Конъюнктивальная комменсальная изоляция и идентификация у мышей

Резюме

Здесь представлен протокол выделения и амплификации аэробных и факультативных анаэробных конъюнктивальных комменсальных бактерий мышей с использованием уникального глазного мазка и этапа обогащения на основе культуры с последующей идентификацией микробиологическими методами и масс-спектрометрией MALDI-TOF.

Аннотация

Глазная поверхность когда-то считалась иммунной привилегированной и абиотической, но в последнее время кажется, что существует небольшое, но постоянное комменсальное присутствие. Идентификация и мониторинг видов бактерий в слизистой оболочке глаз были сложными из-за их низкой численности и ограниченной доступности соответствующей методологии для комменсального роста и идентификации. Существует два стандартных подхода: культуральные или методы секвенирования ДНК. Первый метод проблематичен из-за ограниченных восстанавливаемых бактерий, а второй подход идентифицирует как живые, так и мертвые бактерии, что приводит к аберрантному представлению глазного пространства. Мы разработали надежный и чувствительный метод бактериальной изоляции, основываясь на стандартных методах микробиологического культивирования. Это метод на основе тампонов, использующий «лабораторный» тонкий тампон, который нацелен на нижнюю конъюнктиву, за которым следует этап амплификации для аэробных и факультативных анаэробных родов. Этот протокол позволил нам выделить и идентифицировать виды конъюнктивы, такие как Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.и т. Д. Этот подход подходит для определения комменсального разнообразия у мышей в различных условиях заболевания.

Введение

Целью этого протокола является усиление специфического выделения жизнеспособных и редких аэробных и факультативных анаэробных микробов из глазной конъюнктивы для характеристики глазного микробиома. Обширные исследования профилировали комменсальные сообщества слизистой оболочки на коже, кишечнике, дыхательных и половых путях и показывают, что эти сообщества влияют на развитие иммунной системы и ответ^1,2,3. Было показано, что глазные комменсальные сообщества изменяются во время некоторых патологий заболевания, таких как болезнь сухого глаза^4,синдром Шегрена⁵ и диабет^6. Тем не менее, способность определять типичную комменсальную общность глазной поверхности затруднена их относительно низким содержанием по сравнению с другими участками слизистой^{оболочки 6,7,8.} Это вызывает споры о том, существует ли резидентный глазной микробиом и если он существует, отличается ли он от микробиома кожи и, следовательно, его местное влияние на развитие и реакцию врожденной иммунной системы. Этот протокол может помочь решить этот вопрос.

Как правило, подходы к определению окулярной комменсальной ниши основаны на методах секвенирования и культуры^4,7,9. 16 Секвенирование S рДНК и анализ BRISK⁷ показывают более широкое разнообразие, чем методы, основанные на культурах, но не могут различать живые и мертвые микробы. Поскольку поверхность глаза враждебна многим микробам из-за антимикробных свойств слезной пленки^4, генерирующих большой массив фрагментов ДНК, подходы, основанные на ДНК, будут обнаруживать эти артефакты, которые могут исказить данные в сторону идентификации мертвых бактерий как резидентных комменсалов, а не загрязняющих веществ. Это приводит к аберрантной комменсальной идентификации и характеристике глазного пространства как более высокого по численности и разнообразию микробов¹⁰. Это затрудняет определение резидентного глазного микробиома с помощью методов на основе ДНК. Принимая во внимание, что стандартные методы, основанные на культуре, не могут обнаружить комменсалы, потому что нагрузка слишком низкая¹¹. Наш метод улучшает стандартную практику, используя тонкий тампон, который может нацеливаться на конъюнктиву, тем самым избегая загрязнения от соседней кожи, а также концепцию, что жизнеспособные организмы могут быть обогащены кратковременной культурой в питательных плотных средах с целью реанимации жизнеспособных, но не культивируемых, а также обогащения редкими жизнеспособными микробами.

Результаты, относительное обилие глазных комменсалов на глазной мазок, характеризуют конъюнктивный резидентный микробиом и важны для сравнительных целей. Наши данные показывают, что существует разница между микробиотой кожи и конъюнктивы, а также большее разнообразие с увеличением возраста и специфической для пола разницей в изобилии. Кроме того, этот подход воспроизводимо обнаружил комменсальные различия у нокаут-мышей^12. Этот протокол может быть применен для описания глазного микробиома, который может варьироваться из-за практики клетки, географии или состояния заболевания, а также местных эффектов комменсальных метаболитов и продуктов на развитие и реакцию иммунной системы.

протокол

Все процедуры с участием мышей соответствуют руководящим принципам Институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Следуйте лабораторным рекомендациям по безопасности (по указанию вашего институционального отдела гигиены и безопасности окружающей среды) при работе с микроорганизмами и потенциально загрязненными материалами. Использовать соответствующие сосуды для отходов и процедуры дезактивации до удаления потенциально биологически опасных загрязненных материалов.

1. Подготовка глазного тампона, настройка рабочего поля, мазок глаз мыши и обогащение образца

1. Подготовьте стерильные глазные тампоны
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные глазные тампоны представляют собой тонко покрытые деревянные зубочистки с тонким волокнистым слоем хлопчатобумажной ватины и изготовленные в домашних условиях.
   1. Автоклав соответствующего количества хлопчатобумажных ватин и зубочисток для количества мышей, которые должны быть промапаны.
   2. Отщипьте кусок хлопчатобумажной ваты длиной в полсантиметра большим и указательным пальцами. Дразните ватин, потянув за края большими и указательными пальцами, чтобы сформировать плоский одиночный пористый слой, останавливаясь непосредственно перед тем, как ватин развалится (допускаются небольшие кусочки хлопка, рассеянные по всему растянутой ватине).
   3. Покрутите ватин вокруг одного из острых концов зубочистки, слегка удерживая растянутый кусок на кончике зубочистки, когда он скручен, см. Рисунок 1. «Завершенный» тампон для глаз будет иметь очень тонкий слой хлопка, натянутый на кончик, простирающийся примерно на половину до одного сантиметра от кончика.
   4. Вставьте «готовые» тампоны в маленький яблочник, смаковейте его стороной вниз и накройте крышкой. автоклав.
2. Настройка рабочей области
   1. Готовят анестезию, содержащую 2 мл кетамина (100 мг/мл), 400 мкл ксилазина (100 мг/мл) и 27,6 мл стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl в dH₂O) в стерильной 50 мл стерильной центрифужной трубке. Фильтр стерилизуют и аликвотную анестезию для немедленного применения (могут храниться при 4 °C в течение 1 месяца; всегда позволяют уравновесить до комнатной температуры перед использованием).
   2. Очистите и очистите рабочую зону дезинфицирующим средством, чтобы свести к минимуму загрязнение.
   3. Aliquot 0,5 мл стерильной мозговой инфузионной среды сердца (BHI) в меченые 1,5 мл стерильных микроцентрифужных пробирок (1 трубка на мышь и контроль); устроить в стойку микроцентрифуги. Установите стойку на лед.
   4. Настройка рабочего потока следующим образом (слева направо): станция анестезии мыши (клетка, содержащая экспериментальных мышей, пустая стерильная клетка, анестезия комнатной температуры, игла 25 Г и шприц 1 мл), станция для мазка глаз (аликвотированный BHI на льду, стерилизованные глазные тампоны, чистые бумажные полотенца, 70% изопропаноловый спрей) и станция покрытия (пластины для агара крови комнатной температуры, пипетка 10 мкл , 10 мкл стерильных одноразовых наконечников, контейнер для отходов биологической безопасности).
3. Мазок глаз
   1. Вводят 10 мкл анестезии на 1 г мышиной массы дозы кетамина и ксилазина соответственно внутрибрюшинно каждой взрослой мыши и помещают в автоклавную клетку. Испытать анестезию путем сдавливания подушечки задней ноги; ни одно движение не указывает на надлежащую анестезию.
   2. Назначьте одну руку, чтобы обрабатывать только анестезированных мышей, а другую руку, чтобы обрабатывать только мазок из глаз и культуру. Для мазка извлеките из клетки полностью обезболенную мышь; поместить поверх чистой рабочей поверхности, расположенной на боку с открытым левым глазом. Распылите на руки в перчатках изопропанол, сухая чистым бумажным полотенцем.
   3. Специально маркированная трубка для микроцентрифуги BHI с специальной рукой для обработки среды. Поместите трубку обратно в стойку микроцентрифуги на льду.  Окуните покрытый ватой кончик глазного тампона в BHI, выньте глазной тампон из трубки, вращая наконечник 2 раза о внутреннюю трубку, чтобы удалить лишнюю жидкость.
   4. Рукой мыши осторожно держите мышь за шею. Другой рукой поместите кончик глазного тампона против медиал-конъюнктивальной области левого глаза, см. Рисунок 2А. Слегка прижмите глазное яблоко и переместите тампон в движении мытья окна(рисунок 2B)вперед и назад, между нижним веком и глазом, 10 раз. Поддерживайте постоянное давление.
   5. Не касаясь меха, аккуратно извлеките кончик тампона, перпендикулярно тому месту, куда он был вставлен, и поместите тампон ватной стороной вниз непосредственно в меченую микроцентрифужную трубку, содержащую жижи BHI. Нанесите смазывающую глазную каплю на смазанный глаз.
   6. Верните мышь в клетку.
   7. Дайте тампону постоять в течение 10-15 минут на льду и удалите глазной тампон стерилизованной рукой в перчатке, перемешав наконечник в среде в течение 10 оборотов. Выньте тампон закручивающимся наконечником о внутреннюю стенку трубки микроцентрифуги на 5 оборотов. Утилизируйте тампон в контейнере для биологической области.
   8. Повторите шаги 1.3.2-1.3.7 для каждой мыши и для контрольных образцов (мазок из кожи или меха). Стерилизуйте перчатки соответствующим образом между каждым тампоном.
4. обогащение
   1. Обогащайте образец путем статической инкубации трубки в течение 1 ч при 37 °C
   2. Во время инкубации маркируют одну триптиказу сои комнатной температуры 5% агаром овечьей крови (пластина TSA) на мышь и делят пополам.
   3. После инкубации посева мазка глаз вынимают обогащенные образцы из инкубатора и помещают на лед.
   4. Кратко вихревые образцы смешать и нанести по схеме на рисунке 3А. Аликвота 10 мкл образца на пластину TSA и наклон пластины для формирования полосы, повторите 2 раза.
   5. С другой стороны разделительной линии пластины, уставьте точку 10 мкл образца на агаров, повторите 9 раз.
   6. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 18 ч, 2 дней и 4 дней (в чистой камере, которая предотвращает высыхание агаровых пластин). Подсчитайте колонии в полосках, обратите внимание на морфологию и рассчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) на мазок для морфологически сходных изолятов. Посмотрите на точки для уникальных организмов, не захваченных в полосках.

2. Главная пластина, характеристика и идентификация глазных микробов

1. Мастер-пластина
   1. Нарисуйте сетки на обратной стороне пластины TSA(рисунок 3B). Выберите колонию со стерильной зубочисткой из каждой пластины для тампона глаз мыши и проведите квадрат (сетки) мастер-пластины, сетку меток с номером колонии и информацию о мыши. Выберите и размахйте три разные колонии для каждой морфологически отличной колонии.
   2. Инкубировать пластину в течение ночи при 37 °C. Продолжайте инкубацию в течение 96 часов, ежедневно проверяя появление новых изолятов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Комменсальная популяция будет варьироваться в зависимости от возраста мыши, питания, состояния болезни и практики ведения в цех. Характеристика изолята основана на преобладающих аэробных и факультативных анаэробных бактериях, обнаруженных в нашей лаборатории.
2. характеристика
   1. Дубликаты¹³ пластинчатых микробов на пластинах Маннитол Соляной Агар (MSA) и МакКонки (MAC), инкубируются в течение ночи при 37 °C. Обратите внимание на рост для каждого изолята и наличие восковых колоний или желтых колоний с ореолом на MSA.
   2. Для грамположительных кокков тест с каталазой^{тест 13,14.} Поместите каплю 3% перекиси водорода на чистую стеклянную горку. Используя стерильную зубочистку, выхватывайте соответствующий микроб из глазной тампоновой пластины. Отсутствие образования пузырьков указывает на Streptococcus spp.,незначительное образование пузырьков указывает на Corynebacterium spp. и, возможно, Aerococcus spp., а быстрое образование пузырьков указывает на Staphylococcus spp.
3. Идентификация: анализ MALDI-TOF MS
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальная идентификация осуществляется с использованием MALDI-TOF и базы данных программного обеспечения. Эта система использует матричную лазерную десорбционную ионизацию масс-спектрометрии времени полета (MALDI-TOF MS) для разработки профилей спектров, которые сравниваются с известными бактериальными спектрами для идентификации. E.coli,ATCC 8739, используется для калибровки системы.
   1. Пластинчатые бактериальные изоляты на пластинах TSA, содержащих 5% овечьей крови, и инкубируют в течение ночи с 5% углекислым газом при 37 °C.
   2. Используя петлю 1 мкл, нанесите тонкий слой чистых бактерий на целевой слайд MALDI-TOF; 1 мкл матричного раствора MALDI-TOF MS CHCA (альфа-циано-4-гидроксициновая кислота) накладывают и дают полностью высохнуть на воздухе перед загрузкой слайда в прибор MALDI-TOF.
   3. Каждый изолят замечен в двух экземплярах.
   4. Отчеты, содержащие оценки вероятности более 80%, которые указывают на высокое значение дискриминации, принимаются как надежные результаты, а бактериальная идентификация принимается.

Результаты

Репрезентативные результаты для глазной тампоновой пластины, демонстрирующие различные методы нанесения покрытия, изображены на рисунке 3A, показывающем морфологически разнообразные изоляты от мыши C57BL/6. Для каждого отдельного изолята колонии были подсчитаны в полос?...

Обсуждение

Из-за пауцибактериального состояния глазной поверхности многие лаборатории испытывали трудности с выделением глазных комменсалов^7,20,что приводило к низкому количеству образцов с ростом, низкой численностью и низким разнообразием^8. Этот ме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each