Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

Riepilogo

La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall'incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l'iniezione di tumore intracranico con l'analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.

Abstract

La diffusione metastatica del cancro è una sfortunata conseguenza della progressione della malattia, dei sottotipi di cancro aggressivi e / o della diagnosi tardiva. Le metastasi cerebrali sono particolarmente devastanti, difficili da trattare e conferiscono una prognosi scadente. Mentre l'incidenza precisa delle metastasi cerebrali negli Stati Uniti rimane difficile da stimare, è probabile che aumenti man mano che le terapie extracranici continuano a diventare più efficaci nel trattamento del cancro. Pertanto, è necessario identificare e sviluppare nuovi approcci terapeutici per trattare la metastasi in questo sito. A tal fine, l'iniezione intracranale di cellule tumorali è diventata un metodo ben consolidato in cui modellare la metastasi cerebrale. In precedenza, l'incapacità di misurare direttamente la crescita tumorale è stato un ostacolo tecnico a questo modello; tuttavia, l'aumento della disponibilità e della qualità delle piccole modalità di imaging animale, come la risonanza magnetica (MRI), stanno migliorando notevolmente la capacità di monitorare la crescita del tumore nel tempo e dedurre cambiamenti all'interno del cervello durante il periodo sperimentale. In questo caso, viene dimostrata l'iniezione intracrania di cellule tumorali mammarie murine in topi immunocompetenti seguita da risonanza prima. L'approccio di iniezione presentato utilizza l'anestesia isoflurana e una configurazione stereotassica con un trapano e un'iniezione di ago automatizzati controllati digitalmente per migliorare la precisione e ridurre gli errori tecnici. La risonanza magnetica viene misurata nel tempo utilizzando uno strumento da 9,4 Tesla nella James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource dell'Ohio State University. Le misurazioni del volume tumorale sono dimostrate in ogni momento attraverso l'uso di ImageJ. Nel complesso, questo approccio di iniezione intracranico consente un'iniezione precisa, un monitoraggio giornaliero e misurazioni accurate del volume tumorale, che combinate notevolmente migliorare l'utilità di questo sistema modello per testare nuove ipotesi sui driver delle metastasi cerebrali.

Introduzione

Le metastasi cerebrali sono 10 volte più comuni dei tumori del sistema nervoso primario adulto¹e sono state riportate in quasi tutti i tipi di tumore solido con cancro ai polmoni, cancro al seno e melanoma che presentano la più alta incidenza². Indipendentemente dal sito tumorale primario, lo sviluppo della metastasi cerebrale porta a una prognosi scadente spesso associata a declino cognitivo, mal di testa persistente, convulsioni, cambiamenti comportamentali e / o di^{personalità 1,,3,4,5}. In termini di cancro al seno, ci sono stati molti progressi nella prevenzione e nel trattamento della malattia. Tuttavia, il 30% delle donne a cui è stato diagnosticato un cancro al seno continuerà a sviluppare metastasi e di quelle con malattia allo stadio IV, circa il 7% (SEER 2010-2013) ha metastasi cerebrale^6,7. Le attuali opzioni di trattamento per la metastasi cerebrale comportano resezione chirurgica, radiochirurgia stereotassica e / o radioterapia cerebrale intera. Eppure, anche con questa terapia aggressiva, la sopravvivenza mediana per questi pazienti è di breve 8-11 mesi^7,8,9. Queste statistiche cupe sostengono fortemente la necessità di identificare e ae attuazione di nuove ed efficaci strategie terapeutiche. Pertanto, come per tutti i tumori che metastasi al cervello, è essenziale modellare correttamente la metastasi cerebrale associata al cancro al seno (BCBM) in laboratorio per garantire progressi significativi nel campo.

Ad oggi, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di metodologie per studiare meccanismi di metastasi al cervello, ognuno con vantaggi e^{limiti distinti 10,,11}. Metodi sperimentali di metastasi come la vena della coda e l'iniezione intracardiaca diffondono cellule tumorali in tutto il corpo e possono causare un immenso carico tumorale in altri siti metastatici a seconda delle cellule iniettate. Questi risultati si confondono se studiano specificamente la metastasi al cervello. Il metodo di iniezione dell'arteria intracarotide è vantaggioso in quanto si rivolge specificamente alla semina cerebrale delle cellule tumorali, ma è limitato in quanto può essere tecnicamente difficile da eseguire. La resezione del tumore primario ortotopico è spesso considerata il modello di metastasi clinicamente più rilevante in quanto riassume l'intera cascata metastatica. Tuttavia, questo approccio prevede periodi di attesa prolungati per la metastasi spontanea con tassi drammaticamente più bassi di metastasi cerebrale rispetto agli altri siti metastatici come il linfonodo, il polmone e il fegato. Spesso, gli animali devono essere rimossi dagli studi a causa del carico tumorale in questi altri siti metastatici prima dello sviluppo della metastasi cerebrale. Altri metodi che coinvolgono linee cellulari tropiche cerebrali sono efficaci nel metastasi al cervello; tuttavia, questi modelli sono limitati in quanto prendono tempo per svilupparsi e spesso perdono il loro tropismo con la propagazione. Date queste limitazioni, i ricercatori hanno regolarmente utilizzato il metodo di iniezione intracranico per modellare la metastasi tumorale^{al cervello 11,,12,,13,,14} con metodologie variabili^{15,,16,,17,,18,,19}. È riconosciuto che questo approccio ha allo stesso modo dei limiti, soprattutto in quanto non consente di investigazione dei primi passaggi metastatici tra cui l'intravasazione dal tumore primario, la penetranza attraverso la barriera ematica e la creazione all'interno del cervello. Tuttavia, consente ai ricercatori di testare (1) quali fattori derivati dal tumore mediano la crescita all'interno del cervello (ad esempio, manipolazione genetica di un fattore oncogenico nelle cellule tumorali), (2) come i cambiamenti nel microambiente metastatico alterano la crescita del cancro in questo sito (ad esempio, confronto tra topi transgenici con componenti stromali alterati) e (3) efficacia di nuove strategie terapeutiche sulla crescita di lesioni consolidate.

Data la potenziale utilità del modello di iniezione intracranico, è assolutamente necessario ridurre l'errore tecnico durante l'iniezione e monitorare con precisione la crescita del tumore nel tempo. Il metodo descritto nel presente documento prevede il dosamento continuo dell'anestesia del gas inalato e l'impianto diretto di cellule tumorali nel parenchima cerebrale utilizzando un trapano stereotattico e un supporto di iniezione. La somministrazione dell'anestetico gassoso consente di perfezionare la profondità e la lunghezza dell'anestesia e di garantire un recupero rapido e fluido. Un sistema di iniezione automatizzata di trapani e aghi controllato digitalmente migliora la precisione del sito di iniezione e riduce gli errori tecnici spesso sostenuti dalla perforazione e dai metodi di iniezione a mano libera. L'uso della risonanza magnetica (MRI) aumenta ulteriormente la precisione nel monitoraggio della crescita del tumore, del volume tumorale, della risposta dei tessuti, della necrosi tumorale e della risposta al trattamento. La risonanza magnetica è la modalità di imaging preferita per i tessuti^{molli 20,,21}. Questa tecnica di imaging non utilizza radiazioni ionizzanti ed è preferita rispetto alla tomografia computerizzata (CT), specialmente per più sessioni di imaging durante il corso di uno studio. La risonanza magnetica ha una gamma molto più ampia di contrasto dei tessuti molli disponibili rispetto alla TC o all'imaging ad ultrasuoni (USG) e presenta l'anatomia in modo più dettagliato. È più sensibile e specifico per le anomalie all'interno del cervello stesso. La risonanza magnetica può essere eseguita su qualsiasi piano di imaging senza dover spostare fisicamente il soggetto, come nel caso dell'imaging ottico 2D USG o 2D. È importante ricordare che il cranio non attenua il segnale MRI come in altre modalità di imaging. La risonanza valutazione consente la valutazione di strutture che possono essere oscurate da artefatti di osso in CT o USG. Un ulteriore vantaggio è che ci sono molti agenti di contrasto disponibili per la risonanza prima, che migliora il limite di rilevamento della lesione, con tossicità relativamente bassa o effetti collaterali. È importante sottolineare che la risonanza prima è possibile monitorare in tempo reale a differenza della valutazione istologica al momento della necroscopia, che è limitata nella decifrazione del volume tumorale. Altre modalità di imaging, come l'imaging bioluminescente, sono effettivamente efficaci per il rilevamento e il monitoraggio precoce del tumore nel tempo; tuttavia, questo metodo richiede la manipolazione genetica (ad esempio, l'etichettatura luciferasi/GFP) delle linee cellulari e non consente misurazioni volumetriche. La risonanza istologica è ulteriormente vantaggiosa in quanto rispecchia il monitoraggio del paziente e l'analisi volumetrica a valle delle immagini mr è nota per essere fortemente correlata alla dimensione istologica del tumore alla^{necroscopia 22}. Il monitoraggio seriale con screening mri aumenta anche il monitoraggio clinico delle menomazioni neurologiche, in caso di insorgere.

Nel complesso, il metodo presentato di iniezione di tumore intracranico stereotassico seguito dalla risonanza prima seriale ci consente di produrre risultati affidabili, prevedibili e misurabili per studiare i meccanismi della metastasi cerebrale nel cancro.

Protocollo

Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protocollo #2007A0120). Vengono seguite tutte le politiche della chirurgia di sopravvivenza dei roditori IACUC, incluso l'uso di tecniche sterili, forniture, strumenti, nonché la rimozione della pelliccia e la preparazione sterile del sito di incisione.

1. Iniezione intracranale di cellule tumorali del seno

NOTA: Il metodo descritto nel presente documento ha utilizzato la linea cellulare tumorale mammaria murina DB7 derivata da un tumore MMTV-PyMT primario²³. Studi precedenti hanno stabilito l'iniezione intracranale di cellule DB7 come modello di BCBM con istologia che imita quella della malattia umana¹². È importante sottolineare che per questo modello vengono utilizzati topi FVB/N immuno-competenti poiché le cellule DB7 sono state derivate da questo ceppo di topo. Poiché questo è un modello di cancro al seno, i topi femmine adulti vengono utilizzati per questi studi.

1. Preparare le celle.
   1. In un cappuccio sterile, aspirare i supporti dalle piastre di coltura cellulare utilizzando tecniche standard.
   2. Lavare le celle con 1x DPBS e tripinare utilizzando il protocollo del produttore.
   3. Aggiungere un volume appropriato di mezzi contenenti FBS per interrompere la reazione della tripina e determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro o un metodo preferito.
   4. Celle a pellet a 300 x g per 4 min a 4 °C.
   5. Aspirare i supporti, lavare con 1x DPBS, ruotare a 300 x g per 4 min a 4 °C.
   6. Resuspend cellule in 1x DPBS ad una concentrazione appropriata, circa 50.000 cellule per volume iniettabile di 2 μL.
      NOTA: Il numero di cellulare dipende dall'aggressività della linea e deve essere determinato dallo sperimentatore. Usiamo regolarmente 2 μL, ma l'uso di volumi <6 μL è riportato^{15,,16,17,,18,19}. I volumi bassi sono fondamentali per mantenere la precisione.
   7. Posizionare le cellule resuspended sul ghiaccio fino a quando non vengono iniettate per mantenere la vitalità.
2. Preparare i topi per l'intervento chirurgico.
   1. Per topi con pelliccia: rimuovere la pelliccia dal cranio, sia per crema /lozione depilatoria che per rasatura. Fallo entro 24-48 ore prima dell'intervento chirurgico poiché eseguire questo passaggio troppo vicino all'intervento chirurgico può interferire con la qualità della pelle e la forza della sutura.
      NOTA: Topi FVB/N femminili del peso di circa 25 g sono stati utilizzati a causa dello studio del cancro al seno metastatico, una malattia prevalentemente femminile.
   2. Somministrare analgesici come determinato dalla IACUC e veterinario curante: iniezione sottocutanea di Buprenorfina SR-LAB (dose di 0,05-0,1 mg/kg, Stock di buprenorfina: 0,5 mg/mL per un dosaggio di 0,0025-0,088 mL) almeno 24 ore prima dell'intervento chirurgico per fornire fino a 72 h di analgesia, che può essere ripetuta 48-72 ore dopo la prima dose, se necessario. Somministrare anche FANS (20% di ibuprofene in acqua potabile, ad esempio, 1 mg /5 mL) almeno 24-48 ore prima dell'intervento chirurgico e continuare per 2-7 giorni dopo l'intervento chirurgico per fornire un'analgesia post-operatoria minima di 72 ore.
      NOTA: Presso la Ohio State University, Buprenorphine SR-LAB è amministrata dal personale veterinario dell'University Lab Animal Resources in quanto è una sostanza controllata.
3. Preparare unità stereotattiche per l'intervento chirurgico.
   1. Accendi tutte le macchine per anestesia, le bilance Vernier digitali e gli iniettori digitali.
      NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere adeguatamente puliti e sterilizzati prima dell'intervento chirurgico.
   2. Utilizzare macchine anestetiche con un attacco a camera di induzione in un armadio di sicurezza biologico (Figura 1A).
   3. Assicurarsi che tutti i tubi delle macchine per anestesia siano collegati ai telai stereotassici (Figura 1B, inserto 1C) e che i morsetti sui tubi siano aperti per tutte le unità utilizzate. Chiudere eventuali morsetti sui tubi che vanno a fotogrammi stereotassici che non verranno utilizzati per l'intervento chirurgico.
   4. Impostare le macchine per l'anestesia sulla portata consigliata del cono del naso raccomandata in base al peso del mouse (ad esempio, 25 g di peso animale: portata del cono del naso 34 mL / min).
      NOTA: Il portacapo incluso in questo set up stereotattico è raccomandato solo per topi adulti. Assicurarsi che le raccomandazioni del produttore incluse nella configurazione stereotassiva siano seguite.
   5. Assicurarsi che l'anestetico appropriato (ad esempio, isoflurane) preriempito nella siringa sia collegato alla macchina per anestesia(Figura 1B).
      NOTA: L'troppo adescamento della siringa può causare la consegna di troppa anestesia ai topi durante l'intervento chirurgico e causare un sovradosaggio anestetico.
   6. Preparare i trapani ruotando il blocco del palco, inserendo un adattatore per punte bit e una punta di perforazione da 1 mm in ogni trapano e bloccare il trapano stringendo manualmente il blocco del bit.
   7. Collegare trapani ai telai stereotassici (Figura 1C).
   8. Pulire le siringhe Hamilton con 5 lavaggi alternati di 1x DPBS, quindi il 70% di etanolo, quindi ancora una volta in 1x DPBS. Mettere da parte fino a quando l'animale non è precondizione per l'iniezione.
   9. Impostare l'iniettore digitale per la consegna ad una velocità di 0,4 μL/min e un obiettivo di 2 μL. Questo tasso e volume consentono una lenta introduzione delle cellule tumorali nel cervello, che riduce la pressione e i danni associati.
4. Posizionare i topi su fotogrammi stereotassici.
   1. Anestetizzare i topi (ad esempio, isoflurane) usando la suddetta camera di induzione.
   2. Mantenere i topi durante tutta la procedura su un piano anestetico profondo. L'anestesia % somministrata dalla macchina dipende da una serie di fattori tra cui: portata, grado di stimolazione e temperatura corporea. Monitorare frequentemente i topi durante tutta la procedura per la profondità dell'anestesia valutando le respirazioni ritmiche (l'animale non sta ansimando); mancanza di riflesso palpebrale (svolazzante delle palpebre quando stimolato con un applicatore a punta di cotone); e mancanza di dito del piedi (ritiro dell'arto sul noxious stimolo di pizzicare le dita dei piedi).
      NOTA: Diversi ceppi di topi avranno una risposta diversa all'anestesia.
   3. Dopo che i topi sono su un piano anestetico appropriato e profondo, trasferire i topi all'unità stereotassica. Utilizzare un tappetino riscaldante mentre il mouse si trova sulla macchina stereotassica per mantenere la temperatura corporea e un piano anestetico appropriato.
      NOTA: Per ottenere un profilo basso utilizziamo scaldamani attivati dall'aria posizionati all'interno di una scatola di punta della pipetta rovesciata (scatola di elevamento del mouse nella figura 1D).
   4. Aprire la bocca del mouse e posizionare i denti nel trogolo della barra della bocca situato sul nasello sul telaio stereotattico (Figura 2A). Far scorrere il cono del naso sul naso/bocca del topo (Figura 2B).
      1. Posizionare i topi con la testa livellata sulla barra della bocca. Aprire delicatamente la bocca con l'estremità smussata di un applicatore a punta di cotone e scivolare in posizione. Assicurarsi che il cono del naso sia completamente sopra il naso del mouse o che l'anestesia non venga consegnata correttamente. Il cono del naso non si innesta con il naso se i denti non sono seduti all'interno di questa scanalatura (Figura insorgenza 2A).
   5. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, posizionare il lubrificante per gli occhi su ciascuno degli occhi del mouse. L'applicazione del lubrificante per gli occhi mitiga l'essiccazione della cornea e riduce la possibilità di danni corneali e complicanze postoperatorie legate al trauma corneale.
   6. Stabilizzare il cranio del mouse deprimendo la barra dell'orecchio sinistra contro il canthus mediale dell'orecchio sinistro, bloccandolo in posizione usando la vite sul telaio stereotattico. Quindi far scorrere la barra dell'orecchio destra contro il canthus mediale dell'orecchio destro e avvitare stretto sul telaio stereotattico (Figura 2B).
      NOTA: Assicurarsi che la testa del mouse sia livellata e dritta quando si posizionano le barre dell'orecchio. Se la testa è storta o angolata, l'iniezione sarà nel posto errato nel cervello. Le barre dell'orecchio devono essere serrate SOLO fino a quando il cranio non viene immobilizzato dopo la stimolazione con un moderato sondaggio manuale.
5. Crea una finestra calvariale.
   1. Preparare e pulire il cuoio capelluto con 3 passaggi alternati ciascuno di una soluzione di betadina e 70% di etanolo. A causa della vicinanza del sito chirurgico agli occhi, utilizzare la soluzione di betadina sopra lo scrub chirurgico.
   2. Utilizzando un bisturi sterile, fare un'incisione di 3 mm attraverso la pelle lungo l'aspetto mediano centrale del cranio (seguendo la linea di sutura sagittale). Sanguinare all'incisione dovrebbe essere minimo. In caso di incidente, applicare una pressione costante e ferma nel sito di sanguinamento con un applicatore sterile della punta di cotone per >30 secondi.
   3. Identificare e orientare il trapano perpendicolarmente al bregma (Figura 2C), assicurandosi di azzerare la scala Vernier digitale.
   4. Spostare il trapano 2 mm laterale nella sutura sagittale e 1 mm anteriore alla sutura coronale (Figura 2C). Per la riproducibilità, assicurarsi che la posizione a sinistra o a destra della linea di sutura sagittale rimanga coerente per tutti gli animali.
   5. Ruotare il trapano alla massima velocità. Assicurarsi che la pelle sia allontanata dal trapano per evitare danni ai tessuti causati dalla punta rotante e avviare attentamente il trapano sul cranio. Praticare un foro profondo circa 0,5 mm attraverso la calvaria, con conseguente finestra calvariale. Fai attenzione a non abbassare troppo il trapano o perforerà il cervello. Far cadere la salina sterile nel sito di perforazione mentre il trapano è in movimento può compensare qualsiasi calore generato dalla macchina che può causare danni termici al tessuto circostante.
   6. Una volta realizzata la finestra calvariale, sollevare attentamente il trapano e rimuoverlo dal telaio stereotattico.
   7. Pulire le punte utilizzando il 70% di etanolo e mettere da parte se utilizzate di nuovo. In caso meno, rimuovere le punte di perforazione e immergere nel 70% di etanolo.
6. Iniettare cellule tumorali nel cervello
   1. Collegare l'unità di iniettore automatico all'apparato stereotattico (Figura 1D).
   2. Tirare su >2 μL di cellule completamente rimostrate in 1x DPBS in una siringa Hamilton pulita. Assicurarsi di rimospendare le cellule immediatamente prima di riempire la siringa per ridurre la formazione di ciuffi e garantire un liquame cellulare omogeneo. È ideale per estrarre 6-8μL di volume cellulare per garantire che non ci siano sacche d'aria / bolle.
   3. Posizionare la siringa Hamilton sull'apparato iniettore e innescare l'ago per l'iniezione erogando una piccola quantità di volume su un drappo sterile monouso per assicurarsi che l'iniettore funzioni correttamente. Pulire la siringa con il 70% di etanolo con un applicatore a punta di cotone(Figura 1D, inserto). Ciò rimuove le cellule tumorali dal barile esterno dell'albero dell'ago riducendo il rischio di semina delle cellule tumorali lungo il tratto di iniezione.
   4. Allineare la punta dell'ago al centro della finestra calvariale, quasi toccando il cerebro esposto.
   5. Reimposta la scala Vernier digitale su zero.
   6. Inserire lentamente l'ago a una profondità di 3 mm nel cervello e lasciare che l'ago rimanga nel cervello per almeno 60 secondi prima di procedere. Questo lasso di tempo consente al parenchima cerebrale di conformarsi intorno all'ago, il che riduce la contro pressione e la potenziale espulsione delle cellule tumorali lungo il tratto dell'ago.
   7. Selezionare Esegui nella schermata dell'iniettore per iniziare la consegna delle celle al sito di iniezione. Ci vogliono circa 5 minuti per iniettare questo volume. Il tempo prolungato per questo passaggio è quello di ridurre i danni secondari causati dalla forza di iniezione sul parenchima cerebrale.
   8. Una volta terminato il protocollo di iniezione, lasciare riposare l'ago nel cervello per almeno 3 minuti, consentendo nuovamente al parenchima cerebrale di acclimatarsi all'iniezione.
   9. Dopo almeno 3 minuti, sollevare l'ago dal cervello ad una velocità di 0,75 mm / min. Fallo in modo estremamente lento e coerente per ridurre la contro pressione e il tumore che traccia il tratto dell'ago.
   10. Una volta che l'ago è uscito dal cervello, rimuovere con cura la siringa Hamilton dall'iniettore e pulire come descritto al passaggio 1.2.8.
   11. Applicare la cera ossea calda sulla finestra calvariale utilizzando un batuffolo di cotone sterile. La cera ossea funge da barriera fisica per mantenere il tumore all'interno del cranio.
   12. Chiudere l'incisione (ad esempio, suture dissolubili 5-0 PDS in un semplice motivo interrotto O clip di sutura, a seconda di quale sia più comodo per il chirurgo).
   13. Interrompere la somministrazione di anestesia e rimuovere il mouse dall'apparecchio sbloccando e scivolando fuori dalle barre dell'orecchio, facendo scorrere il cono del naso dal mouse e sganciando i denti dalla barra della bocca.
   14. Posizionare il mouse in una gabbia pulita che si trova su un set più caldo a 37 °C per il recupero. Monitorare i topi durante il recupero, che in genere si verifica 10-15 minuti dopo che l'anestesia è stata interrotta.
   15. Dopo il recupero del mouse, monitorare i criteri di rimozione anticipata determinati dall'IACUC dell'istituto ospitante.

2. Risonanza magnetica

1. Somministrare l'agente di contrasto a base di gadolinio (topo di peso corporeo 100 μL/20 g di 0,1 M multihance) ai topi mediante iniezione intraperitoneale standard²⁴ 10-20 minuti prima dell'imaging. Quindi anestetizzare utilizzando una camera di induzione con un anestetico inalato (ad esempio, isoflurane) miscelato con il 95% O₂ e il 5% di CO₂ (cioè gas aria ambiente in dotazione).
2. Posizionare il mouse su un supporto riscaldato per mantenere la temperatura corporea. Fissare la testa con le sporgenze dell'orecchio e una barra mordente e posizionare il supporto nel magnete da 9,4 T dotato di una bobina di superficie cerebrale del mouse. Mantenere l'anestesia durante il tempo di imaging, uno studio richiede in genere circa 20 minuti per mouse. Monitora la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca (~ 70 bpm) durante tutta la procedura utilizzando un cuscino pneumatico e un piccolo sistema di monitoraggio degli animali.
3. Ottenere un'immagine localizzatore, quindi immagini il cervello del mouse usando una sequenza RARE ponderata T2 (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, dimensione matrice = 256 x 256, 1 mm o 0,5 mm spessore fetta, NA=2-4, 15-30 fette contigue) e contrasto post gadolinium Sequenza RARA ponderata T1 (TR = 1200 ms, TE=7,5 ms, RARE Factor = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, dimensione matrice = 256 x 256, 1 mm o 0,5 mm di spessore della fetta, NA=2-4, 15-30 fette contigue).
4. Dopo l'imaging, posizionare il mouse in una gabbia su uno scaldante impostato su 37 °C per il recupero.

3. Misurazioni del tumore volumetrico

1. Ottenere il volume totale del tumore
   1. Aprire il file di dati MRI DICOM in ImageJ, un software di elaborazione delle immagini disponibile come download gratuito tramite il National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)²⁵.
      NOTA: ImageJ consente la visualizzazione di file DICOM, che è necessario per utilizzare le dimensioni dei pixel incorporate per i calcoli del volume tumorale (vedi Immagine, Proprietà in cui "unità di lunghezza" può essere impostata come desiderato (ad esempio, mm)).
   2. Utilizzare lo strumento Selezioni a mano libera per disegnare un contorno attorno al tumore. Esegui queste selezioni in una stanza buia per migliorare la visibilità. Non regolare la luminosità/contrasto per mantenere la coerenza tra le sessioni.
   3. Nella scheda Analizza selezionare Misura per ottenere l'area dell'area selezionata. Se l'unità di millimetri è stata scelta nel passaggio 3.1.1., l'area verrà data in millimetri cubi. Se lo si desidera, incorporare la selezione a mano libera selezionando CTRL+D. Modificare il colore di output andando a Modifica | Opzioni | Colore. Convertire l'immagine in un'immagine RGB (Image | Proprietà Type | Colore RGB) prima di salvare come file .tif file.
   4. Procedere con la misurazione di tutte le fette contenenti tumore per un singolo mouse e copiare i valori in un programma software di analisi dei dati appropriato (ad esempio, Microsoft Excel o GraphPad Prism).
   5. Sommare le aree da ogni fetta per ottenere il volume totale del tumore. Assicurarsi di correggere l'area in base allo spessore della fetta (area/spessore).
   6. Completare i passaggi 3.1.1.-3.1.5. fino a quando tutti i topi non hanno un volume tumorale totale. Data la natura un po 'soggettiva di delineare i tumori, è ideale se la stessa metodologia viene ripetuta più volte e mediata per ridurre l'errore tecnico.
   7. Per impostare le barre di scala, aprire il file di dati DICOM e passare ad Analyze | Strumenti | Barra di scala. Poiché le quote sono già incorporate nel file DICOM, basta scegliere la lunghezza/larghezza desiderata. Sotto copertura di un'immagine RGB (Image | Proprietà Type | Colore RGB) prima di salvare come file .tif file.

Risultati

La figura 3 mostra la quantificazione del volume tumorale per un singolo topo in due punti di tempo (giorno 7 e giorno 10) dopo l'iniezione di cellule tumorali mammarie murine. Per questo esperimento, sono state iniettate 50.000 cellule DB7, e il cervello dell'animale è stato valutato dalla risonanza prima. Per ogni scansione sono state catturate 30 fette (spessore 0,5 mm). La valutazione delle 30 fette per scansione ha rivelato che al giorno 7 dopo l'iniezione, 5 fette mostravano un carico...

Discussione

L'utilizzo dell'iniezione intracranici seguita dal monitoraggio seriale con risonanza prima è la capacità unica di visualizzare la crescita del tumore con precisione del volume tumorale nel tempo. L'applicazione dell'analisi digitale dell'imaging consente l'interpretazione delle lesioni cerebrali per volume tumorale, emorragia, necrosi e risposta al trattamento.

Come per qualsiasi procedura, ci sono passaggi chiave che devono essere seguiti per il successo. In primo luogo, un'attenta configu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters