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要約

脳挫傷を伴う実質内出血や神経炎症は、重度の二次性脳損傷を引き起こす可能性があります。このプロトコルは、マウス制御皮質衝撃(CCI)モデルの詳細を詳述しており、研究者は出血、挫傷、心的外傷後免疫応答を研究し、潜在的な治療法を探求することができます。

要約

脳挫傷は、毎年世界中で何百万人もの人々が罹患している深刻な医学的問題です。この壊滅的な神経疾患に対する病態生理学的メカニズムを理解し、効果的な治療戦略を開発することが急務です。実質内出血と心的外傷後炎症反応は、最初の物理的衝撃によって誘発され、ミクログリア/マクロファージの活性化と神経炎症を悪化させ、その後脳の病状を悪化させる可能性があります。ここでは、空気圧インパクターシステムを使用して、制御可能な大きさと速度で機械的な力を硬膜表面に供給することにより、マウスの実験的な皮質挫傷を再現できる制御皮質衝撃(CCI)プロトコルを提供します。この前臨床モデルにより、研究者はマウスに中等度から重度の限局性脳挫傷を誘発し、出血挫傷、ミクログリア/マクロファージの活性化、鉄毒性、軸索損傷、短期および長期の神経行動障害など、幅広い心的外傷後病理学的進行を調査することができます。本プロトコルは、脳挫傷の長期的な影響と潜在的な介入を調査するのに役立ちます。

概要

脳挫傷は、外傷性脳損傷の一種であり、現代社会で最も致命的な健康問題の中で上位にランクされています1。これは主に、交通事故などの偶発的な出来事によって引き起こされ、外力が頭に機械的エネルギーを加える結果となります。外傷性脳損傷は、約 350 万人が罹患し、米国では毎年、急性傷害関連の死亡全体の 30% を占めています2。脳挫傷を生き延びた患者は、多くの場合、限局性運動機能低下、感覚機能障害、精神疾患などの長期的な結果に苦しんでいます1。

脳挫傷の主な損傷は、伸張力や引き裂力などの機械的要因によって誘発され、即時の実質構造の変形と限局性CNS細胞死につながります3。出血性挫傷は、頭部外傷4の部位での血管裂傷による脳出血の総称である。具体的には、脳挫傷の直後に実質内出血が起こり、血腫形成の遅延につながります。血腫内では、溶解した赤血球から放出されるヘモグロビンと遊離鉄がさらに血液関連の毒性を引き起こすことがあります5,6 ヘルニア、脳浮腫、頭蓋内圧上昇5,6を引き起こします。ニューロン(軸索)、グリア、血管、および支持組織の協調機能も、血腫7の質量効果によって損なわれます。さらに、進行性の神経変性を伴う持続性およびびまん性神経炎症は数ヶ月間続き、脳に二次的な損傷を引き起こします8。

ミクログリアの活性化は、脳挫傷の多くの重要な病理学的特徴の1つです9,10。損傷関連分子パターン(DAMP)と損傷組織の漏れた血液を感知した後、活性化されたミクログリアは神経炎症を引き起こし、それがさらに二次的な脳損傷を引き起こします11。さらに、ミクログリアから放出される化学誘引物質は、末梢免疫細胞の外傷領域への浸潤を促進し、活性酸素種と炎症誘発性サイトカインの産生をもたらします。これにより、進行性の脳損傷を引き起こす自己永続的な炎症誘発性環境が生まれます9,12。一方、代替的に活性化された表現型を持つミクログリアは、損傷した組織から破片を取り除くことにより、組織の恒常性回復および脳の修復に寄与することができる13。有害なミクログリア免疫応答を減らすことによる二次神経炎症の予防は、脳挫傷からの脳の回復を促進するために特に有用であることが示されています3,9,10,12。

外傷性脳損傷を研究するために、ウェイトドロップモデル、側方体液パーカッション損傷、爆風モデル14,15など、いくつかの前臨床モデルが開発されています。しかし、これらのモデルはそれぞれ、処置中の死亡率が高いこと、組織学的結果の再現性が低いこと、および実験室間で負わされた傷害の変動性が高いことなどの弱点がある16,17。それに比べて、制御された皮質衝撃(CCI)モデルは、その正確な制御と高い再現性14,15,18,19のために、限局性脳挫傷の研究により適しています。

さらに、衝撃の速度や深さなどの生体力学的変形パラメータを操作することにより、誘発された損傷の重症度を制御して広範囲の損傷の大きさを生み出すことができ、研究者は患者によく見られるさまざまなレベルの障害を模倣することができます17。CCIの前臨床モデルは、1896年に最初に開発されました20。それ以来、CCIは、霊長類21、ブタ22、ヒツジ23、ラット24、およびマウス25で使用するために修正された最も広範な適用可能なモデルとなっている。これらの特徴を組み合わせることで、CCIは最も適切な実験的脳挫傷モデルの1つになります26。

私たちの研究室では、市販の空気圧CCI衝撃システムとテスト済みの生体力学的変形パラメータを使用して、海馬27,28を損傷することなく主要な感覚および運動皮質領域を領土化する中等度の焦点性脳挫傷を引き起こします。私たちと他の人々は、このCCI手順が、脳組織の喪失、神経損傷、実質内出血、神経炎症、感覚運動障害など、ヒトの脳挫傷の臨床的特徴を研究するために使用できることを実証しました24,25,27,28,29,30.ここでは、CCI誘発性ミエリン損失、鉄沈着、CNS炎症、出血性毒性、および限局性脳挫傷の余波におけるミクログリア/マクロファージの応答に関する質問をすることができるマウスCCIを実行するための標準プロトコルについて詳しく説明します。

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プロトコル

この議定書に記載されているすべての手順は、Cheng Hsin General HospitalおよびNational Taiwan University College of MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認の下で実施されました。このプロトコルでは、8〜10週齢の雄C57BL/6野生型マウスを使用しました。

1.麻酔導入

  1. イソフルラン気化器に接続された誘導チャンバー内で、~0.2 L/min で室内空気と混合した ~4% イソフルランでマウスを麻酔します。
  2. 呼吸パターンが滑らかであることを確認してください。動物のつま先つま先つまみ反射の欠如を確認して、麻酔の深さを確認します。

2. 術前準備

  1. 電気クリッパーでマウスの頭を尾側から吻側に剃ります。マウスのひげをトリミングしないでください。
    注:ひげの損失は、その後の行動テスト結果の精度に影響を与える可能性があります。
  2. マウスを定位固定装置フレームに置きます。イヤーバーを外耳道に慎重に挿入します。マウスの頭が両方のイヤーバーで均等に安定していることを確認します。
  3. ノーズコーンを取り込み、手術中は麻酔を1%〜2%イソフルランに維持します。
  4. 手術中の乾燥を防ぐために、両眼に眼科用軟膏を塗布します。体温を37°Cに保つために、動物を温熱パッドの上に置いてください。
  5. 剃った頭をベタジンで消毒し、続いて滅菌綿棒を使用して70%アルコールで消毒します。3回繰り返します。

3.CCI手術

  1. 切開前に、31Gのインスリン針を使用して100μLのブピバカイン(0.25%)を皮下投与します。注入部位を優しくマッサージして、吸収を良くします。
    注:この局所麻酔薬は、手術部位で直接痛みを和らげます。
  2. メスやハサミで頭皮の正中線に沿って縦方向(~1.5cm)を切開します。止血器を使用して皮膚を右側に保持し、露出した頭蓋骨を1分間乾かします。滅菌綿棒を使用して、頭蓋骨に残っている血液や組織をきれいに取り除きます。
  3. マウスヘッドが水平面で水平になっていることを確認します。
    1. 解剖学的ランドマークBregmaとLambdaを特定し、滅菌外科用マーカー/鉛筆で両方の場所に印を付けます。
    2. 動物の頭が吻側-尾側方向と同じ高さにあることを確認します。これを行うには、脳定位固定装置フレームに取り付けられた31Gのインスリン針を使用して、BregmaとLambdaの両方のZ座標を測定します。
      注意: 必要に応じて、イヤーバーを垂直に調整します。
    3. 動物の頭部の水平位置決めには、正中線のZ座標と、正中線の左側と右側の2つの対応する位置を確認するのと同じ手順に従って実行し、必要に応じてイヤーバーを調整します。
      注:動物の頭部を水平に安定して配置することは、CCIモデルの再現性と信頼性にとって非常に重要です。
  4. 同じ31Gのインスリン針を使用して、頭蓋切除部位を特定します。XY原点をBregmaに設定し、針を右に3mm横に動かします。この位置を頭蓋切除術の部位としてマークし、滅菌済みの外科用マーカー/鉛筆で頭蓋骨に直径4mmの円を描きます。
  5. トレフィン(直径4mm)の高速マイクロドリルを使用して、鉛筆で縁取られた円に沿って切断し、直径4mmの穴を開けます。20,000 rpm の速度設定を使用します。過度の圧力を加えることは避けてください。
    注意: 脳への熱損傷を防ぐために、この手順をすばやく(通常は30秒から1分以内に)実行してください。穴あけ中に過度の圧力を加えると、偶発的な貫通につながり、脳の表面が圧迫されて損傷する可能性があります。
  6. ピンセットで骨フラップを慎重に取り外し、氷冷した通常の生理食塩水に一時的に保管します。出血を止めるために綿棒の先端で脳の表面に圧力をかける前に、通常の生理食塩水で穴をやさしくすすぎます。
  7. CCIデバイスの直径2.5mmの丸みを帯びたインパクターチップを22.5°の角度に設定します。硬膜表面への衝撃先端をゼロにします。コントロールボックスの衝撃パラメータを速度4m/s、変形深さ2mmに設定します。金属チップを引っ込めます。
    注:フルストローク位置で先端を硬膜表面に静的かつわずかに押し付けた状態で先端をゼロにすると、ゼロポイントの精度と損傷レベルの再現性が向上します。
  8. ピストンを放電して、脳に宿便を発生させます。滅菌綿棒を負傷した部分に置き、出血を止めます。
  9. 骨フラップをマウスの脳に戻し、歯科用セメントで固定します。ティッシュ接着剤(例:.、3M Vetbond)で頭皮を閉じます。.

4. 術後の回復

  1. マウスを完全に回復するまで、ヒートランプの下に寝具を置いた清潔なリカバリーケージに入れます。
  2. 湿らせたチャウフードを提供し、手術後2日間連続してケトプロフェン(5 mg / kg)を皮下投与します。.
  3. 上記の手順を実行しますが、手順3.7と3.8は偽の対照動物の場合です。

5.マウスの安楽死

  1. 研究の日にイソフルランの過剰摂取とその後の斬首によるマウスの安楽死。
    注:サンプル収集の前に実験動物を安楽死させるために、いくつかの戦略を使用することができます。
  2. 組織学的分析のために脳サンプルを収集します。

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結果

定位留置術と開頭術の図解。

CCIモデルは、軽度から重度の18までの範囲の傷害を引き起こす際の安定性と再現性で知られています。適切な定位法と開頭術は、安定した再現性のある CCI 誘発性脳損傷を引き起こす主要な決定要因です (図 1A、B)。理想的な開頭術は、示されているよ?...

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ディスカッション

CCIプロトコルは、脳挫傷研究のために脳に再現性の高い機械的損傷を引き起こします。次の手順は、このCCIプロトコルを使用して動物に一貫した脳損傷を引き起こすために重要です。

まず、マウスの頭部は、脳定位固定装置フレームと解剖学的ランドマークであるBregmaとLambdaに常に同じ水平面に安定して取り付ける必要があります。頭の位置が?...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

原稿の編集と洞察に満ちた意見をいただいたDanye Jiangに感謝します。原稿の準備を手伝ってくれたJhih Syuan Linに感謝します。この研究は、台湾科学技術部(MOST 107-2320-B-002-063-MY2)からC.F.C.への支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4mm Short Trephine DrillSalvin Dental Specialties, Inc.TREPH-SHORT-4
anti-Iba1 antibodyWako chemicals#019-19741
anti-Ly76 antibodyabcamab91113
carboxylate cement3M70201136010
cortical contusion injury impactorCustom Design & Fabrication, Inc.S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3CCI device (S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3)
cresyl violet acetateSigma-AldrichC5042
DAB staining kitVectorSK-4105
goat anti-rabbit IgG secondary antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
goat anti-rat IgG secondary antibody, Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Mayer's HematoxylinScyTekHMM500
tweezersfine science tools11252-20 NO. 5
isofluranePanion & BF Biotech Inc.
Bupivacaine 0.25%Hospira
lithium carbonateSigma-Aldrich62470
steriotexic framestoelting
scissorsfine science tools14068-12
solvent blue 38Sigma-AldrichS3382

参考文献

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