Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento y la amplificación de las bacterias conjuntivales anaerobias aeróbicas y facultativas del ratón usando una hisopo ocular única y un paso de enriquecimiento basado en la cultura con la identificación posterior por métodos basados microbiológicos y espectrometría de masas MALDI-TOF.

Resumen

La superficie ocular era considerada una vez inmune privilegiada y abiótica, pero aparece recientemente que hay una presencia commensal pequeña, pero persistente. La identificación y la supervisión de las especies bacterianas en la mucosa ocular han sido desafiadoras debido a su abundancia baja y a la disponibilidad limitada de la metodología apropiada para el crecimiento y la identificación comensales. Hay dos enfoques estándar: métodos basados en el cultivo o métodos de secuenciación de ADN. El primer método es problemático debido a las bacterias recuperables limitadas y el segundo acercamiento identifica las bacterias vivas y muertas que llevan a una representación aberrante del espacio ocular. Desarrollamos un método robusto y sensible para el aislamiento bacteriano mediante el desarrollo de técnicas de cultivo microbiológico estándar. Esta es una técnica basada en hisopos, utilizando un hisopo delgado hecho "en el laboratorio" que se dirige a la conjuntiva inferior, seguido de un paso de amplificación para los géneros anaeróbicos aeróbicos y facultativos. Este protocolo nos ha permitido aislar e identificar especies conjuntivales como Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,etc. El enfoque es adecuado para definir la diversidad commensal en ratones bajo diferentes condiciones de enfermedad.

Introducción

El objetivo de este protocolo es aumentar el aislamiento específico de microbios anaeróbicos aeróbicos y facultativos viables y raros de la conjuntiva ocular para caracterizar el microbioma ocular. Amplios estudios han perfilado comunidades de la mucosa conmensal en la piel, intestino, vías respiratorias y genitales y muestran que estas comunidades influyen en el desarrollo del sistema inmune y la respuesta^1,2,3. Se ha demostrado que las comunidades comensales oculares cambian durante ciertas patologías de la enfermedad, como la enfermedad del ojo seco^4,el síndrome de Sjogren⁵ y la diabetes^6. Sin embargo, la capacidad de definir una comunidad comensal de superficie ocular típica se ve obstaculizada por su abundancia relativamente baja en comparación con los otros sitios de la mucosa^6,7,8. Esto provoca una controversia sobre si existe un microbioma ocular residente y si existe, si difiere del microbioma de la piel y, en consecuencia, su efecto local sobre el desarrollo y la respuesta del sistema inmune innato. Este protocolo puede ayudar a resolver esta pregunta.

En general, los enfoques para definir el nicho comensal ocular se basan en técnicas de secuenciación y cultivo^4,7,9. La secuenciación del ADNr 16 S y el análisis BRISK⁷ muestran una diversidad más amplia que las técnicas basadas en la cultura, pero son incapaces de diferenciar entre microbios vivos y muertos. Dado que la superficie ocular es hostil a muchos microbios debido a las propiedades antimicrobianas de la película lagrimal⁴ que generan una gran variedad de fragmentos de ADN, los enfoques basados en adn detectarán estos artefactos que pueden sesgar los datos hacia la identificación de bacterias muertas como comensales residentes en lugar de contaminantes. Esto resulta en una aberrante identificación comensal y caracterización del espacio ocular como mayor en abundancia y diversidad de microbios¹⁰. Esto hace que sea difícil definir el microbioma ocular residente a través de métodos basados en el ADN. Mientras que, las técnicas estándar basadas en el cultivo no pueden detectar los contraensales porque la carga es demasiado baja¹¹. Nuestro método mejora las prácticas estándar mediante el uso de un hisopo delgado que puede dirigirse a la conjuntiva, evitando así la contaminación de la piel vecina, así como el concepto de que los organismos viables pueden enriquecerse mediante un breve cultivo en medios densos en nutrientes con el objetivo de resucitar viables pero no cultivables, así como, enriquecer para microbios viables raros.

Los resultados, abundancia relativa de comensales oculares por hisopo ocular, caracterizan el microbioma residente de la conjuntiva y son importantes para fines comparativos. Nuestros datos muestran que hay una diferencia entre la piel y la microbiota conjuntival, así como una mayor diversidad con el aumento de la edad y una diferencia específica del sexo en la abundancia. Además, este enfoque ha encontrado de forma reproducible diferencias cómicas en ratones knock-out¹². Este protocolo se puede aplicar para describir el microbioma ocular que puede variar debido a las prácticas de enjaulado, la geografía o el estado de la enfermedad, así como los efectos locales de los metabolitos y productos consal sobre el desarrollo y la respuesta del sistema inmunológico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran ratones siguen las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Siga las pautas de seguridad del laboratorio (según las indicaciones de su departamento institucional de salud y seguridad ambiental) cuando trabaje con microorganismos y materiales potencialmente contaminados. Utilice recipientes de desecho apropiados y procedimientos de descontaminación antes de la eliminación de materiales contaminados potencialmente peligrosos.

1. Preparación del hisopo ocular, configuración del campo de trabajo, hisopado de ojo de ratón y enriquecimiento de la muestra

1. Preparar hisopos oculares estériles
   NOTA: Los hisopos de ojos estériles son palillos de madera finamente recubiertos con una capa delgada de fibra de algodón y hechos en casa.
   1. Autoclave cantidad apropiada de algodón bateando y palillos de dientes para el número de ratones a ser hisopados.
   2. Pellizque un pedazo de medio centímetro de largo de bateo de algodón con el pulgar y el índice. Burlarse del bateo tirando de los bordes con pulgares y dedos interiores para formar una sola capa porosa plana, deteniéndose justo antes de que el bateo se deshaga (pequeños trozos de algodón dispersos a lo largo del bateo estirado son aceptables).
   3. Gire el bateo alrededor de uno de los extremos afilados del palillo de dientes sosteniendo ligeramente la pieza estirada en la punta del palillo de dientes a medida que se tuerce, consulte la Figura 1. El hisopo de ojo "completado" tendrá una capa muy delgada de algodón estirada sobre la punta, que se extiende aproximadamente de medio a un centímetro de distancia de la punta.
   4. Inserte los hisopos "completados" en el pequeño casto, el lado del hisopo hacia abajo y la cubierta. autoclave.
2. Configurar el área de trabajo
   1. Preparar anestesia que contenga 2 mL de ketamina (100 mg/mL), 400 μL de xilazina (100 mg/ml) y 27,6 mL de solución salina estéril (0,9% nacl en dH₂O) en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml de ventosa. Filtro esterilizar y anestesia alícuota para uso inmediato (puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes; siempre dejar equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso).
   2. Despeje y limpie el área de trabajo con desinfectante para minimizar la contaminación.
   3. Alícuota 0.5 mL de medios estériles de infusión de corazón cerebral (BHI) en tubos de microcentrífuga estériles etiquetados de 1.5 mL (1 tubo por ratón y control); organizar en rack de microcentrífuga. Poner el bastidor en el hielo.
   4. Configure el flujo de trabajo de la siguiente manera (de izquierda a derecha): estación de anestesia de ratón (jaula que contiene ratones experimentales, jaula estéril vacía, anestesia a temperatura ambiente, aguja de 25 G y jeringa de 1 mL), estación de hisopado ocular (IMC alícuota sobre hielo, hisopos oculares esterilizados, toallas de papel limpias, pulverización de isopropanol al 70%) y estación de chapado (placas de agar sangre a temperatura ambiente, pipeta de 10 μL , 10 μL de puntas desechables estériles, contenedor de residuos de riesgo biológico).
3. Hisopado ocular
   1. Administrar 10 μL de anestesia por 1 g de dosis de peso de ratón de ketamina y xilazina respectivamente por vía intraperitoneal a cada ratón adulto y colocar en una jaula en autoclave. Pruebe la anestesia exprimiendo la almohadilla del pie trasero; ningún movimiento indica anestesia apropiada.
   2. Asigne una mano para manejar solo ratones anestesiados y la otra mano para manejar solo el hisopo del ojo y el cultivo. Para el hisopado, retire el ratón completamente anestesiado de la jaula; colocar en la parte superior de la superficie de trabajo limpia colocado en su' lado con el ojo izquierdo expuesto. Rocíe las manos enguantadas con isopropanol, seque con toalla de papel limpia.
   3. Uncap etiqueta específicamente como tubo de micro-centrífuga BHI con mano dedicada al manejo de medios. Coloque el tubo de nuevo en el estante de microcentrifugación sobre hielo.  Sumerja la punta recubierta de algodón del hisopo ocular en BHI, retire el hisopo del ojo del tubo que arremolina la punta 2 veces contra el tubo interno para eliminar el exceso de líquido.
   4. Con la mano de manejo del ratón, sostenga suavemente el ratón por el desaliño del cuello. Con la otra mano, coloque la punta del hisopo ocular contra la región conjuntival medial del ojo izquierdo, ver Figura 2A. Deprima ligeramente el globo ocular y mueva el hisopo en un movimiento de lavado de ventanas (Figura 2B) hacia adelante y hacia atrás, entre el párpado inferior y el ojo, 10 veces. Mantener una presión constante.
   5. Sin tocar el pelaje, retire suavemente la punta del hisopo, perpendicular al lugar donde se insertó, y coloque el lado del algodón del hisopo hacia abajo directamente en un tubo de microcentrifugación etiquetado que contenga medios de IMC. Aplique una gota lubricante para los ojos en el ojo hisopado.
   6. Devuelva el ratón a la jaula.
   7. Deje reposar el hisopo durante 10 a 15 minutos sobre hielo y retire el hisopo ocular con la mano enguanada esterilizada mezclando la punta en el medio durante 10 rotaciones. Retire el hisopo girando la punta contra la pared interna del tubo de microcentrifugación durante 5 rotaciones. Deseche el hisopo en un recipiente de riesgo biológico.
   8. Repita los pasos 1.3.2 a 1.3.7 para cada ratón y para las muestras de control (hisopo de piel o piel). Esterilice los guantes apropiadamente entre cada hisopo.
4. enriquecimiento
   1. Enriquecer la muestra incubando el tubo estáticamente durante 1 h a 37 °C
   2. Durante la incubación, etiquete una triptasa de soja a temperatura ambiente con una placa de agar sangre de oveja al 5% (placa TSA) por ratón y divida por la mitad.
   3. Después de la incubación del cultivo de hisopos oculares, retire las muestras enriquecidas de la incubadora y colóquelo en el hielo.
   4. Brevemente muestras de vórtice para mezclar y platear de acuerdo con el esquema de la Figura 3A. Alícuota 10 μL de la muestra sobre la placa TSA e incline la placa para formar una tira, repita 2 veces.
   5. En el otro lado de la línea divisoria de la placa, punto 10 μL de muestra en agar, repita 9 veces.
   6. Incubar placas a 37 °C durante 18 h, 2 días y 4 días (en una cámara limpia que evite que las placas de agar se sequen). Contar colonias en tiras, observar la morfología y calcular las unidades formantes de colonias (UFC) por hisopo para aislamientos morfológicamente similares. Mira los puntos para los organismos únicos no capturados en tiras.

2. Placa maestra, caracterización e identificación de microbios oculares

1. Placa maestra
   1. Dibuje cuadrículas en la parte posterior de una placa TSA (Figura 3B). Elija una colonia con un palillo de dientes estéril de cada placa de hisopo de ojo de ratón y raye el cuadrado de la placa maestra (cuadrículas), etiquete la cuadrícula con el número de colonia y la información del ratón. Recoger y platear tres colonias diferentes para cada colonia morfológicamente distinta.
   2. Incubar la placa durante la noche a 37 °C. Continuar la incubación durante 96 horas, comprobando diariamente la aparición de nuevos aislados.
      NOTA: La población de Commensal variará según la edad del ratón, la nutrición, el estado de la enfermedad y las prácticas de enjaulado. La caracterización aislada se basa en las bacterias anaeróbicas aeróbicas y facultativas predominantes encontradas en nuestro laboratorio.
2. caracterización
   1. Duplicar¹³ microbios de placa en placas de agar salado de manitol (MSA) y MacConkey (MAC), incubar durante la noche a 37 °C. Nótese el crecimiento para cada aislado y la presencia de colonias cerosas o colonias amarillas con halo en MSA.
   2. Para los cocos Gram positivos, prueba con la prueba de catalasa^13,14. Coloque una gota de peróxido de hidrógeno al 3% en un portaobjetos de vidrio limpio. Usando un palillo de dientes estéril, elija el microbio correspondiente de la placa de hisopo del ojo. Ninguna formación de burbujas indica Streptococcus spp.,ligera formación de burbujas indica Corynebacterium spp.
3. Identificación: Análisis MALDI-TOF MS
   NOTA: Las identificaciones bacterianas se llevan a cabo utilizando el MALDI-TOF y la base de datos de software. Este sistema emplea la ionización por desorción láser asistida por matriz-tiempo de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS) para el desarrollo de perfiles de espectros que se comparan con los espectros bacterianos conocidos para su identificación. E.coli,ATCC 8739, se utiliza para la calibración del sistema.
   1. Platea aislados bacterianos en placas TSA que contienen 5% de sangre de oveja e incuban durante la noche con 5% de dióxido de carbono a 37 °C.
   2. Usando un bucle de 1 μL, aplique una capa delgada de las bacterias puras al portaobjetos objetivo MALDI-TOF; 1 μL de solución de matriz MALDI-TOF MS CHCA (ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico) se sobreslía y se deja secar completamente antes de cargar el portaobjetos en el instrumento MALDI-TOF.
   3. Cada aislado se detecta por duplicado.
   4. Los informes que contienen puntuaciones de probabilidad superiores al 80%, que indican un alto valor de discriminación, se aceptan como resultados fiables y se acepta la identificación bacteriana.

Resultados

Los resultados representativos de una placa de hisopo ocular que demuestran diferentes métodos para el revestimiento se muestran en la Figura 3A que muestra aislados morfológicamente diversos del ratón C57BL/6. Para cada aislante distinto, las colonias fueron contadas en la tira y la abundancia relativa, unidades formantes únicas de la colonia (CFUs) por la hisopo del ojo, calculadas y trazadas para los propósitos de la comparación. Para la caracterización microbiológica, las bacteri...

Discusión

Debido al estado paucibacteriano de la superficie ocular, muchos laboratorios han tenido dificultades para aislar los comensales oculares^7,20,resultando en un bajo número de muestras con crecimiento, baja abundancia y baja diversidad^8. Este método mejora significativamente las prácticas de cultivo estándar^4,21 mediante la adición de un paso de enriquecimiento, así como un his...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each