Un modelo preclínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusión y neuroinflamación

Resumen

La hemorragia intraparenquimatosa y la neuroinflamación acompañada de contusión cerebral pueden desencadenar una lesión cerebral secundaria grave. Este protocolo detalla un modelo de impacto cortical controlado (CCI) en ratones, que permite a los investigadores estudiar la hemorragia, la contusión y las respuestas inmunitarias postraumáticas y explorar posibles terapias.

Resumen

La contusión cerebral es un problema médico grave que afecta a millones de personas en todo el mundo cada año. Existe una necesidad urgente de comprender el mecanismo fisiopatológico y desarrollar una estrategia terapéutica eficaz para este devastador trastorno neurológico. La hemorragia intraparenquimatosa y la respuesta inflamatoria postraumática inducida por el impacto físico inicial pueden agravar la activación de la microglía/macrófagos y la neuroinflamación, que posteriormente empeoran la patología cerebral. Proporcionamos aquí un protocolo de impacto cortical controlado (CCI) que puede reproducir la contusión cortical experimental en ratones mediante el uso de un sistema de impacto neumático para administrar fuerza mecánica con magnitud y velocidad controlables en la superficie dural. Este modelo preclínico permite a los investigadores inducir una contusión cerebral focal moderadamente grave en ratones e investigar una amplia gama de progresiones patológicas postraumáticas, incluida la contusión por hemorragia, la activación de la microglía/macrófagos, la toxicidad por hierro, la lesión axonal, así como los déficits neuroconductuales a corto y largo plazo. El presente protocolo puede ser útil para explorar los efectos a largo plazo y las posibles intervenciones para la contusión cerebral.

Introducción

La contusión cerebral es una forma de lesión cerebral traumática que ocupa un lugar destacado entre los problemas de salud más mortales de la sociedad moderna^. Es causada principalmente por eventos accidentales, como un accidente de tráfico, que resulta en fuerzas externas que aplican energía mecánica a la cabeza. Las lesiones cerebrales traumáticas afectan a aproximadamente 3,5 millones de personas y representan el 30% de todas las muertes relacionadas con lesiones agudas en los EE. UU. cada año². Los pacientes que sobreviven a una contusión cerebral a menudo sufren consecuencias a largo plazo, como debilidad motora focal, disfunción sensorial^{y enfermedad mental}.

La lesión primaria de la contusión cerebral es inducida por factores mecánicos que incluyen fuerzas de estiramiento y desgarro, lo que conduce a la deformación inmediata de la estructura parenquimatosa y a la muerte focal de las células del SNC³. La contusión por hemorragia es un término general para las hemorragias cerebrales debidas a un desgarro vascular en el sitio del traumatismo craneal⁴. En concreto, la hemorragia intraparenquimatosa se produce inmediatamente después de una contusión cerebral que conduce a un retraso en la formación de un hematoma. Dentro del hematoma, la hemoglobina y el hierro libre liberados por los glóbulos rojos lisados pueden desencadenar aún más toxicidad relacionada con la sangre ^5,6 que causa hernia, edema cerebral y elevación de la presión intracraneal ^5,6. Las funciones colaborativas de las neuronas (axones), la glía, los vasos sanguíneos y el tejido de soporte también se ven comprometidas por el efecto de masa del hematoma⁷. Además, la neuroinflamación persistente y difusa con neurodegeneración progresiva continúa durante meses y causa daño secundario en el cerebro⁸.

La activación de la microglía es una de las muchas características patológicas importantes de la contusión cerebral ^9,10. Después de detectar los patrones moleculares asociados al daño (DAMP) y la sangre filtrada en el tejido lesionado, la microglía activada desencadena una neuroinflamación que fomenta^{el daño cerebral} secundario. Además, el quimioatrayente liberado por la microglía promueve la infiltración de células inmunitarias periféricas en el territorio traumático, lo que resulta en la producción de especies reactivas de oxígeno y citocinas proinflamatorias. Esto crea un entorno proinflamatorio que se perpetúa a sí mismo y que desencadena una lesión cerebral progresiva ^9,12. Mientras tanto, la microglía con un fenotipo activado alternativamente puede contribuir a la restauración homeostática de los tejidos y a la reparación del cerebro mediante la eliminación de residuos del tejido lesionado¹³. Se ha demostrado que la prevención de la neuroinflamación secundaria mediante la reducción de las respuestas inmunitarias microgliales perjudiciales es particularmente útil para promover la recuperación del cerebro de la contusión cerebral 3,9,10,12.

Se han desarrollado varios modelos preclínicos para estudiar la lesión cerebral traumática, incluido el modelo de pérdida de peso, la lesión por percusión de líquido lateral y el modelo de onda expansiva^14,15. Sin embargo, cada uno de estos modelos tiene sus debilidades, incluyendo la alta tasa de mortalidad durante el procedimiento, la baja reproducibilidad de los resultados histológicos y la alta variabilidad de las lesiones infligidas entre los laboratorios^16,17. En comparación, el modelo de impacto cortical controlado (ICC) es más adecuado para el estudio de la contusión cerebral focal debido a su control preciso y alta reproducibilidad 14,15,18,19.

Además, a través de la manipulación de los parámetros de deformación biomecánica, como la velocidad y la profundidad del impacto, se puede controlar la gravedad del daño inducido para producir una amplia gama de magnitudes de lesión, lo que permite a los investigadores imitar diferentes niveles de deterioro que a menudo se observan en los pacientes¹⁷. El modelo preclínico de ICC se desarrolló por primera vez en 1896²⁰. Desde entonces, el CCI ha sido el modelo aplicable más amplio que se ha modificado para su uso en primates²¹, cerdos²², ovejas²³, ratas²⁴ y ratones²⁵. En conjunto, estas características hacen de la ICC uno de los modelos experimentales de contusión cerebral más adecuados²⁶.

Nuestro laboratorio utiliza un sistema de impacto CCI neumático disponible en el mercado y parámetros de deformación biomecánica probados para producir una contusión cerebral focal moderadamente severa que territorializa las áreas corticales sensoriales y motoras primarias sin dañar el hipocampo^27,28. Nosotros y otros demostramos que este procedimiento de CCI se puede utilizar para estudiar las características clínicas de la contusión cerebral humana, incluida la pérdida de tejido cerebral, la lesión neuronal, la hemorragia intraparenquimatosa, la neuroinflamación y la deficiencia sensoriomotora 24,25,27,28,29,30 . Aquí, detallamos un protocolo estándar para realizar CCI en ratones que permite hacer preguntas sobre la pérdida de mielina inducida por CCI, la deposición de hierro, la inflamación del SNC, la toxicidad hemorrágica y las respuestas de la microglía/macrófagos después de una contusión cerebral focal.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Hospital General Cheng Hsin y la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Taiwán. En este protocolo se utilizaron ratones machos C57BL/6 de tipo salvaje de ocho a diez semanas de edad.

1. Inducción de la anestesia

1. Anestesiar el ratón con ~4% de isoflurano mezclado con aire ambiente a ~0,2 L/min en una cámara de inducción conectada al vaporizador de isoflurano.
2. Asegúrese de que el patrón respiratorio sea suave. Verifique la profundidad de la anestesia confirmando la falta de reflejo de pellizco en los dedos del pie en el animal.

2. Preparación prequirúrgica

1. Afeita la cabeza del ratón con tijeras eléctricas en dirección caudal a rostral. No recorte los bigotes del ratón.
   NOTA: La pérdida de bigotes puede influir en la precisión de los resultados posteriores de las pruebas de comportamiento.
2. Coloque el ratón sobre el marco estereotáxico. Inserte con cuidado las barras auriculares en los canales auditivos. Asegúrese de que la cabeza del mouse esté estabilizada por ambas barras de las orejas por igual.
3. Introduzca el cono de la nariz y mantenga la anestesia al 1% - 2% de isoflurano durante la cirugía.
4. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se seque durante la cirugía. Mantenga al animal sobre una almohadilla térmica para mantener una temperatura corporal de 37 °C.
5. Desinfecte la cabeza afeitada con betadine seguido de alcohol al 70% con hisopos de algodón estériles. Repite tres veces.

3. Cirugía CCI

1. Administrar 100 μL de Bupivacaína (0,25%) por vía subcutánea con una aguja de insulina de 31 G antes de la incisión. Masajee suavemente el lugar de la inyección para una mejor absorción.
   NOTA: Este anestésico local proporciona alivio del dolor directamente en el sitio de la cirugía.
2. Haga una incisión longitudinal (~1,5 cm) a lo largo de la línea media del cuero cabelludo con un bisturí o unas tijeras. Use un hemostático para sujetar la piel hacia el lado derecho y deje que el cráneo expuesto se seque durante 1 minuto. Use un hisopo de algodón estéril para limpiar cualquier resto de sangre y tejidos en el cráneo.
3. Compruebe que la cabeza del ratón esté nivelada en el plano horizontal.
   1. Identifique los puntos de referencia anatómicos Bregma y Lambda y marque ambas ubicaciones con un marcador/lápiz quirúrgico estéril.
   2. Asegúrese de que la cabeza del animal esté nivelada en la dirección rostral-caudal. Para ello, mida las coordenadas Z de Bregma y Lambda utilizando una aguja de insulina de 31 G conectada al marco estereotáxico.
      NOTA: Ajuste la barra de la oreja verticalmente si es necesario.
   3. Realice el posicionamiento horizontal de la cabeza del animal siguiendo el mismo procedimiento de verificación de las coordenadas Z en la línea media junto con dos ubicaciones correspondientes en el lado izquierdo y derecho de la línea media y ajuste las barras de las orejas si es necesario.
      NOTA: Una ubicación nivelada y estable de la cabeza del animal es crucial para la reproducibilidad y confiabilidad del modelo CCI.
4. Use la misma aguja de insulina de 31 g para identificar el sitio de la craniectomía. Establezca el origen XY en Bregma y mueva lateralmente la aguja 3 mm hacia la derecha. Marque esta posición como el sitio de la craniectomía y dibuje un círculo de 4 mm de diámetro en el cráneo con un rotulador/lápiz quirúrgico estéril.
5. Utilice un microtaladro de alta velocidad con una trépano (4 mm de diámetro) para cortar a lo largo del círculo delineado a lápiz y crear un orificio abierto de 4 mm de diámetro. Utilice un ajuste de velocidad de 20.000 rpm. Evite aplicar presión excesiva.
   NOTA: Realice este paso rápidamente (generalmente dentro de 30 s a 1 min) para evitar cualquier daño térmico en el cerebro. La aplicación de una presión excesiva durante la perforación puede provocar una penetración accidental que podría comprimir y lesionar la superficie del cerebro.
6. Retire con cuidado el colgajo de hueso con pinzas y guárdelo temporalmente en solución salina normal helada. Enjuague suavemente el orificio con solución salina normal antes de aplicar presión sobre la superficie del cerebro con la punta del hisopo de algodón para detener el sangrado.
7. Ajuste la punta redondeada del impactador de 2,5 mm de diámetro en el dispositivo CCI a un ángulo de 22,5°. Ponga a cero la punta de impacto en la superficie dural. Ajuste los parámetros de impacto en la caja de control a una velocidad de 4 m/s y una profundidad de deformación de 2 mm. Retraiga la punta de metal.
   NOTA: La puesta a cero de la punta mientras está estática y ligeramente presionada contra la superficie dural en la posición de carrera completa mejora la precisión del punto cero y la reproducibilidad del nivel de lesión.
8. Descarga el pistón para generar impactación en el cerebro. Coloque un hisopo de algodón estéril en el área lesionada para detener el sangrado.
9. Vuelva a colocar el colgajo óseo en el cerebro del ratón y asegúrelo con cemento dental. Cierre el cuero cabelludo con adhesivo tisular (por ejemplo, 3M Vetbond).

4. Recuperación postoperatoria

1. Coloque el mouse en una jaula de recuperación limpia con ropa de cama debajo de la lámpara de calor hasta que se recupere por completo.
2. Proporcionar comida humedecida y administrar ketoprofeno por vía subcutánea (5 mg/kg) durante dos días consecutivos después de la cirugía.
3. Realice los procedimientos anteriores, excepto los pasos 3.7 y 3.8 para animales de control simulados.

5. Eutanasia de ratones

1. Eutanasia de ratones el día del estudio por sobredosis de isoflurano y luego decapitación.
   NOTA: Se pueden utilizar varias estrategias para sacrificar a los animales de experimentación antes de la recolección de la muestra.
2. Recolectar muestras de cerebro para análisis histológicos.

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Resultados

Ilustración de la colocación estereotáctica y el procedimiento de craneotomía.

El modelo CCI es conocido por su estabilidad y reproducibilidad en la producción de lesiones que van de leves a graves¹⁸. La técnica estereotáctica adecuada y el procedimiento de craneotomía son los principales determinantes en la producción de una lesión cerebral inducida por ICC estable y reproducible (Figura ...

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Discusión

El protocolo CCI produce lesiones mecánicas cerebrales altamente reproducibles para la investigación de contusiones cerebrales. Los siguientes pasos son cruciales para generar lesiones cerebrales consistentes en animales que utilizan este protocolo CCI.

En primer lugar, la cabeza del ratón debe montarse de forma estable en el marco estereotáxico y los puntos de referencia anatómicos Bregma y Lambda siempre en el mismo plano horizontal. La colocación ines...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4mm Short Trephine Drill	Salvin Dental Specialties, Inc.	TREPH-SHORT-4
anti-Iba1 antibody	Wako chemicals	#019-19741
anti-Ly76 antibody	abcam	ab91113
carboxylate cement	3M	70201136010
cortical contusion injury impactor	Custom Design & Fabrication, Inc.	S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3	CCI device (S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3)
cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042
DAB staining kit	Vector	SK-4105
goat anti-rabbit IgG secondary antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034
goat anti-rat IgG secondary antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11007
Mayer's Hematoxylin	ScyTek	HMM500
tweezers	fine science tools	11252-20 NO. 5
isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.
Bupivacaine 0.25%	Hospira
lithium carbonate	Sigma-Aldrich	62470
steriotexic frame	stoelting
scissors	fine science tools	14068-12
solvent blue 38	Sigma-Aldrich	S3382