. Asegúrese de que la piel se aleja de la broca para evitar daños tisulares causados por la broca giratoria e inicie cuidadosamente el taladro en el cráneo. Taladre un agujero de aproximadamente 0,5 mm de profundidad a través de la calvaria, lo que resulta en la ventana de calvarial. Tenga cuidado de no bajar el taladro demasiado lejos o perforará en el cerebro. Dejar caer la solución salina estéril en el sitio de perforación mientras el taladro está en movimiento puede compensar cualquier calor generado por la máquina que pueda causar daño térmico al tejido circundante.
   6. Una vez hecha la ventana calvarial, levante cuidadosamente el taladro y retírelo del marco estereotáctico.
   7. Limpie las brocas con 70% de etanol y reserve si se utiliza de nuevo. Si no es así, retire las brocas y sumerja en un 70% de etanol.
6. Inyección de células cancerosas en el cerebro
   1. Conecte la unidad inyectora automática al aparato estereotáctico (Figura 1D).
   2. Tire hacia arriba >2 l de las células completamente resuspendidas en 1x DPBS en una jeringa limpia de Hamilton. Asegúrese de resuspend las células inmediatamente antes de llenar la jeringa para reducir la formación de grumos y asegurar una suspensión celular homogénea. Es ideal para tirar hasta 6-8 l de volumen de la célula para asegurarse de que no hay bolsas de aire / burbujas.
   3. Coloque la jeringa de Hamilton en el aparato inyector y retire la aguja para la inyección dispensando una pequeña cantidad de volumen sobre una cortina estéril desechable para asegurarse de que el inyector funciona correctamente. Limpie la jeringa con un 70% de etanol con un aplicador de punta de algodón(Figura 1D, inserción). Esto elimina las células tumorales del barril externo del eje de la aguja, lo que reduce el riesgo de siembra de células tumorales a lo largo del tracto inyector.
   4. Alinee la punta de la aguja con el centro de la ventana calvarial, casi tocando el cerebro expuesto.
   5. Restablezca la escala digital de Vernier a cero.
   6. Inserte lentamente la aguja a una profundidad de 3 mm en el cerebro y deje que la aguja permanezca en el cerebro durante al menos 60 segundos antes de continuar. Este marco de tiempo permite que el parénquima cerebral se ajuste alrededor de la aguja, lo que reduce la contrapresión y la posible expulsión de células tumorales a lo largo del tracto de la aguja.
   7. Seleccione Ejecutar en la pantalla del inyector para comenzar la entrega de celdas al lugar de inyección. Tomará aproximadamente 5 minutos para inyectar este volumen. El tiempo prolongado para este paso es reducir el daño secundario causado por la fuerza de inyección en el parénquima cerebral.
   8. Una vez terminado el protocolo de inyección, deje que la aguja descanse en el cerebro durante al menos 3 minutos, permitiendo de nuevo que el parénquima cerebral se aclimate a la inyección.
   9. Después de al menos 3 min, levante la aguja del cerebro a una velocidad de 0,75 mm/min. Haga esto de una manera extremadamente lenta y consistente para reducir la contrapresión y el seguimiento del tumor en el tracto de la aguja.
   10. Una vez que la aguja haya salido del cerebro, retire cuidadosamente la jeringa de Hamilton del inyector y límpiela como se describe en el paso 1.2.8.
   11. Aplique cera ósea tibia en la ventana del calvario con un hisopo de algodón estéril. La cera ósea actúa como una barrera física para mantener el tumor dentro del cráneo.
   12. Cierre la incisión (p. ej., 5-0 suturas disolubles PDS en un patrón interrumpido simple O clips de sutura, lo que sea más cómodo para el cirujano).
   13. Detenga la administración de anestesia y retire el ratón del aparato desbloqueando y deslizando las barras de las orejas, deslizando el cono nasal del ratón y desenganchando los dientes de la barra de la boca.
   14. Coloque el ratón en una jaula limpia que esté en un ajuste más cálido a 37 oC para su recuperación. Monitoree los ratones durante la recuperación, que normalmente ocurre 10-15 minutos después de que se haya interrumpido la anestesia.
   15. Después de recuperar el ratón, supervise los criterios de eliminación temprana determinados por la IACUC de la institución anfitriona.

2. Resonancia magnética

1. Administrar el agente de contraste a base de Gadolinium (100 l/20 g de ratón de peso corporal de 0,1 M MultiHance) a ratones mediante inyección intraperitoneal estándar²⁴ 10-20 minutos antes de la toma de imágenes. A continuación, anfielse utilizando una cámara de inducción con un anestésico inhalado (por ejemplo, isoflurano) mezclado con 95% O₂ y 5% CO₂ (es decir, gas de aire de la habitación suministrada).
2. Coloque el ratón sobre un soporte calefactado para mantener la temperatura corporal. Asegure la cabeza con puntas para el oído y una barra de mordida, y coloque el soporte en el imán de 9.4 T equipado con una bobina de superficie cerebral del ratón. Mantener la anestesia durante el tiempo de toma de imágenes, un estudio suele tardar unos 20 minutos por ratón. Supervise la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca (70 lpm) durante todo el procedimiento utilizando una almohada neumática y un sistema de monitorización de animales pequeños.
3. Obtener una imagen del localizador y, a continuación, obtener una imagen del cerebro del ratón utilizando una secuencia RARE ponderada por T2 (TR a 3500-4228 ms, TE-12 ms, Factor RARE a 8, FOV-2,0 x 2,0 cm, tamaño de la matriz 256 x 256, 1 mm o 0,5 mm de espesor de la rebanada, NA-2-4, 15-30 rodajas contiguas) y post contraste basado en gadolinio T1 -secuencia DE RARE ponderada T1 (TR a 1200 ms, TE-7,5 ms, RARE Factor - Factor 4 , FOV 2,0 x 2,0 cm, tamaño de la matriz a 256 x 256, 1 mm o 0,5 mm de espesor de la rebanada, NA-2-4, 15-30 rodajas contiguas).
4. Después de la imagen, coloque el ratón en una jaula en un juego de calentador a 37 oC para su recuperación.

3. Mediciones volumétricas del tumor

1. Obtención del volumen total del tumor
   1. Open MRI DICOM data file in ImageJ, un software de procesamiento de imágenes disponible como descarga gratuita a través de los Institutos Nacionales de Salud (https://imagej.nih.gov/ij/)²⁵.
      NOTA: ImageJ permite la visualización de archivos DICOM, que es necesario para utilizar las dimensiones de píxeles incrustadas para los cálculos de volumen tumoral (consulte Imagen, Propiedades donde "unidad de longitud" se puede establecer como se desee (por ejemplo, mm)).
   2. Utilice la herramienta Selecciones a mano alzada para dibujar un contorno alrededor del tumor. Realice estas selecciones en una habitación oscura para mejorar la visibilidad. No ajuste el brillo/contraste para mantener la coherencia entre las sesiones.
   3. En la pestaña Analizar, seleccione Medir para obtener el área de la región seleccionada. Si la unidad de milímetros fue elegida en el paso 3.1.1., el área se dará en milímetros cúbicos. Si lo desea, incruste la selección a mano alzada seleccionando ctrl+D. Cambie el color de salida yendo a Editar . Opciones ? Color. Convierta la imagen en una imagen RGB(Imagen ) Tipo de tipo ? Color RGB) antes de guardarlo como un archivo .tif.
   4. Continúe con la medición de todas las rebanadas que contienen tumores para un ratón individual y copie los valores en un programa de software de análisis de datos adecuado (por ejemplo, Microsoft Excel o GraphPad Prism).
   5. Sume las áreas de cada rebanada para obtener el volumen total del tumor. Asegúrese de corregir el área en función del grosor de la rebanada (área/espesor).
   6. Complete los pasos 3.1.1.-3.1.5. hasta que todos los ratones tengan un volumen tumoral total. Dada la naturaleza un tanto subjetiva de esbozar los tumores, es ideal si la misma metodología se repite varias veces y se promedia para reducir el error técnico.
   7. Para establecer barras de escala, abra el archivo de datos DICOM y vaya a Analizar . Herramientas ? Barra de escala. Puesto que las dimensiones ya están incrustadas en el archivo DICOM, simplemente elija la longitud/ancho deseado. Encubierto a una imagen RGB (Imagen ? Tipo de tipo ? Color RGB) antes de guardarlo como un archivo .tif.

Resultados

En la Figura 3 se describe la cuantificación del volumen tumoral de un solo ratón en dos puntos de tiempo (día 7 y día 10) después de la inyección de células tumorales mamarias murinas. Para este experimento, se inyectaron 50.000 células DB7, y el cerebro del animal fue evaluado por resonancia magnética. Para cada escaneo, se capturaron 30 rodajas (0,5 mm de espesor). La evaluación de las 30 rebanadas por exploración reveló que en el día 7 después de la inyección, 5 rebanadas ...

Discusión

La utilización de la inyección intracraneal seguida de la monitorización en serie con RMN proporciona la capacidad única de visualizar el crecimiento tumoral con precisión del volumen tumoral a lo largo del tiempo. La aplicación del análisis de imágenes digitales permite la interpretación de lesiones cerebrales para el volumen tumoral, hemorragia, necrosis y respuesta al tratamiento.

Al igual que con cualquier procedimiento, hay pasos clave que deben seguirse para el éxito. En primer...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters