Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

Resumen

Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.

Resumen

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa especializada de células ubicadas estratégicamente entre la retina y los coriocapillaris que mantienen la salud general y la integridad estructural de los fotorreceptores. El RPE está polarizado, exhibiendo receptores o canales ubicados de manera apóptica y basal, y realiza el transporte vectorial de agua, iones, metabolitos y secreta varias citoquinas.

Las mediciones in vivo no invasivas de la función RPE se pueden realizar utilizando ERG de acoplamiento directo (DC-ERG). La metodología detrás del DC-ERG fue pionera por Marmorstein, Peachey y sus colegas utilizando un sistema de grabación de estimulación personalizado y más tarde demostrado utilizando un sistema disponible comercialmente. La técnica DC-ERG utiliza capilares de vidrio llenos de solución de sal tamponada de Hank (HBSS) para medir las respuestas eléctricas más lentas del RPE provocadas por cambios de concentración evocados por la luz en el espacio subretinal debido a la actividad del fotorreceptor. El prolongado estímulo de luz y la duración de la grabación DC-ERG lo hacen vulnerable a la deriva y al ruido, lo que resulta en un bajo rendimiento de grabaciones utilizables. Aquí, presentamos un método rápido y confiable para mejorar la estabilidad de las grabaciones al tiempo que reduce el ruido mediante el uso de la presión de vacío para reducir / eliminar las burbujas que resultan de la desgasificación del HBSS y el soporte del electrodo. Además, los artefactos de la línea de alimentación se atenúan mediante un regulador de voltaje/acondicionador de potencia. Incluimos los protocolos de estimulación de la luz necesarios para un sistema ERG disponible comercialmente, así como scripts para el análisis de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. Debido a la mayor facilidad de grabaciones y el flujo de trabajo de análisis rápido, este protocolo simplificado es particularmente útil para medir los cambios relacionados con la edad en la función de RPE, la progresión de la enfermedad y en la evaluación de la intervención farmacológica.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células especializadas que recuben el segmento posterior del ojo y ejercen funciones críticas para mantener la homeostasis retinal^1. El RPE soporta fotorreceptores mediante la regeneración de su pigmento visual fotones-captura en un proceso llamado ciclo visual^2,participando en la fagocitosis diurna del segmento exterior del cobertizo puntas^3,y en el transporte de nutrientes y productos metabólicos entre fotorreceptores y los coriocapillaris^4,5. Las anomalías en la función de la EPH subyacen a numerosas enfermedades de la retina humana, como la degeneración macular relacionada con la edad^6,la amaurosis congénita de Leber^7,8 y la mejor distrofia macular vitelliforma⁹. Como los tejidos oculares de los donantes a menudo son difíciles de obtener únicamente con fines de investigación, los modelos animales con modificaciones genéticas pueden proporcionar una forma alternativa de estudiar el desarrollo de enfermedades de la retina^10,11. Además, la aparición y aplicación de la tecnología CRISPR cas9 permite ahora introducciones genómicas (knock-in) o eliminaciones (knock-out) en un proceso simple de un solo paso superando las limitaciones de las tecnologías de apuntamiento genético anterior¹². La auge en la disponibilidad de los nuevos modelos de^{ratón 13} requiere un protocolo de grabación más eficiente para evaluar de forma no invasiva la función RPE.

La medición de las respuestas eléctricas evocadas por la luz del RPE se puede lograr mediante una técnica de electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG). Cuando se utiliza en combinación con grabaciones ERG convencionales que miden las respuestas celulares del fotorreceptor (onda a) y bipolar (onda b)¹⁴, el DC-ERG puede definir cómo cambian las propiedades de respuesta del RPE con la degeneración de la retina^15,16,17 o si la disfunción del RPE precede a la pérdida del fotorreceptor. Este protocolo describe un método adaptado del trabajo de Marmorstein, Peachey y sus colegas que desarrollaron por primera vez la técnica DC-ERG^16,18,19,20 y mejora la reproducibilidad y facilidad de uso.

La grabación DC-ERG es difícil de realizar debido al largo tiempo de adquisición (9 min) durante el cual cualquier interrupción o introducción de ruido puede complicar la interpretación de los datos. La ventaja de este nuevo método es que las líneas de base alcanzan un estado estable en un período de tiempo más corto reduciendo la probabilidad de que el animal despierte prematuramente de la anestesia y sea menos propenso a la formación de burbujas en los electrodos capilares.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal descritas en el protocolo de estudio animal aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto Nacional del Ojo.

1. Importación de protocolos de estimulación de la luz para DC-ERG

NOTA: Siga las instrucciones a continuación para importar los protocolos de estimulación de la luz para el DC-ERG en el software del sistema ERG (Tabla de materiales). El protocolo consiste en un intervalo de pre-estímulo de 0,5 min, seguido de un paso de luz (10 cd/m²⁾durante 7 min, y terminando con un intervalo post-estímulo de 1,5 min. Se seleccionó la intensidad lumínica de 10 cd/m² (1 log₁₀ cd/m²⁾ya que evoca aproximadamente la mitad de la respuesta máxima para todos los componentes del DC-ERG en ratones WT^18,21. La onda c y la oscilación rápida son de particular interés, ya que los orígenes de estas respuestas eléctricas están bien caracterizados y pueden aislarse y estudiarse más adelante en modelos de RPE in vitro (por ejemplo, iPSC-RPE). La aplicación de otras intensidades de luz puede extraer información adicional, por ejemplo, la respuesta off sufre una reversión de la polaridad en estímulos de luz más brillantes y puede mostrar diferencias en la intensidad a la que se produce esta reversión. El usuario es libre de cambiar la configuración de intensidad de la luz a su discreción.

1. Abra el software del sistema ERG.
2. Haga clic en Centro de base de datos.
3. Haga clic en Nuevo (proporcione un nuevo nombre de archivo de base de datos). Haga clic en Guardar. El cuadro emergente mostrará: "Base de datos creada, ¿desea conectarse al nuevo archivo de base de datos." Haga clic en Sí. El nombre de la base de datos actual ahora debe reflejar el nuevo nombre de archivo.
4. Haga clic en Transferir en la ventana Centro de control de base de datos.
5. Seleccione Archivo suplementario 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Haga clic en Abrir.
6. Haga clic en Cerrar (Centro de control de bases de datos) al finalizar la barra de progreso.
7. Haga clic en el botón verde Inicio.
8. Haga clic en Nuevo en la ventana Seleccionar paciente. Cree un nuevo nombre de familia de pacientes que describa el modelo de ratón, introduzca la fecha de nacimiento (DOB, mm/dd/aaaa), cambie el botón de género (M/F) a la descripción adecuada. Haga clic en Cerrar para guardar los detalles experimentales.
9. Haga clic en Protocolos. Los protocolos ERG y DC-ERG adaptados a la oscuridad ahora deberían ser visibles.
10. Por último, coloque el archivo Long Flash.col en la siguiente carpeta C:-Archivos de usuario de ERG-Long Flash.col.

2. Preparación del electrodo capilar

1. Corte los capilares de vidrio de 1,5 mm por la mitad utilizando una baldosa de cerámica (Tabla de materiales) para puntuar el vidrio y romperlos limpiamente usando una mesa para proporcionar contrafuerza física y estabilizar el vidrio.
   NOTA: Desde con rodeos según sea necesario.
2. El uso de un quemador Bunsen (Tabla de Materiales) permite que el calor haga una pequeña curva en el capilar mientras lo sostiene sobre la llama con fórceps.

3. Llenado de electrodos capilares

1. Conecte el desecador de vacío a la línea de vacío del laboratorio a través de un filtro en línea(Tabla de materiales).
2. Vierta 30 ml de la solución de sal equilibrada (HBSS) (tabla de materiales) de Hanks en un tubo cónico abierto de 50 ml y colóquelo (con la tapa quitada) en la cámara de vacío.
3. Encienda el vacío y desgaste el HBSS mientras enciende el ordenador y el equipo de grabación.
4. Después de 5o 201210 min apague el vacío y utilice el HBSS desgastado para llenar una jeringa de 12 ml a través de una aguja de 25 G conectada. Utilícelo para llenar las bases de los soportes de electrodos tomando precauciones adicionales para no introducir burbujas.
   1. Para ello, retire la tapa roscada del tornillo y deslice cuidadosamente la aguja de la jeringa a través de la junta de goma de silicona para llegar a la pared posterior (pellet de cloruro de plata/plata) del soporte.
      NOTA: Los pellets de cloruro de plata/plata son ventajosos sobre los soportes que utilizan alambre de plata, ya que proporcionan más superficie, lo que resulta en una línea de base estable de bajo ruido. Sin embargo, los pellets de cloruro de plata/plata requieren una interfaz líquida libre de burbujas de aire para lograr una buena conexión. Por lo tanto, tenga mucho cuidado de no introducir burbujas de aire durante este proceso.
   2. Inyecte gradualmente HBSS para llenar todo el microelectrodo mientras retrae lentamente la aguja de la jeringa. Vuelva a colocar la tapa roscada pero no apriete. Vuelva a insertar la aguja de la jeringa para llenar el espacio vacío dentro de la tapa con HBSS. A continuación, llene el capilar de vidrio mientras lo mantiene horizontal para evitar que la solución escape del otro extremo.
   3. Sujete el capilar de vidrio del extremo doblado e inserte lentamente el extremo opuesto a través de la tapa aflojada y luego apriete la tapa del tornillo en su lugar.
      NOTA: Los electrodos de vidrio llenos de HBSS mantienen la lubricación del ojo del ratón y evitan la deshidratación corneal que se produciría con el uso de electrodos de bucle de oro estándar.
5. Coloque los soportes de electrodos con los electrodos capilares inclinados hacia arriba para permitir que las burbujas fluyan. Ejecuta el vacío durante 5.u201210 min para desgas. El escape de gas de las superficies de vidrio y plástico expulsará a HBSS de los soportes de electrodos.
6. Deténgase y luego suelte lentamente el vacío. Rellene los soportes de electrodos y capilares de vidrio como se describió anteriormente.
   NOTA: Las burbujas tienden a acumularse en o cerca de la junta de goma de silicona y también pueden ocultarse en las ranuras de la tapa roscada, por lo tanto se debe prestar especial atención para mantener estas áreas libres de burbujas.
7. Instale y asegure el soporte de microelectrodo en el soporte de junta de bolas magnéticas/T-clip hecho a medida(Figura 1A, inset). Para hacer el soporte personalizado para el soporte de microelectrodo, modifique un clip T (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Tabla de Materiales) eliminando los clips poliacetales negros en un lado. Tener la base del cilindro de las juntas magnéticas de bolas mecanizadas por la mitad para ajustar la altura (Tabla de materiales). Fije los clips en T modificados a los tornillos de montaje de bolas magnéticas con tuercas de tamaño M3.
8. Coloque el soporte de microelectrodo en el clip T modificado y sostén lo sostenga firmemente en su lugar deslizando en aproximadamente un mango de madera cónico de 1 pulgada hecho de romper un palo de limpieza con punta de algodón (Tabla de Materiales) en un ángulo. Utilice la base del cilindro del imán de tierras raras para colocar de forma segura el soporte del soporte de electrodo personalizado en la placa metálica del escenario, lo que permite una rotación de 360o en un eje de 180o.

4. Electrodos de prueba

1. Vierta EL HBSS en un recipiente pequeño (por ejemplo, la tapa del tubo cónico de 50 ml).
2. Baje suavemente los microelectrodos capilares llenos de HBSS completamente ensamblados en la tapa que contiene HBSS para preequilibrar los electrodos y colocar el electrodo de tierra de la aguja (cola/pierna trasera) y el electrodo de referencia de pellets sinterizado Ag/AgCl (boca) en el mismo HBSS para completar el circuito (Figura 1A).
   NOTA: Realice todos los pasos posteriores bajo luz roja tenue. Utilice una linterna de luz roja para colocar el ratón y los electrodos capilares. Recuerde apagar completamente todas las fuentes de luz antes de comenzar la grabación.
3. Seleccione o cree un identificador adecuado (nombre de familia) para describir el mouse que se va a probar y seleccione el protocolo DC-ERG que se va a realizar completando el registro de acuerdo con el siguiente orden.
   1. Haga clic en Protocolos. Seleccione DC-ERG. Haga clic en Ejecutar. Aparecerá un cuadro de diálogo: "El paciente actual es XXX [DOB: XX/XX/XX) ¿Es esto correcto para la prueba que se está realizando?" Haga clic en Sí. A continuación, proceda a "Paso 1/6."
4. Cierra las puertas de la jaula de Faraday.
5. Visualice el modo de impedancia haciendo clic en Impedancia y compruebe que los valores de la referencia de la boca, el suelo de cola y los electrodos de grabación son aceptables (consulte la figura 1B).
6. Pruebe la estabilidad de línea base (ruido y deriva) haciendo clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 4/6 "Flash Largo Sin Luz."
   NOTA: La cantidad de deriva observada cuando los electrodos se colocan en el baño HBSS es generalmente inferior a 500 v por 80 s una vez que se han estabilizado y es equivalente a la deriva observada cuando los electrodos están conectados al ratón. Por lo tanto, la lectura eléctrica de los electrodos en el baño HBSS son un indicador importante del estado de los electrodos. El ruido, medido como pico a pico, es generalmente de 10 u201215% mayor en el ratón que en el baño HBSS. Esto es probablemente debido a la adición de artefactos de movimiento de la respiración.
7. Comience a ver los seguimientos haciendo clic en Vista previa. Las trazas deben ser de bajo ruido con una amplitud de pico a pico <200 V. Se acepta una ligera deriva (<500 v/80 s) que se desvanece gradualmente hasta la línea de base(Figura 1C).

5. Posicionamiento de ratón y electrodo

1. Mantenga a los ratones durante la noche en una caja bien ventilada y apretada para una adaptación oscura.
2. Anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilazina (8 mg/kg).
3. Aplicar una gota de 0.5% proparacaína HCl tópicamente para anestesiar la córnea, así como una gota de 2.5% fenilefrina HCl y 0.5% tropicamida dilatar las pupilas.
4. Recorte los bigotes de ratón con tijeras para evitar que los espasmos involuntarios molesten los electrodos capilares de vidrio durante la grabación.
   NOTA: El protocolo de estímulo DC-ERG dentro del sistema ERG tiene varias rutinas de estímulo integradas que se pueden seleccionar haciendo clic en el paso (flecha hacia adelante) o paso (flecha hacia atrás). Solo se requieren los pasos 1, 4 y 5 del software para preparar y realizar la grabación DC-ERG.
5. En el software del sistema ERG verifique que el paciente correcto está seleccionado. Haga clic en el botón verde Protocolos. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG. A continuación, haga clic en Ejecutar. Verifique que esta sea la prueba correcta que se está realizando haciendo clic en Sí.
6. Utilice el estímulo de luz roja designado para el paso 1/6 para encender la luz roja dentro de la cúpula para ayudar a colocar el ratón y los electrodos mientras observa los cambios en la impedancia.
7. Coloque el ratón sobre una mesa de grabación calentada y coloque cuidadosamente la piel de la pierna trasera con fórceps. Sujete el electrodo de la aguja firmemente en una mano e insértelo por vía subcutánea en la pierna trasera para fijarlo en su lugar.
8. Coloque el electrodo Ag/AgCl de referencia(Tabla de Materiales)dentro de la boca para que el pellet sinterado descanse a lo largo de la mejilla posterior y se mantiene en su lugar detrás de los dientes.
   NOTA: Los electrodos de alambre de oro no deben utilizarse como electrodo de referencia de boca, ya que tienen diferentes características de impedancia y aumentan el ruido de pico a pico.
9. Antes de colocar los electrodos capilares en el ojo del ratón, sostenga el soporte del electrodo con el capilar de vidrio vertical, deslice el soporte del electrodo con el dedo índice para eliminar las burbujas que puedan haber sido introducidas. Llene la punta con HBSS con una aguja de 25 G unida a una jeringa e inspeccione para asegurarse de que no haya burbuja de aire atrapada en la punta. Coloque el soporte del soporte del electrodo de modo que la punta abierta de los capilares llenos de HBSS esté en contacto suave con la córnea.
10. Tenga especial precaución para evitar la introducción de burbujas de aire sosteniendo el dispensador de gel para los ojos lubricante invertido y deseche las gotas iniciales. Coloque una gota de gel lubricante para los ojos en cada ojo para mantener la conductividad y evitar la desceración durante la grabación.

6. Grabación DC-ERG

1. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 4/6 "Largo Flash No Li."
2. Haga clic en Impedancia. Utilice la pantalla Comprobación de impedancia para examinar las resistencias de los ojos izquierdo y derecho. Se espera que los valores de impedancia para los electrodos de grabación en cada ojo sean similares (39 ko). Se espera que los valores de impedancia tanto para los electrodos de tierra como para los electrodos de referencia sean inferiores a 10 ko).
3. Haga clic en Vista previa para ver los rastros del ojo izquierdo y derecho. Espere a que se alcance una línea de base estable (<10 min). Haga clic en Detener para salir de la vista previa del seguimiento.
   NOTA: Los cambios bruscos en la dirección de deriva o el ruido aberrante en la grabación no mejorarán con el tiempo y requerirán identificar el electrodo capilar que requiere atención. La causa más probable es una burbuja introducida en la punta del electrodo. Rellene la punta con HBSS. Haga clic en Vista previa de nuevo para comprobar la línea base.
4. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
5. Haga clic en Ejecutar para iniciar la grabación(Figura 1D).

7. Exportación de datos

1. Seleccione el "Paciente" (Nombre de la familia) que describe la grabación del ratón que se va a exportar.
2. Haga clic en Pruebas antiguas.
3. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG. Haga clic en el botón verde Cargar para cargar los datos adquiridos anteriormente.
4. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para avanzar al paso 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
5. Haga clic en Exportar.
6. Proporcione el nombre de archivo (por ejemplo, nombre de archivo.csv). Un nombre de archivo válido debe comenzar con una letra, seguido de letras, números o guiones bajos. No utilice caracteres especiales ni guiones. El programa de análisis de datos (DCERG_Analysis.exe) requiere que las entradas de tabla cumplan los requisitos para los nombres de variables.
7. Coloque una marca de verificación junto a Tabla de datos. Junto al separador, seleccione Tabulador. Coloque las marcas de verificación situadas junto a Opciones (Títulos, Vertical), Incluir todo (Pasos, Chans , Resultados), Columnasde datos (Contenido, Resultados, Barridos) y Formato (Archivo).
8. A continuación, haga clic en Exportar (Figura 1E). De este modo, se guarda el archivo *.csv en la carpeta C:-Multifocal.

8. Análisis de datos

1. Descargue e instale el instalador en tiempo de ejecución adecuado (Tabla de materiales)
2. Descargue e instale el instalador de DCERG_Analysis.exe.
   NOTA: Esto instala el script que realizará el análisis de los componentes DC-ERG y crea un acceso directo para ejecutar el programa en la carpeta Menú Inicio.
3. Haga clic en el acceso directo creado en la carpeta Menú Inicio > Programas.
4. Seleccione el archivo o archivos de datos exportados (*.csv) para el análisis. Utilice Ctrl + clic izquierdo en el ratón para seleccionar más de un archivo.
   NOTA: El archivo ejecutable genera dos tipos de trazados: 1) los datos sin procesar se trazan con una línea de ajuste mejor que indica la deriva medida; 2) la respuesta corregida de deriva se traza después de ser suavizada con una media móvil (con un lapso de 5 s). A partir de esta gráfica se identifican las amplitudes y el tiempo de pico de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. A continuación, los datos se exportan en formato de tabla para sobresalir, donde cada hoja corresponde a una grabación de ratón diferente. Estas hojas van seguidas de dos hojas de resumen: (i) amplitudes de DC-ERG compiladas (mV); (ii) tiempo de pico de DC-ERG compilados (inicio de luz, t a 0 min).

Resultados

La Figura 2 es un conjunto de datos de muestra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) y ratones de tipo salvaje (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ son ratones con un nocaut condicional de microRNA 204 en el epitelio pigmentario de la retina. Estos ratones se generan cruzando ratones miR-204 con floxed (producidos por NEIGEF)²² con ratones VMD2-CRE²³. MiR-204 se expresa en gran medida en el RPE donde regula la expresión de proteínas críticas para la ...

Discusión

Pasos críticos

Una buena grabación DC-ERG requiere electrodos estables que están libres de burbujas que crean artefactos y deriva no deseada, ya que son extremadamente sensibles a la desgasificación y los cambios de temperatura. Es esencial que se alcance una línea de base estable cuando los electrodos se colocan en la solución de baño HBSS antes de continuar con la grabación del ratón. Las pequeñas burbujas tienden a acumularse en la base del electrodo capilar o alr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode	WPI Inc	EP1	Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile	Sutter Instrument	CTS	Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick	Puritan Medical Products	867-WC No Glue	To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System	Diagnosys LLC	E3 System	Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner	Argos Technologies	BW20002460	Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)	Sutter Instruments	BF150-75	For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	14175-095	Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter	Whatman	6722-5001	To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders	WPI Inc	5372	Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint	WPI Inc	500871	For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab	Mathworks		MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox	Mathworks		Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler	Mathworks		Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5	Mathworks	R2018b (9.5)	Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)	WPI Inc	MEH345-15	For holding the capillaries
Needle (25 ga)	Covidien	8881250313	For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode	Rhythmlink	13mm - one elctrode	Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner	Furman	P-1800	Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)	Monoject	1181200777	For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip	Cole-Parmer	06852-20	For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator	Bel-Art	420120000	Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel	Alcon	0078-0429-47	Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%	Akorn	17478-201-15	Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%	Akorn	17478-263-12	Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%	Akorn	17478-101-12	Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine	AnaSed	sc-362949Rx	Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)	VetOne	501072	Anesthetic for intramuscular injections