בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד והגברה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטטיביים של עכבר אנאירובי באמצעות ספוגית עיניים ייחודית וצעד העשרה מבוסס תרבות עם זיהוי עוקב על ידי שיטות מבוססות מיקרוביולוגיות וספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

Abstract

פני העין נחשבו בעבר מיוחסים חיסוניים ואביוטיים, אך לאחרונה נראה כי קיימת נוכחות קומית קטנה אך מתמשכת. זיהוי וניטור של מיני חיידקים ברירית העין היו מאתגרים בשל השפע הנמוך שלהם וזמינות מוגבלת של מתודולוגיה מתאימה לצמיחה וזיהוי commensal. ישנן שתי גישות סטנדרטיות: שיטות מבוססות תרבות או רצף DNA. השיטה הראשונה בעייתית בשל החיידקים המוגבלים הניתנים לשחזור והגישה השנייה מזהה חיידקים חיים ומתים המובילים לייצוג חריג של מרחב העין. פיתחנו שיטה חזקה ורגישה לבידוד חיידקים על ידי בנייה על טכניקות פולחן מיקרוביולוגיות סטנדרטיות. זוהי טכניקה מבוססת ספוגית, תוך שימוש ב"מעבדה" העשויה ספוגית דקה המכוונת ללחמית התחתונה, ואחריה צעד הגברה עבור סוגים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים. פרוטוקול זה אפשר לנו לבודד ולזהות מינים הלחמית כגון קורינבקטריום spp., קוגולאז סטפילוקוקוס שלילי spp., סטרפטוקוקוס spp., וכו '. הגישה מתאימה להגדרת גיוון קומנסלי בעכברים בתנאי מחלה שונים.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לשפר את הבידוד הספציפי של מיקרואורגניזמים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים בני קיימא ונדירים מהלחמית העין כדי לאפיין את המיקרוביום העין. מחקרים מקיפים פרופיל קהילות הרירית commensal על העור, המעיים, דרכי הנשימה ואברי המין ולהראות כי קהילות אלה משפיעים על התפתחות המערכת החיסונית ואת התגובה^1,2,3. קהילות עיניים הוכחו להשתנות במהלך פתולוגיות מחלה מסוימות, כגון מחלת עיניים יבשות⁴, תסמונת סיוגרן⁵ וסוכרת⁶. עם זאת, היכולת להגדיר קהילה טיפוסית של משטח עיני מעוכבת על ידי השפע הנמוך יחסית שלהם בהשוואה לאתרי הרירית האחרים^6,7,8. זה מעורר מחלוקת אם יש מיקרוביום עיני תושב ואם הוא קיים, אם זה שונה מיקרוביום העור וכתוצאה מכך, ההשפעה המקומית שלה על התפתחות מערכת החיסון המולדת ותגובה. פרוטוקול זה יכול לסייע בפתרון שאלה זו.

בדרך כלל, גישות להגדרת הנישה העין commensal מבוססים על רצף וטכניקות מבוססות תרבות^4,7,9. ריצוף 16 S rDNA וניתוח BRISK⁷ מראים מגוון רחב יותר מאשר טכניקות מבוססות תרבות, אך אינם מסוגלים להבחין בין מיקרואורגניזמים חיים למתים. מכיוון שפני השטח העין עוינים למיקרואורגניזמים רבים בשל תכונות אנטי-מיקרוביאליות של סרט דמעה⁴ היוצרים מגוון גדול של שברי דנ"א, גישות מבוססות DNA יזהו את הממצאים הללו אשר עשויים להטות את הנתונים לזיהוי חיידקים מתים כחיידקים מקומיים ולא כמזהמים. התוצאה היא זיהוי ואפיון חריגים של מרחב העין כ גבוה יותר בשפע החיידקים ובמגוון¹⁰. זה מקשה להגדיר את המיקרוביום העין תושב באמצעות שיטות מבוססות DNA. בעוד, טכניקות סטנדרטיות המבוססות על תרבות אינן מסוגלות לזהות commensals כי העומס הוא נמוך מדי¹¹. השיטה שלנו משפרת על פרקטיקות סטנדרטיות באמצעות ספוגית דקה שיכולה למקד את הלחמית, ובכך למנוע זיהום מעור שכן, כמו גם את הרעיון כי אורגניזמים קיימא יכולים להיות מועשרים על ידי תרבות קצרה בתקשורת צפופה מיזינים במטרה להחיות קיימא אך לא culturable, כמו גם, העשרה עבור מיקרואורגניזמים קיימא נדירים.

התוצאות, שפע יחסי של קומנסלים עיניים לכל ספוגית עיניים, מאפיינות את המיקרוביום תושב הלחמית והן חשובות למטרות השוואתיות. הנתונים שלנו מראים כי יש הבדל בין עור מיקרוביוטה הלחמית, כמו גם מגוון גדול יותר עם גיל מוגבר הבדל ספציפי למין בשפע. יתר על כן, גישה זו מצאה באופן שכפול הבדלים commensal בעכברים בנוקאאוט¹². פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לתאר את המיקרוביום העין אשר עשוי להשתנות עקב שיטות caging, גיאוגרפיה, או מצב המחלה, כמו גם את ההשפעות המקומיות של מטבוליטים commensal ומוצרים על התפתחות המערכת החיסונית ותגובה.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים בעכברים פועלים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות במעבדה (בהתאם להנחיות המחלקה לבריאות ובטיחות סביבתית מוסדית) בעת עבודה עם מיקרואורגניזמים וחומרים שעלולים להיות מזוהמים. השתמש בכלי קיבול פסולת מתאימים ונהלי טיהור לפני סילוק חומרים מזוהמים שעלולים להיות מזוהמים ביולוגית.

1. הכנת ספוגית עיניים, הגדרת שדה עבודה, עין העכבר מנגבת והעשרה לדוגמה

1. הכן ספוגיות עיניים סטריליות
   הערה: ספוגיות עיניים סטריליות הן קיסמים מעץ מצופים דק עם שכבה דקה סיבים של כותנה חבטות ועשה בבית.
   1. Autoclave כמות מתאימה של כותנה חבטות קיסמים עבור מספר העכברים להיות מנוכה.
   2. צבוט את חתיכת כותנה באורך חצי סנטימטר עם אגודל ואצבע. להקניט את החבטות על ידי משיכת בקצוות עם אגודלים ואצבעות כדי ליצור שכבה נקבובית אחת שטוחה, לעצור רק לפני החבטות מתפרק (חתיכות קטנות של כותנה מפוזרים לאורך החבטות מתוח מקובלים).
   3. ערבלו את החבטות סביב אחד הקצוות החדים של קיסם השיניים על ידי החזקה קלה של החתיכה המתוחה על קצה קיסם השיניים כשהוא מעוות, ראו איור 1. ספוגית העין "הושלמה" תהיה שכבה דקה מאוד של כותנה נמתח על הקצה, המשתרעת כחצי עד סנטימטר אחד מהקצה.
   4. הכנס ספוגיות "הושלמו" לתוך קסה קטנה, ספוגית בצד למטה לכסות. מובלעת אוטומטית.
2. הגדרת סביבת העבודה
   1. הכן הרדמה המכילה 2 מ"ל קטמין (100 מ"ג / מ"ל), 400 μL של xylazine (100 מ"ג / מ"ל) ו 27.6 מ"ל של מלוחים סטריליים (0.9% NaCl ב dH₂O) בצינור סטרילי 50 mL סטרילי צנטריפוגה. מסנן לעקר ולהרדים aliquot לשימוש מיידי (ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש אחד, תמיד לאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר לפני השימוש).
   2. לנקות ולנקות את אזור העבודה עם חיטוי כדי למזער את הזיהום.
   3. Aliquot 0.5 מ"ל של מדיה סטרילית לב המוח עירוי (BHI) לתוך שכותרתו 1.5 מ"ל סטרילי microcentrifuge צינורות (1 צינור לכל עכבר ושליטה); מסדרים בארון תקשורת מיקרוצנטריפוגה. שים את המדף על קרח.
   4. הגדרת זרימת עבודה כדלקמן (משמאל לימין): תחנת הרדמה לעכבר (כלוב המכיל עכברים ניסיוניים, כלוב סטרילי ריק, הרדמה בטמפרטורת החדר, מחט 25 G ומזרק 1 מ"ל), תחנת ניקוי עיניים (BHI על קרח, ספוגיות עיניים מעוקרות, מגבות נייר נקיות, תרסיס 70% isopropanol) ותחנת ציפוי (צלחות אגר דם בטמפרטורת החדר, 10 μL פיפטה , 10 טיפים חד פעמיים סטריליים μL, מיכל פסולת biohazard).
3. עין ספוגה
   1. לנהל 10 μL של הרדמה לכל 1 גרם של מינון משקל העכבר של קטמין ו xylazine בהתאמה תוך-אופן לכל עכבר בוגר ומניחים לתוך כלוב autoclaved. בדיקת הרדמה על ידי סחיטת כרית אחורית; אין תנועה המצביעה על ההמתה המתאימה.
   2. הקצה יד אחת לטיפול רק בעכברים מורדמת וביד השנייה כדי לטפל רק בספוגית העין ובתרבות. לריב, להסיר את העכבר מורדם לחלוטין מהכלוב; מניחים על משטח עבודה נקי ממוקם על צידו עם עין שמאל חשופה. ריסוס ידיים כפפות עם isopropanol, יבש עם מגבת נייר נקייה.
   3. Uncap במיוחד שכותרתו צינור מיקרו צנטריפוגה BHI עם יד ייעודית לטיפול במדיה. מחזירים את הצינור למדף המיקרו-צנטריפוגות על הקרח.  טובלים את קצה כותנה מצופה של ספוגית העין ב BHI, למשוך את ספוגית העין מן הצינור מסתחרר קצה 2 פעמים נגד הצינור הפנימי כדי להסיר נוזל עודף.
   4. עם יד טיפול העכבר, בעדינות להחזיק את העכבר על ידי עורף הצוואר. מצד שני, הניחו את קצה העין על אזור הלחמית המדיאלי של העין השמאלית, ראו איור 2A. לדכא קלות את גלגל העין ולהזיז את הספוגית בתנועת שטיפת חלונות (איור 2B)קדימה ואחורה, בין העפעף התחתון לעין, 10 פעמים. לשמור על לחץ מתמיד.
   5. מבלי לגעת בפרווה, הסר בעדינות את קצה הספוגית, בניצב למקום שבו הוכנס, והנח את צד הכותנה ספוגית למטה ישירות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שכותרתו המכיל מדיה BHI. יש למרוח טיפת עין משומנת על העין המטונפת.
   6. תחזיר את העכבר לכלוב.
   7. תן את ספוגית לעמוד במשך 10 עד 15 דקות על קרח ולהסיר ספוגית עיניים עם יד כפפות מעוקרות על ידי ערבוב הקצה במדיה במשך 10 סיבובים. משוך את הספוגית על ידי מערבולת קצה על הקיר הפנימי של צינור מיקרו צנטריפוגה עבור 5 סיבובים. להשליך את הספוגית במיכל biohazard.
   8. חזור על שלבים 1.3.2 עד 1.3.7 עבור כל עכבר ועבור דגימות בקרה (ספוגית עור או פרווה). לעקר כפפות כראוי בין כל ספוגית.
4. העשרה
   1. להעשיר את המדגם על ידי דגירה של הצינור סטטי במשך 1 שעה ב 37 °C (69 °F)
   2. במהלך הדגירה, תווית טמפרטורת חדר אחד Trypticase סויה עם 5% צלחת אגר דם כבשים (צלחת TSA) לכל עכבר ולחלק לשניים.
   3. לאחר הדגירה של תרבות ספוגית העיניים, יש להסיר דגימות מועשרות מהחממה ומניחים על הקרח.
   4. דגימות מערבולת לערבב ולצלחת בקצרה לפי השרטוט באיור 3A. Aliquot 10 μL של המדגם על צלחת TSA להטות את הצלחת כדי ליצור רצועה, לחזור 2 פעמים.
   5. בצד השני של קו החלוקה של הצלחת, נקודה 10 μL של מדגם על אגר, לחזור 9 פעמים.
   6. צלחות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות, 2 ימים, ו 4 ימים (בתא נקי המונע צלחות אגר ייבוש). מחוזות מושבות ברצועות, הערה מורפולוגיה ולחשב יחידות יוצרות מושבה (CFUs) לכל ספוגית עבור מבודדים דומים מורפולוגית. תסתכל על נקודות עבור אורגניזמים ייחודיים לא שנתפסו ברצועות.

2. צלחת מאסטר, אפיון וזיהוי של מיקרואורגניזמים עיניים

1. לוח ראשי
   1. ציירו רשתות בגב לוחית TSA (איור 3B). בחר מושבה עם קיסם סטרילי מכל צלחת ספוגית עין העכבר פס ריבוע הלוח הראשי (רשתות), רשת תווית עם מספר המושבה ומידע העכבר. בחר ופלט שלוש מושבות שונות עבור כל מושבה ברורה מורפולוגית.
   2. דגירה את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. המשך דגירה במשך 96 שעות, בדיקת מדי יום עבור המראה של מבודדים חדשים.
      הערה: אוכלוסיית Commensal תשתנה בהתאם לגיל העכבר, תזונה, מצב המחלה ושיטות caging. אפיון מבודד מבוסס על חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים השולטים שנמצאו במעבדה שלנו.
2. איפיון
   1. לשכפל¹³ חיידקים צלחת על מניטול מלח אגר (MSA) ו MacConkey (MAC) צלחות, דגירה לילה ב 37 °C (69 °F). הערה צמיחה עבור כל בידוד ונוכחות של מושבות שעווה או מושבות צהובות עם הילה על MSA.
   2. עבור cocci חיובי גרם, מבחן עם מבחן קטלאז^13,14. מניחים טיפה של 3% מי חמצן על מגלשת זכוכית נקייה. באמצעות קיסם סטרילי, לבחור את החיידק המתאים מצלחת ספוגית העין. אין היווצרות בועה מציין סטרפטוקוקוס spp., היווצרות בועה קלה מצביעה על Corynebacterium spp. ואולי Aerococcus spp. היווצרות בועה מהירה מציין סטפילוקוקוס spp.
3. זיהוי: ניתוח MS של MALDI-TOF
   הערה: זיהויים חיידקיים מתבצעים באמצעות MALDI-TOF ומסד הנתונים של התוכנה. מערכת זו משתמשת בינון ינון לינון בלייזר בסיוע מטריצה של ספקטרומטריית מסת טיסה (MALDI-TOF MS) לפיתוח פרופילי ספקטרום אשר מושווים לספקטרום חיידקי ידוע לזיהוי. E.coli, ATCC 8739, משמש לכיול המערכת.
   1. חיידקי צלחת מבודדים על לוחות TSA המכילים 5% דם כבשים ודגרת לילה עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. באמצעות לולאת μL 1, להחיל שכבה דקה של החיידקים הטהורים על שקופית היעד MALDI-TOF; 1 μL של MALDI-TOF MS CHCA פתרון מטריקס (חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית) מכוסה ומורשה להתייבש באוויר לחלוטין לפני טעינת השקופית לתוך מכשיר MALDI-TOF.
   3. כל מבודד מזוהה בכפילות.
   4. דוחות המכילים ציוני הסתברות העולים על 80%, המצביעים על ערך אפליה גבוה, מתקבלים כתוצאות מהימנות והזיהוי החיידקי מתקבל.

תוצאות

תוצאות מייצגות של לוחית ספוגית עיניים המדגימות שיטות שונות לציפוי מוצגות באיור 3A ומציגות מבודדים מגוונים מבחינה מורפולוגית מעכבר C57BL/6. עבור כל איזולט מובהק, המושבות נספרו ברצועה והשפע היחסי, יחידות יוצרות מושבה ייחודיות (CFUs) לכל ספוגית עיניים, מחושבות ומותוות למטרות השוו?...

Discussion

בשל המצב paucibacterial של פני השטח העין, מעבדות רבות התקשו לבודד commensals עינית^7,20, וכתוצאה מכך מספר נמוך של דגימות עם צמיחה, שפע נמוך ומגוון נמוך⁸. שיטה זו משפרת באופן משמעותי על פרקטיקות תרבות סטנדרטיות^4,21 על ידי תוספת של ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each