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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia terapéutica emergente contra el cáncer que utiliza un conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (IR700Dye) y luz NIR para destruir las células cancerosas. Aquí, presentamos un método para evaluar el efecto antitumoral de NIR-PIT en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural y mesotelioma pleural maligno utilizando imágenes de bioluminiscencia.

Resumen

La eficacia de la fotoinmunoterapia se puede evaluar con mayor precisión con un modelo de ratón ortotópico que con uno subcutáneo. Se puede utilizar un modelo de diseminación pleural para la evaluación de métodos de tratamiento para enfermedades intratorácicas como el cáncer de pulmón o el mesotelioma pleural maligno.

La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia de tratamiento del cáncer desarrollada recientemente que combina la especificidad de los anticuerpos dirigidos al tumor con la toxicidad causada por un fotoabsorbente (IR700Dye) después de la exposición a la luz NIR. La eficacia de NIR-PIT se ha reportado usando varios anticuerpos; sin embargo, sólo unos pocos informes han demostrado el efecto terapéutico de esta estrategia en un modelo ortotópico. En el presente estudio, demostramos un ejemplo de evaluación de la eficacia del modelo de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT.

Introducción

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad a pesar de décadas de investigación. Una razón es que la radioterapia y la quimioterapia son técnicas altamente invasivas, lo que puede limitar sus beneficios terapéuticos. Las terapias dirigidas celulares o moleculares, que son técnicas menos invasivas, están recibiendo una mayor atención. La fotoinmunoterapia es un método de tratamiento que mejora sinérgicamente el efecto terapéutico mediante la combinación de inmunoterapia y fototerapia. La inmunoterapia mejora la inmunidad tumoral al aumentar la inmunogenicidad del microambiente tumoral y reducir la supresión inmunorreguladora, lo que resulta en la destrucción de tumores en el cuerpo. La fototerapia destruye los tumores primarios con una combinación de fotosensibilizadores y rayos de luz, y los antígenos específicos del tumor liberados de las células tumorales mejoran la inmunidad tumoral. Los tumores se pueden tratar selectivamente con fotosensibilizadores, ya que son específicos y selectivos para las células diana. La modalidad de fototerapia incluye terapia fotodinámica (PDT), terapia fototérmica (PTT) y terapias basadas en fotoquímica1.

La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un método recientemente desarrollado de fototerapia antitumoral que combina la terapia basada en fotoquímicos y la inmunoterapia1,2. NIR-PIT es una terapia dirigida molecularmente que se dirige a moléculas específicas de la superficie celular a través de la conjugación de un colorante de ftalocianina de silicio del infrarrojo cercano, IRdye 700DX (IR700), a un anticuerpo monoclonal (mAb). La membrana celular de la célula diana se destruye tras la irradiación con luz NIR (690 nm)3.

El concepto de usar terapia de luz dirigida mediante la combinación de fotosensibilizadores y anticuerpos convencionales o PDT dirigida tiene más de tres décadas de antigüedad4,5. Estudios previos han intentado dirigirse a los agentes PDT convencionales conjudicándolos con anticuerpos. Sin embargo, hubo un éxito limitado porque estos conjugados quedaron atrapados en el hígado, debido a la hidrofobicidad de los fotosensibilizadores6,7. Además, el mecanismo de NIR-PIT es completamente diferente del de la PDT convencional. Los fotosensibilizadores convencionales generan estrés oxidativo que resulta de una conversión de energía que absorbe la energía de la luz, se disloca a un estado excitado, hace la transición al estado fundamental y causa apoptosis. Sin embargo, NIR-PIT causa necrosis rápida al destruir directamente la membrana celular al agregar fotosensibilizadores en la membrana a través de una reacción fotoquímica8. NIR-PIT es superior a la PDT dirigida convencional en muchos sentidos. Los fotosensibilidades convencionales tienen bajos coeficientes de extinción, lo que requiere la unión de un gran número de fotosensibilizadores a una sola molécula de anticuerpo, lo que podría reducir la afinidad de unión. La mayoría de los fotosensibilidades convencionales son hidrófobos, lo que dificulta la unión de los fotosensibilizadores a los anticuerpos sin comprometer su inmunorreactividad o la acumulación de dianas in vivo. Los fotosensibilizadores convencionales suelen absorber la luz en el rango visible, reduciendo la penetración del tejido.

Se han reportado varios estudios sobre NIR-PIT dirigidos a tumores intratorácicos como el cáncer de pulmón y las células del mesotelioma pleural maligno (MPM)9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Sin embargo, solo unos pocos informes han descrito la eficacia de NIR-PIT en MPM diseminada pleural o cáncer de pulmón modelos9,10,11,12. Se cree que los modelos de xenoinjerto tumoral subcutáneo son modelos tumorales estándar y actualmente se utilizan ampliamente para evaluar los efectos antitumorales de las nuevas terapias18. Sin embargo, el microambiente tumoral subcutáneo no es permisivo para el desarrollo de una estructura tisular adecuada o una condición que recapitula adecuadamente un verdadero fenotipo maligno19,20,21,22. Idealmente, se deben establecer modelos de enfermedades ortotópicas para una evaluación más precisa de los efectos antitumorales.

Aquí, demostramos un método de evaluación de la eficacia en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT. Un modelo de ratón de diseminación pleural se genera inyectando células tumorales en la cavidad torácica y se confirma utilizando luminiscencia de luciferasa. El ratón fue tratado con una inyección intravenosa de mAb conjugada con IR700 e irradiación NIR al tórax. El efecto terapéutico se evaluó mediante luminiscencia de luciferasa.

Protocolo

Todos los experimentos in vivo se realizaron de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de los recursos de animales de laboratorio del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nagoya (aprobación # 2017-29438, # 2018-30096, # 2019-31234, # 2020-20104). Ratones desnudos homocigotos homocigotos de seis semanas de edad fueron comprados y mantenidos en el Centro de Animales de la Universidad de Nagoya. Al realizar el procedimiento en ratones, fueron anestesiados con isoflurano (introducción: 4-5%, mantenimiento 2-3%); la pata fue presionada con pinzas para confirmar la profundidad de la anestesia.

1. Conjugación de IR700 con mAb

  1. Incubar mAb (1 mg, 6,8 nmol) con éster IR700 NHS (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L en DMSO) en 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) a 15-25 °C durante 1 h.
  2. Purifique la mezcla usando una columna (por ejemplo, Sephadex). Prepare y lave la columna con PBS. Luego, aplique la mezcla sobre la columna y recoja la gota, que contiene el anticuerpo conjugado IR700 purificado. Este anticuerpo conjugado IR700 se conoce como el conjugado fotosensibilizador de anticuerpos (APC).
  3. Mida la proteína y la concentración de IR700 en el APC.
    1. Prepare curvas de calibración para proteínas e IR700 utilizando un espectrofotómetro.
    2. Mezcle las concentraciones estándar de albúmina con un kit de ensayo de proteínas siguiendo el protocolo del kit (consulte la Tabla de materiales,tinción de proteínas Coomassie Brilliant Blue (CBB)). Mida la absorbancia de la albúmina a una longitud de onda de 595 nm y trace la curva de calibración (una fórmula de aproximación lineal) para la proteína utilizando la siguiente ecuación: y = ax + b (x: concentración, y: absorbancia).
    3. Obtenga curvas de calibración para IR700 con absorción a 690 nm utilizando el mismo procedimiento. La concentración estándar de IR700 se recomienda a 0.1-5 μM (0.1954-9.77 μg/mL).
    4. Mida la concentración de proteína y la concentración de IR700 en el APC utilizando una curva de calibración [x = (y-b)/a (x: concentración, y: absorbancia)].
    5. Determinar el número de colorantes IR700 unidos por mAb con los resultados de la concentración molar.
      NOTA: Es importante determinar el número óptimo de conjugación de moléculas IR700 por molécula mAb. En general, aproximadamente tres moléculas IR700 unidas en una sola molécula mAb serían efectivas tanto in vitro como in vivo. Muchos IR700 unidos por anticuerpo (por ejemplo, seis) hacen que sea más fácil quedar atrapado en el hígado durante los experimentos in vivo. La proporción de anticuerpos unidos a IR700 estaba en el rango de 1: 2-1: 4. La proporción de IR700 se redujo, si fue necesario.
  4. Realizar electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como confirmación de la formación de un APC. Imagine el gel a 700 nm utilizando un imager fluorescente y manche la proteína en el gel utilizando un kit de tinción de proteínas siguiendo el protocolo del kit (consulte la Tabla de materiales,Tinción de proteínas CBB).

2. Generación de un modelo de difusión pleural

  1. Preparar células diana que expresan luciferasa y suspender 1,0 × 106 células diana en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS)
    NOTA: Las células cancerosas intratorácicas como el cáncer de pulmón y MPM son adecuadas como células diana. Las células que expresan luciferasa se prepararon a través de la transfección del gen de la luciferasa, y se confirmó una alta expresión de luciferasa después de > 10 pasajes celulares. Las células se cultivaron en un medio suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). El número de células se ajustó de acuerdo con la tasa de crecimiento del tumor y el curso de tiempo del tratamiento (1.0. × 105-6.0 × 106 células / peso corporal).
  2. Prepare ratones desnudos homocigotos homocigotos hembra de 8-12 semanas de edad, con un peso corporal preferible de 19-21 g.
  3. Anestesiar ratones durante el procedimiento con isoflurano (introducción: 4-5%, mantenimiento 2-3%); presione la cola con pinzas para confirmar que no hay reacción.
  4. Haga un tapón con espuma de poliestireno y fije el tapón a la aguja de 30 G para que la punta permanezca a 5 mm para evitar lesiones pulmonares. Doble la punta de la aguja con fórceps limpios o presionándola contra un objeto duro limpiado con 70% de EtOH para evitar el neumotórax(Figura 1).
    PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no perforarse. Use forrceps para doblar la aguja. No sostenga el tapón cuando lo conecte a la aguja. Es más seguro pegar el tapón antes de llenar las células en la jeringa.
  5. Llene una jeringa (1 ml) con células diana y conecte una aguja de 30 G con un tapón.
  6. Desinfecte el pecho del animal con 70% de EtOH antes del procedimiento.
  7. Perfore una aguja en el pecho del ratón a través del espacio intercostal. Debido a la resistencia al golpear contra las costillas en ese momento, la punta de la aguja se movió hacia arriba y hacia abajo. Después de pasar por el espacio intercostal, presione la jeringa contra el ratón e inyecte 100 μL de células diana (Figura 2).
    NOTA: El ratón respira profundamente cuando la aguja entra correctamente en la cavidad torácica. Con la flexión de la punta de la aguja, se podría evitar el neumotórax y la inyección inadecuada de células en el pulmón.
    NOTA: Se recomienda la punción de la pared torácica derecha para evitar el riesgo de punción de la pared cardíaca.
  8. Enrolle el ratón 2-3 veces para extender las células por toda la cavidad torácica.
  9. Devuelva el ratón a una jaula limpia y caliente y monitoree hasta que sea ambulatorio. Después del procedimiento, el ratón se despertará de la anestesia y se comportará normalmente.

3. Medición de la bioluminiscencia

NOTA: El software utilizado para la adquisición de datos se enumera en la Tabla de materiales.

  1. Para confirmar la generación del modelo de diseminación pleural, evalúe las imágenes de bioluminiscencia todos los días después de inyectar las células en la cavidad torácica.
  2. Anestesiar ratones (paso 2.3) e inyectar por vía intraperitoneal D-luciferina (15 mg/mL, 200 μL).
  3. Asegúrese de que el ratón está respirando normalmente antes y después de la obtención de imágenes. Use un calentador si es necesario para prevenir la hipotermia durante la anestesia.
  4. Diez minutos después de la inyección, coloque al ratón en el equipo de medición de imágenes de bioluminiscencia (BLI). Para la adquisición de imágenes, abra el Panel de control de adquisición del software. Seleccione Luminiscente, Fotografíay Superposición (Figura 3).
  5. Establezca el tiempo de exposición como Automático. Establezca Binning como pequeño.
  6. Establezca f/stop como 1 para luminiscente y 8 para fotografía; f/stop controla la cantidad de luz recibida por el detector de dispositivos de acoplamiento cargado.
  7. Establezca el campo de visión como C.
  8. Una vez que la muestra del ratón esté lista para la obtención de imágenes, haga clic en Adquirir para la adquisición de imágenes. Se seleccionaron ratones con suficiente actividad luciferasa para estudios adicionales.
    NOTA: Un modelo de diseminación pleural adecuado muestra una fuerte luminiscencia en el sitio difuso en el tórax cuando se ve desde el lado ventral. Si las imágenes de BLI no se difunden en el tórax, y solo en el sitio de inyección, el tumor puede trasplantarse por vía subcutánea.
  9. Después de mostrar la imagen, establezca el formato de visualización en Radiance. Abra el panel Paleta de herramientas (Figura 4A).
  10. Seleccione Herramientas de ROI. Recomendamos usar el Círculo para variar el área bioluminiscente en las imágenes.
  11. Haga clic en Medir ROI para medir la intensidad bioluminiscente de la superficie (Figura 4B).
  12. Utilice Configurar medición en la esquina izquierda del panel de medición de ROI para seleccionar los valores/información necesarios. Exporte esta tabla de datos como un archivo .csv (Figura 4C).
  13. Utilice los valores de Flujo Total (p/s) como cuantificación de la intensidad bioluminiscente en el archivo de .csv.

4. Tomografía por imágenes de luminiscencia difusa (DLIT)

NOTA: El software utilizado para la adquisición de datos se enumera en la Tabla de materiales.

  1. Encienda el botón X-ray Armed.
  2. Anestesiar a los ratones (paso 2.3) y luego inyectar D-luciferina (15 mg / ml, 200 μL) por vía intraperitoneal en los ratones. Para disparar DLIT continuamente de 3.2 a 3.7, omita este paso.
  3. Diez minutos después de la inyección, coloque el ratón en el equipo BLI.
  4. Abra el Panel de control de adquisición del software. Seleccione Luminiscente, Fotografía, CT, Ratón estándary Superposición. Otros ajustes fueron los mismos que en 3.4-3.6(Figura 5A).
  5. Seleccione el Asistente para imágenes en el Panel de control de adquisición.
  6. Seleccione Bioluminiscencia y luego DLIT (Figura 5B).
  7. Seleccione Firefly como la longitud de onda a medir (Figura 5C).
  8. Establezca el sujeto de imagen como ratón,los parámetros de exposición como configuración automática,el campo de visión como C-13,4 cmy la altura del sujeto como 1,5 cm (Figura 5D).
  9. Empujar los rayos X se producirá cuando se energize. Adquirir.
  10. Abra los datos de la imagen secuencial de TC.
  11. Abra Topografía de superficie en la paleta de herramientas. Seleccione Mostrar (Figura 6A).
  12. Ajuste el umbral ya que la pantalla púrpura muestra solo la superficie del cuerpo (Figura 6B). A continuación, seleccione el ratón desnudo del sujeto y haga clic en generar superficie. Asegúrese de que el contorno del ratón se dibuja con precisión (Figura 6C).
  13. Abra la ficha Paleta de herramientas, Propiedades de reconstrucción 3D de DLIT. Seleccione Propiedades del tejido como tejido de ratón y Espectro de fuente como luciérfrica (Figura 6D). A continuación, abra la pestaña Analizar y confirme los datos para cada dato de longitud de onda seleccionado. Finalmente, haga clic en el botón Reconstruir (Figura 6E).
  14. Confirme la presencia de BLI en la cavidad torácica en la imagen DLIT configurada.

5. NIR-PIT para el modelo de diseminación pleural in vivo

  1. Mida la dosis de luz del láser de longitud de onda (NIR) de 690 nm con un medidor de potencia y ajuste la salida a 100 mW/cm2.
    NOTA: La luz láser es coherente con un tamaño de bobina preciso; por lo tanto, la energía de la luz apenas cambia independientemente de la distancia dentro de los 50 cm. Si hay muchos eventos adversos, como quemaduras, reduzca la salida dentro del rango de 40 mW / cm2.
  2. Limpie la cola con 70% de EtOH e inyecte APC por vía intravenosa (100 μg) a través de la vena de la cola 24 h antes de la irradiación NIR. Aplique presión en el lugar de la inyección para controlar el sangrado.
    NOTA: Ajuste el volumen de APC a 50-200 μL para inyección.
  3. Anestesiar a los ratones (paso 2.3) y acostarlos sobre su espalda. Para evitar la irradiación NIR al sitio no objetivo, proteja otros sitios con papel de aluminio(Figura 7A). Irradiar con luz NIR con un láser de 100 J/cm2; si el tumor se disemina de nuevo al vientre, la dosis de irradiación con luz NIR podría dividirse en múltiples direcciones(Figura 7B).
    NOTA: Ajuste la dosis a 30-150 J/cm2 dependiendo de los resultados in vitro y eventos adversos como quemaduras.
  4. Cuando la irradiación NIR esté completa y el ratón esté despierto, devuélvalo a la jaula.
  5. Observe el BLI y mida el ROI a lo largo del tiempo (todos los días) (ver 3.2-3.12).
  6. Para imágenes ex vivo, eutanasiar ratones con dióxido de carbono 24 h después de la inyección de APC, inmediatamente antes de la irradiación NIR.
    1. Para observar el interior del pecho del ratón, retire el tórax y corte las costillas y el esternón. Capture la imagen de fluorescencia (700 nm) junto con el control sin administración de APC. Luego, aplique D-luciferina (150 μg / ml) sobre el tórax expuesto, y se tomó el BLI (consulte 3.2-3.7).

Resultados

El anticuerpo anti-podoplanina NZ-1 se conjudicó con IR700 para generar NZ-1-IR700. Confirmamos la unión de NZ-1 e IR700 en un SDS-PAGE (Figura 8). La expresión de luciferasa H2373 (H2373-luc) se preparó transfectando células malignas de mesotelioma (H2373) con un gen luciferasa10.

Anestesiamos ratones desnudos homocigómicos hembra de 8-12 semanas de edad e inyectamos 1 × 105 células H2373-luc en la cavidad torácica. El ...

Discusión

En este estudio, demostramos un método para medir el efecto terapéutico de NIR-PIT en el modelo de diseminación pleural de MPM. La muerte celular altamente selectiva se realizó con NIR-PIT; así, el tejido normal apenas se dañó23,24,25. Con este tipo de muerte celular selectiva, se demostró que NIR-PIT es seguro en los modelos diseminados9,

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Ninguno

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol RedWako209-016941for cell culture
1mL syringeTERUMOSS-01Tfor mice experiment
30G needleNipro1907613for mice experiment
BALB/cSlc-nu/nuJapan SLC
Collidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025use for gel protein staining
Coomassie (bradford) Plus protein assayThermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)PI-23200for measuring the APC concentration
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Wako043-07216use for conjugation of IR700
D-Luciferin (potassium salt)Cayman Chemical14681for bioluminescence imaging and DLIT
GraphPad Prism7GraphPad softwarefor statistical analysis
Image StudioLi-Cor Biosciencesfor analyzing 700 nm fluorescent image
IRDye 700DX Ester Infrared DyeLI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011
isofluraneWako095-06573for mice anesthesia
IVIS Spectrum CTPerkinElmerfor capturing bioluminescent image and DLIT
Living ImagePerkinElmerfor analyzing bioluminescent image and DLIT
Na2HPO4SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)S9763use for conjugation of IR700
NIR LaserChangchun New Industries Optoelectronics TechnologyMRL-III-690Rfor NIR irradiation
Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 wellInvitrogenXP04202BOXuse for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)InvitrogenNP0007use for SDS-PAGE
Optical power meterThorlabs (Newton, NJ, USA)PM100for measuring the output of the NIR laser 
PBS(-)Wako166-23555
Pearl Trilogy imaging systemLi-Cor Biosciencesfor capturing 700 nm fluorecent image
Penicilin-Streptomycin Solution (x100)Wako168-23191for cell culture
Puromycin DihydrochlorideThermoFisherA1113803for luciferase transfection
RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral PrticlesPerkinElmerCLS960002for luciferase transfection
RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol RedWako189-02025for cell culture
Sephadex G25 column (PD-10) GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)17-0851-01use for conjugation of IR700
UV-1900iShimadzufor measuring the APC concentration

Referencias

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