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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La photoimmunothérapie dans le proche infrarouge (NIR-PIT) est une stratégie thérapeutique émergente contre le cancer qui utilise un conjugué anticorps-photoabsorbeur (IR700Dye) et une lumière NIR pour détruire les cellules cancéreuses. Ici, nous présentons une méthode pour évaluer l’effet antitumoral de NIR-PIT dans un modèle murin de cancer du poumon disséminé pleural et de mésothéliome pleural malin en utilisant l’imagerie par bioluminescence.

Résumé

L’efficacité de la photoimmunothérapie peut être évaluée plus précisément avec un modèle murin orthotopique qu’avec un modèle sous-cutané. Un modèle de dissémination pleurale peut être utilisé pour l’évaluation des méthodes de traitement des maladies intrathoraciques telles que le cancer du poumon ou le mésothéliome pleural malin.

La photoimmunothérapie dans le proche infrarouge (NIR-PIT) est une stratégie de traitement du cancer récemment développée qui combine la spécificité des anticorps ciblant les tumeurs avec la toxicité causée par un photoabsorbeur (IR700Dye) après exposition à la lumière NIR. L’efficacité de NIR-PIT a été rapportée à l’aide de divers anticorps; cependant, seuls quelques rapports ont montré l’effet thérapeutique de cette stratégie dans un modèle orthotopique. Dans la présente étude, nous démontrons un exemple d’évaluation de l’efficacité du modèle de cancer du poumon disséminé pleural, qui a été traité à l’aide de NIR-PIT.

Introduction

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité malgré des décennies de recherche. L’une des raisons est que la radiothérapie et la chimiothérapie sont des techniques hautement invasives, ce qui peut limiter leurs avantages thérapeutiques. Les thérapies cellulaires ou moléculaires ciblées, qui sont des techniques moins invasives, font l’objet d’une attention accrue. La photoimmunothérapie est une méthode de traitement qui améliore synergiquement l’effet thérapeutique en combinant immunothérapie et photothérapie. L’immunothérapie renforce l’immunité tumorale en augmentant l’immunogénicité du microenvironnement tumoral et en réduisant la suppression immunorégulatrice, entraînant la destruction des tumeurs dans le corps. La photothérapie détruit les tumeurs primaires avec une combinaison de photosensibilisateurs et de rayons lumineux, et les antigènes spécifiques de la tumeur libérés par les cellules tumorales renforcent l’immunité tumorale. Les tumeurs peuvent être traitées sélectivement à l’aide de photosensibilisants car elles sont spécifiques et sélectives pour les cellules cibles. La modalité de la photothérapie comprend la thérapie photodynamique (PDT), la thérapie photothermique (PTT) et les thérapies basées sur la photochimie1.

La photoimmunothérapie proche infrarouge (NIR-PIT) est une méthode de photothérapie antitumorale récemment développée qui combine une thérapie photochimique et une immunothérapie1,2. NIR-PIT est une thérapie moléculairement ciblée qui cible des molécules spécifiques de surface cellulaire par la conjugaison d’un colorant phtalocyanine de silicium proche infrarouge, IRdye 700DX (IR700), à un anticorps monoclonal (mAb). La membrane cellulaire de la cellule cible est détruite lors de l’irradiation avec une lumière NIR (690 nm)3.

Le concept d’utilisation de la luminothérapie ciblée en combinant des photosensibilisants conventionnels et des anticorps ou une PDT ciblée est vieux de plus de trois décennies4,5. Des études antérieures ont tenté de cibler les agents PDT conventionnels en les conjuquant à des anticorps. Cependant, le succès a été limité car ces conjugués ont été piégés dans le foie, en raison de l’hydrophobicité des photosensibilisants6,7. De plus, le mécanisme du NIR-PIT est complètement différent de celui du PDT conventionnel. Les photosensibilisants conventionnels génèrent un stress oxydatif qui résulte d’une conversion d’énergie qui absorbe l’énergie lumineuse, se disloque à un état excité, passe à l’état de base et provoque l’apoptose. Cependant, NIR-PIT provoque une nécrose rapide en détruisant directement la membrane cellulaire en agrégeant des photosensibilisants sur la membrane par une réaction photochimique8. Le NIR-PIT est supérieur au PDT ciblé conventionnel à bien des égards. Les photosensibilisateurs conventionnels ont de faibles coefficients d’extinction, nécessitant la fixation d’un grand nombre de photosensibilisateurs à une seule molécule d’anticorps, ce qui réduit potentiellement l’affinité de liaison. La plupart des photosensibilisants conventionnels sont hydrophobes, ce qui rend difficile la liaison des photosensibilisants aux anticorps sans compromettre leur immunoréactivité ou leur accumulation de cible in vivo. Les photosensibilisateurs conventionnels absorbent généralement la lumière dans la gamme visible, ce qui réduit la pénétration des tissus.

Plusieurs études sur le NIR-PIT ciblant les tumeurs intrathoraciques telles que le cancer du poumon et les cellules malignes du mésothéliome pleural (MPM) ont été rapportées9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Cependant, seuls quelques rapports ont décrit l’efficacité de NIR-PIT dans les modèles pleuraux disséminés de MPM ou de cancer du poumon9,10,11,12. On pense que les modèles de xénogreffe de tumeurs sous-cutanées sont des modèles tumoraux standard et sont actuellement largement utilisés pour évaluer les effets antitumoraux des nouvelles thérapies18. Cependant, le microenvironnement tumoral sous-cutané n’est pas permissif pour le développement d’une structure tissulaire appropriée ou d’une condition qui récapitule correctement un véritable phénotype malin19,20,21,22. Idéalement, des modèles de maladie orthotopique devraient être établis pour une évaluation plus précise des effets antitumoraux.

Ici, nous démontrons une méthode d’évaluation de l’efficacité dans un modèle murin de cancer du poumon disséminé pleural, qui a été traité à l’aide de NIR-PIT. Un modèle murin de dissémination pleurale est généré par injection de cellules tumorales dans la cavité thoracique et confirmé à l’aide de la luminescence de la luciférase. La souris a été traitée par une injection intraveineuse de mAb conjuguée à l’IR700 et à une irradiation NIR dans la poitrine. L’effet thérapeutique a été évalué en utilisant la luminescence de la luciférase.

Protocole

Toutes les expériences in vivo ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des ressources des animaux de laboratoire du Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Nagoya (approbation #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Des souris nues homozygotes homozygotes âgées de six semaines ont été achetées et entretenues au Centre animalier de l’Université de Nagoya. Lors de la réalisation de la procédure chez la souris, ils ont été anesthésiés avec de l’isoflurane (introduction: 4-5%, entretien 2-3%); la patte a été pressée avec une pince à épiler pour confirmer la profondeur de l’anesthésie.

1. Conjugaison de l’IR700 avec mAb

  1. Incuber le mAb (1 mg, 6,8 nmol) avec l’ester IR700 NHS (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L dans le DMSO) dans 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) à 15-25 °C pendant 1 h.
  2. Purifier le mélange à l’aide d’une colonne (p. ex. Sephadex). Préparez et lavez la colonne avec PBS. Ensuite, appliquez le mélange sur la colonne et collectez la goutte, qui contient l’anticorps conjugué IR700 purifié. Cet anticorps conjugué IR700 est appelé conjugué photosensibilisateur d’anticorps (APC).
  3. Mesurez la concentration de protéines et d’IR700 dans l’APC.
    1. Préparez des courbes d’étalonnage pour les protéines et l’IR700 à l’aide d’un spectrophotomètre.
    2. Mélanger les concentrations standard d’albumine avec un kit de dosage des protéines en suivant le protocole du kit (voir Table des matériaux,coloration protéique Coomassie Brilliant Blue (CBB)). Mesurez l’absorbance de l’albumine à une longueur d’onde de 595 nm et tracez la courbe d’étalonnage (une formule d’approximation linéaire) de la protéine à l’aide de l’équation suivante : y = ax + b (x : concentration, y : absorbance).
    3. Obtenez des courbes d’étalonnage pour IR700 avec absorption à 690 nm en utilisant la même procédure. La concentration standard d’IR700 est recommandée à 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/mL).
    4. Mesurer la concentration en protéines et la concentration en IR700 dans l’APC à l’aide d’une courbe d’étalonnage [x = (y-b)/a (x : concentration, y : absorbance)].
    5. Déterminer le nombre de colorants IR700 liés par mAb avec les résultats de la concentration molaire.
      REMARQUE: Il est important de déterminer le nombre optimal de conjugaison des molécules IR700 par molécule mAb. Généralement, environ trois molécules IR700 liées sur une seule molécule mAb seraient efficaces à la fois in vitro et in vivo. De nombreux IR700 liés par anticorps (par exemple, six) facilitent le piégeage dans le foie lors d’expériences in vivo. Le rapport entre les anticorps liés à l’IR700 était de l’ordre de 1:2-1:4. La proportion d’IR700 a été réduite, si nécessaire.
  4. Effectuer une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) comme confirmation de la formation d’un APC. Imagez le gel à 700 nm à l’aide d’un imageur fluorescent et colorez la protéine dans le gel à l’aide d’un kit de coloration protéique en suivant le protocole du kit (voir Table des matériaux,coloration des protéines CBB).

2. Génération d’un modèle de dissémination pleurale

  1. Préparer des cellules cibles exprimant la luciférase et suspendre 1,0 ×10 6 cellules cibles dans 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
    REMARQUE: Les cellules cancéreuses intrathoraciques telles que le cancer du poumon et la MPM conviennent comme cellules cibles. Les cellules exprimant la luciférase ont été préparées par transfection du gène de la luciférase, et une expression élevée de la luciférase a été confirmée après > 10 passages cellulaires. Les cellules ont été cultivées dans un milieu supplémenté de sérum bovin fœtal à 10 % et de pénicilline (100 UI/mL) et de streptomycine (100 mg/mL). Le nombre de cellules a été ajusté en fonction du taux de croissance tumorale et du déroulement du traitement (1,0. × 105-6,0 × 106 cellules / poids corporel).
  2. Préparez des souris nues homozygotes femelles de 8 à 12 semaines, avec un poids corporel préférable de 19 à 21 g.
  3. Anesthésier les souris pendant la procédure avec de l’isoflurane (introduction: 4-5%, entretien 2-3%); appuyez sur la queue avec une pince à épiler pour confirmer qu’il n’y a pas de réaction.
  4. Faites un bouchon avec de la mousse de polystyrène et fixez le bouchon à l’aiguille de 30 G de sorte que la pointe reste à 5 mm pour éviter les lésions pulmonaires. Pliez l’extrémité de l’aiguille avec une pince propre ou en la pressant contre un objet dur nettoyé à 70% d’EtOH pour éviter le pneumothorax (Figure 1).
    ATTENTION : Attention à ne pas vous percer. Utilisez une pince pour plier l’aiguille. Ne tenez pas le bouchon lorsque vous l’attachez à l’aiguille. Il est plus sûr de coller le bouchon avant de remplir les cellules dans la seringue.
  5. Remplissez une seringue (1 mL) avec des cellules cibles et fixez une aiguille 30G avec un bouchon.
  6. Désinfectez la poitrine de l’animal avec 70% d’EtOH avant la procédure.
  7. Percez une aiguille dans la poitrine de la souris à travers l’espace intercostal. En raison de la résistance lors de la frappe contre les côtes à ce moment-là, la pointe de l’aiguille se déplaçait de haut en bas. Après avoir traversé l’espace intercostal, appuyez la seringue contre la souris et injectez 100 μL de cellules cibles (Figure 2).
    REMARQUE: La souris respire profondément lorsque l’aiguille pénètre correctement dans la cavité thoracique. Avec la flexion de la pointe de l’aiguille, le pneumothorax et l’injection inappropriée de cellules dans le poumon pourraient être évités.
    REMARQUE: La ponction de la paroi thoracique droite est recommandée pour éviter le risque de ponction de la paroi cardiaque.
  8. Roulez la souris 2-3 fois pour répartir les cellules dans toute la cavité thoracique.
  9. Rebez la souris dans une cage propre et chaude et surveillez jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire. Après la procédure, la souris se réveillera de l’anesthésie et se comportera normalement.

3. Mesure de la bioluminescence

REMARQUE : Le logiciel utilisé pour l’acquisition de données est répertorié dans la Table des matériaux.

  1. Pour confirmer la génération du modèle de dissémination pleurale, évaluez les images de bioluminescence tous les jours après l’injection des cellules dans la cavité thoracique.
  2. Anesthésier les souris (étape 2.3) et injecter par voie intrapéritonéale de la D-luciférine (15 mg/mL, 200 μL).
  3. Assurez-vous que la souris respire normalement avant et après l’imagerie. Utilisez un appareil de chauffage si nécessaire pour prévenir l’hypothermie pendant l’anesthésie.
  4. Dix minutes après l’injection, placez la souris dans l’équipement de mesure d’imagerie par bioluminescence (BLI). Pour l’acquisition d’images, ouvrez le Panneau de configuration d’acquisition du logiciel. Sélectionnez Luminescent, Photographieet Superposition (Figure 3).
  5. Définissez le temps d’exposition sur Auto. Définissez Binning comme petit.
  6. Réglez f/stop sur 1 pour luminescent et 8 pour la photographie; f/stop contrôle la quantité de lumière reçue par le détecteur de dispositif à couplage chargé.
  7. Définissez le champ de vision sur C.
  8. Une fois que l’échantillon de souris est prêt pour l’imagerie, cliquez sur Acquérir pour l’acquisition d’images. Des souris ayant une activité suffisante de la luciférase ont été sélectionnées pour d’autres études.
    REMARQUE: Un modèle de dissémination pleurale approprié montre une forte luminescence sur le site diffus dans la poitrine lorsqu’il est vu du côté ventral. Si les images BLI ne sont pas diffusées dans le thorax, et seulement au site d’injection, la tumeur peut être transplantée par voie sous-cutanée.
  9. Après avoir affiché l’image, définissez le format d’affichage sur Radiance. Ouvrez le panneau Palette d’outils (Figure 4A).
  10. Sélectionnez Outils de retour sur investissement. Nous vous recommandons d’utiliser le Cercle pour varier la zone bioluminescente sur les images.
  11. Cliquez sur Mesurer le retour sur investissement pour mesurer l’intensité bioluminescente de la surface ( Figure4B).
  12. Utilisez Configurer la mesure dans le coin gauche du panneau de mesure du retour sur investissement pour sélectionner les valeurs/informations nécessaires. Exportez cette table de données en tant que fichier .csv (Figure 4C).
  13. Utilisez les valeurs de Flux total (p/s) comme quantification de l’intensité bioluminescente dans le fichier .csv.

4. Tomographie par imagerie par luminescence diffuse (DLIT)

REMARQUE : Le logiciel utilisé pour l’acquisition de données est répertorié dans la Table des matériaux.

  1. Activez le bouton X-ray Armed ( Armed (Armée de rayons X).
  2. Anesthésier les souris (étape 2.3), puis injecter de la D-luciférine (15 mg/mL, 200 μL) par voie intrapéritonéale chez les souris. Pour filmer DLIT en continu de 3,2 à 3,7, ignorez cette étape.
  3. Dix minutes après l’injection, placez la souris dans l’équipement BLI.
  4. Ouvrez le Panneau de configuration d’acquisition du logiciel. Sélectionnez Luminescent, Photographie, CT, Souris Standard-Oneet Superposition. Les autres paramètres étaient les mêmes que dans les 3.4-3.6(Figure 5A).
  5. Sélectionnez l’Assistant Imagerie dans le Panneau de configuration d’acquisition.
  6. Sélectionnez Bioluminescence, puis DLIT (Figure 5B).
  7. Sélectionnez Firefly comme longueur d’onde à mesurer (Figure 5C).
  8. Définissez le sujet d’imagerie comme souris, les paramètres d’exposition comme paramètres automatiques, le champ de vision sur C-13,4 cmet la hauteur du sujet sur 1,5 cm ( Figure5D).
  9. Poussez les rayons X seront produits lorsqu’ils seront sous tension. Acquérir.
  10. Ouvrez les données d’image séquentielle CT.
  11. Ouvrez Topographie de surface dans la palette d’outils. Sélectionnez Afficher (Figure 6A).
  12. Ajustez le seuil car l’écran violet affiche uniquement la surface du corps (Figure 6B). Ensuite, sélectionnez la souris Nue de l’objet et cliquez sur générer la surface. Assurez-vous que le contour de la souris est dessiné avec précision (Figure 6C).
  13. Ouvrez l’onglet Palette d’outils, Propriétés de reconstruction 3D DLIT. Sélectionnez Propriétés tissulaires comme Tissu de souris et Spectre source comme Firefly (Figure 6D). Ensuite, ouvrez l’onglet Analyser et confirmez les données pour chaque donnée de longueur d’onde sélectionnée. Enfin, cliquez sur le bouton Reconstruire (Figure 6E).
  14. Confirmez la présence de BLI dans la cavité thoracique dans l’image DLIT configurée.

5. NIR-PIT pour le modèle de dissémination pleurale in vivo

  1. Mesurez la dose lumineuse du laser de longueur d’onde (NIR) de 690 nm avec un capteur de puissance et ajustez la sortie à 100 mW/cm2.
    REMARQUE: La lumière laser est cohérente avec une taille de bobine précise; ainsi, l’énergie lumineuse ne change guère quelle que soit la distance à moins de 50 cm. S’il y a beaucoup d’événements indésirables, tels que des brûlures, réduire la puissance dans la plage de 40 mW/cm2.
  2. Nettoyez la queue avec 70% d’EtOH et injectez par voie intraveineuse DE l’APC (100 μg) via la veine caudale 24 h avant l’irradiation NIR. Appliquer une pression sur le site d’injection pour contrôler les saignements.
    REMARQUE: Réglez le volume de l’APC à 50-200 μL pour l’injection.
  3. Anesthésiez les souris (étape 2.3) et posez-les sur le dos. Pour éviter l’irradiation NIR vers le site non cible, protégez les autres sites avec du papier d’aluminium(Figure 7A). Irradier à la lumière NIR avec un laserde 100 J/cm2 ; si la tumeur est disséminée vers le ventre, la dose d’irradiation NIR-lumière pourrait être divisée en plusieurs directions (Figure 7B).
    REMARQUE: Ajuster la dose à 30-150 J / cm2 en fonction des résultats in vitro et des événements indésirables tels que les brûlures.
  4. Lorsque l’irradiation NIR est terminée et que la souris est éveillée, retournez-la dans la cage.
  5. Observez le BLI et mesurez le retour sur investissement dans le temps (tous les jours) (voir 3.2-3.12).
  6. Pour l’imagerie ex vivo, euthanasier les souris avec du dioxyde de carbone 24 h après l’injection d’APC, immédiatement avant l’irradiation NIR.
    1. Pour observer l’intérieur de la poitrine de la souris, retirez le thorax et coupez les côtes et le sternum. Capturez l’image de fluorescence (700 nm) à côté du contrôle sans administration APC. Ensuite, appliquez la D-luciférine (150 μg/mL) sur le thorax exposé, et le BLI a été prélevé (voir 3.2-3.7).

Résultats

L’anticorps anti-podoplanine NZ-1 a été conjugué avec IR700 pour générer NZ-1-IR700. Nous avons confirmé la liaison de NZ-1 et IR700 sur une SDS-PAGE (Figure 8). H2373 exprimant la luciférase (H2373-luc) a été préparé en transfectant des cellules malignes du mésothéliome (H2373) avec un gène de luciférase10.

Nous avons anesthésé des souris nues homozygotes femelles de 8 à 12 semaines et injecté 1 ×10 cellule...

Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré une méthode pour mesurer l’effet thérapeutique du NIR-PIT sur le modèle de dissémination pleurale de la MPM. La destruction cellulaire hautement sélective a été réalisée avec NIR-PIT; ainsi, le tissu normal était à peine endommagé23,24,25. Avec ce type de destruction sélective des cellules, NIR-PIT s’est avéré sûr dans les modèles diss...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Aucun

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol RedWako209-016941for cell culture
1mL syringeTERUMOSS-01Tfor mice experiment
30G needleNipro1907613for mice experiment
BALB/cSlc-nu/nuJapan SLC
Collidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025use for gel protein staining
Coomassie (bradford) Plus protein assayThermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)PI-23200for measuring the APC concentration
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Wako043-07216use for conjugation of IR700
D-Luciferin (potassium salt)Cayman Chemical14681for bioluminescence imaging and DLIT
GraphPad Prism7GraphPad softwarefor statistical analysis
Image StudioLi-Cor Biosciencesfor analyzing 700 nm fluorescent image
IRDye 700DX Ester Infrared DyeLI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011
isofluraneWako095-06573for mice anesthesia
IVIS Spectrum CTPerkinElmerfor capturing bioluminescent image and DLIT
Living ImagePerkinElmerfor analyzing bioluminescent image and DLIT
Na2HPO4SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)S9763use for conjugation of IR700
NIR LaserChangchun New Industries Optoelectronics TechnologyMRL-III-690Rfor NIR irradiation
Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 wellInvitrogenXP04202BOXuse for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)InvitrogenNP0007use for SDS-PAGE
Optical power meterThorlabs (Newton, NJ, USA)PM100for measuring the output of the NIR laser 
PBS(-)Wako166-23555
Pearl Trilogy imaging systemLi-Cor Biosciencesfor capturing 700 nm fluorecent image
Penicilin-Streptomycin Solution (x100)Wako168-23191for cell culture
Puromycin DihydrochlorideThermoFisherA1113803for luciferase transfection
RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral PrticlesPerkinElmerCLS960002for luciferase transfection
RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol RedWako189-02025for cell culture
Sephadex G25 column (PD-10) GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)17-0851-01use for conjugation of IR700
UV-1900iShimadzufor measuring the APC concentration

Références

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