Análisis de seguimiento de nanopartículas de nanopartículas de oro en medios acuosos a través de una comparación entre laboratorios

Resumen

El protocolo descrito aquí tiene como objetivo medir el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas esféricas, más específicamente las nanopartículas de oro, en medios acuosos mediante el Análisis de Seguimiento de Nanopartículas (NTA). Este último consiste en rastrear el movimiento de las partículas debido al movimiento browniano e implementar la ecuación Stokes-Einstein para obtener el diámetro hidrodinámico.

Resumen

En el campo de la nanotecnología, la caracterización analítica desempeña un papel vital en la comprensión del comportamiento y la toxicidad de los nanomateriales (NMs). La caracterización debe ser exhaustiva y la técnica elegida debe ser adecuada para la propiedad a determinar, el material que se está analizando y el medio en el que está presente. Además, el funcionamiento del instrumento y la metodología deben ser bien desarrollados y claramente comprendidos por el usuario para evitar errores de recopilación de datos. Cualquier discrepancia en el método o procedimiento aplicado puede dar lugar a diferencias y mala reproducibilidad de los datos obtenidos. Este documento tiene como objetivo aclarar el método para medir el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas de oro mediante el Análisis de Seguimiento de Nanopartículas (NTA). Este estudio se llevó a cabo como una comparación entre laboratorios (ILC) entre siete laboratorios diferentes para validar el rendimiento y la reproducibilidad del procedimiento operativo estándar. Los resultados obtenidos de este estudio de ILC revelan la importancia y los beneficios de los procedimientos operativos estándar detallados (SOP), las actualizaciones de mejores prácticas, el conocimiento del usuario y la automatización de mediciones.

Introducción

Los nanomateriales (NMs) pueden variar tanto en características físicas como químicas que a su vez influyen en su comportamiento, estabilidad y toxicidad^1,2,3,4,5. Una de las principales dificultades, al desarrollar una comprensión exhaustiva de las propiedades, peligros y comportamientos de NM, es la capacidad de obtener información reproducible sobre características nanomateriales físicas y químicas. Ejemplos de estas propiedades físicas incluyen tamaño de partícula y distribución de tamaño^6,7,8. Se trata de parámetros importantes, ya que son un aspecto clave de la definición de la Comisión Europea (CE) del término «nano»^9.

Lograr mediciones precisas del tamaño de las partículas también es fundamental para muchas aplicaciones y procesos industriales y de investigación diferentes, además de comprender el destino y los efectos de toxicidad de los NMs^6,10. Es importante tener métodos bien establecidos capaces de medir con precisión, fiabilidad y reproduciblemente el tamaño de los NMs. Además, la información notificada debe proporcionar una comprensión profunda de la técnica utilizada, por ejemplo, indicar el parámetro de tipo de tamaño (por ejemplo, tamaño real o tamaño hidrodinámico), así como la condición de la muestra, por ejemplo, el medio específico en el que está presente el NM y que el método funcione de forma fiable en diferentes medios. Con el fin de medir el tamaño, se pueden utilizar una serie de técnicas, incluyendo microscopía electrónica (EM), dispersión dinámica de luz (DLS), espectrometría de masa plasmática de una sola partícula inductivamente acoplada (SPICP-MS), sedimentación centrífuga diferencial (DCS), microscopía de sonda de barrido (SPM), dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).

NTA es una tecnología relativamente nueva que ha sido muy avanzada en los últimos años y se ha demostrado que mide de forma fiable el diámetro hidrodinámico de los NMs esféricos en medios acuosos complejos como aquellos con relevancia ambiental, por ejemplo, sistemas de agua dulce. El diámetro hidrodinámico es «del tamaño de una hipotética esfera dura que se difunde de la misma manera que la de la partícula que se mide»^11; en términos prácticos y en medios acuosos esto describe un diámetro mayor que el de la propia partícula, que también incluye una capa de moléculas (principalmente agua) sostenidas en la superficie de la partícula por fuerzas electrostáticas débiles. El diámetro hidrodinámico de una partícula variará en diferentes medios, haciéndose más pequeño a medida que la fuerza iónica del medio en el que se mide se eleva.

Una característica adicional importante de la técnica NTA es que permite al analista lograr mediciones de tamaño ponderado por números, que son necesarias en el contexto de la definición de nanomaterial ce. El análisis de partículas por partículas de alta resolución hace que esta técnica sea menos propensa a interferencias causadas por aglomerados o partículas más grandes cuando está presente en una muestra de prueba heterogénea con una alta tasa de rendimiento de partículas^10,12.

El procedimiento de medición consiste en preparar una suspensión adecuada de la muestra, que a menudo requiere dilución de la muestra, seguida de la grabación de vídeo del comportamiento del movimiento browniano de las partículas y el análisis de vídeo. Desde la cámara de muestra, se pasa un rayo láser, y las partículas de suspensión en el camino del rayo láser dispersan la luz que conduce a su visualización utilizando un microscopio óptico con una cámara montada. La cámara captura un archivo de vídeo de la luz láser dispersa de las partículas que se mueven bajo el movimiento browniano. Muchas partículas se pueden rastrear individualmente para determinar sus coeficientes de difusión y sus diámetros hidrodinámicos se pueden calcular utilizando la ecuación Stokes-Einstein: d = kT/3πεD donde d es el diámetro hidrodinámico, k es la constante Boltzmann, T es la temperatura, η es la viscosidad y D es el coeficiente de difusión¹⁰. NTA también se puede utilizar para realizar un seguimiento del comportamiento de agregación de partículas que son generalmente coloidalmente inestables (las partículas deben, sin embargo, ser coloidalmente estables en la escala de tiempo de medición)^13,14. NTA es un método absoluto y no se requiere calibración del sistema en el instrumento utilizado en este trabajo. Si los usuarios quieren comprobar el rendimiento del sistema, esto se puede hacer fácilmente midiendo los materiales estándar de tamaño con la frecuencia que desee.

El instrumento NTA es fácil de operar con un tiempo de análisis rápido (menos de 10 minutos por muestra). Para mediciones de alta calidad con buena repetibilidad de datos y reproducibilidad, se deben considerar una serie de factores tanto en la preparación de muestras como en el funcionamiento del instrumento. Si estos factores no se consideran cuidadosamente, las mediciones del mismo material en diferentes laboratorios y operadores pueden estar sujetas a incertidumbres desconocidas o mal cuantificadas. Durante la caracterización np, el uso de las mejores prácticas en los SOP desarrollados internamente no siempre garantiza la coherencia con otros laboratorios, como se muestra por Roebben et al. para la técnica DLS¹⁵.

De hecho, una ILC NTA temprana (primera ronda) entre diferentes laboratorios, usuarios e instrumentos reveló resultados inconsistentes. Una de las principales cuestiones fue el uso de varios instrumentos heredados antiguos que no habían tenido servicios regulares o controles de calibración, así como diferencias en la interpretación del método. Un estudio de NTA ILC realizado por Hole et al. encontró que con la ausencia de directrices compartidas sobre cómo utilizar un sistema y preparar muestras, la variabilidad entre laboratorios puede ser grande incluso para muestras relativamente monodispersadas^16. Esto junto con los resultados de la primera ronda de la CIT pone de relieve la necesidad de un buen mantenimiento de los instrumentos, así como la capacitación en métodos y los procedimientos operativos estándar (SOP) bien desarrollados. Estos últimos actúan como una poderosa herramienta para describir y documentar el cumplimiento de las buenas prácticas. Si está bien detallado, los procedimientos operativos estándar (SOP) pueden ofrecer claridad, explicación, comprensión, estandarización y garantía de calidad.

Por lo tanto, la recomendación de adoptar un estudio de ILC es ideal tanto para el desarrollo como para los protocolos de ensayo^16. El ejercicio de la CIT actuó para validar este SOP específico de la NTA y, por lo tanto, introdujo confianza y claridad en este método específico de evaluación del riesgo de nanomateriales. Se trataba de tres balas. La Ronda 1 analizó nanopartículas de oro de 60 nm en los propios instrumentos de cada participante antes del entrenamiento. La ronda 2 implicó analizar el látex de 100 nm utilizando un nuevo instrumento con una configuración común como una prueba simple con el fin de determinar que el instrumento se estableció correctamente y los usuarios tenían un buen conocimiento sobre cómo utilizar el instrumento. La ronda 3 implicó el análisis de nanopartículas de oro de 60 nm en el nuevo instrumento con configuración común, después del entrenamiento. Los participantes en la ILC procedían de siete laboratorios diferentes, todos ellos miembros del consorcio horizonte 2020 ACEnano proyecto¹⁷.

El objetivo de este artículo es discutir el método y los resultados de una tercera ronda de benchmarking para la tecnología NTA donde los NPs de oro de 60 nm fueron reexamenados por siete socios después de una formación detallada y el desarrollo de SOP. También se hará una comparación y referencia a los resultados obtenidos en la primera ronda del ILC. Todos los análisis de la ronda 3 de ILC se llevaron a cabo utilizando el mismo instrumento (véase Tabla de materiales)de idéntica configuración suministrado con un láser de 405 nm y una cámara sCMOS de alta sensibilidad. Benchmarking evalúa el rendimiento de la tecnología en muestras y, por lo tanto, conduce al desarrollo de protocolos de "mejores prácticas". Por lo tanto, este artículo también comparte y pone a disposición de la comunidad científica el método NTA para el instrumento utilizado en este CIT, ya que se ha armonizado mediante la realización y evaluación de las CCI de acuerdo con las normas internacionales.

Protocolo

La metodología descrita aquí se utilizó para la tercera ronda de las comparaciones entre laboratorios.

1. Preparación de muestras

1. Filtre el agua a través de un filtro de jeringa de 0,02 μm. La filtración de agua es necesaria para eliminar cualquier partícula de contaminación antes de usarla para la dilución de la muestra.
2. Para analizar una muestra recién preparada, diluya una muestra de dispersión coloide de oro de 60 nm volumétricamente por un factor de 50 en agua ultrapura filtrada. La concentración sugerida para el análisis de la NTA es de 1 x 10⁷ – 1 x 10⁹ partículas por ml.

2. Realizar la medición

1. Encender el sistema
   1. Conecte el instrumento NTA, la bomba de jeringa y el ordenador. Encienda el hardware y el software. El software asociado (consulte Tabla de materiales)garantiza que todas las comunicaciones de hardware se estén ejecutando y que se muestre una lectura de temperatura en vivo.
   2. Retire el módulo láser de la NTA y utilizando un tejido y aire comprimido sequen completamente las superficies de vidrio y los canales internos de celda de flujo de bajo volumen (LVFC), tubos y puertos fluidos.
2. Cebado del tubo
   1. Enjuague el tubo fluido de entrada con agua ultrapura para eliminar cualquier partícula y reducir la probabilidad de burbujas de aire que interfieran con las mediciones. Para el enjuague, el extremo del tubo de entrada dentro de la carcasa del instrumento se coloca en un recipiente de residuos.
   2. Inserte una jeringa de 1 ml (sin aguja) de agua filtrada en el puerto luer y empuje ~900 μL de líquido a través del tubo de entrada tan rápido como la presión posterior lo permita. Deje la jeringa que contiene el líquido restante unido para evitar cualquier sifón.
3. Conexión de tubo de bomba de jeringa
   1. Monte el LVFC en el módulo láser para crear la cámara de muestra como se ve en el cuadro 1. Conecte el tubo de salida al puerto lateral derecho del LVFC.
      NOTA: El tubo de entrada y salida tiene diferentes diámetros, siendo la entrada de diámetro menor que la salida. El intercambio de la conexión de tubo de entrada y salida puede provocar una sobrepase de la celda de flujo y fugas.
   2. Desconecte la jeringa del tubo de entrada e intercambie una nueva jeringa que contenga 1 ml de agua filtrada, lo que garantiza el contacto líquido-líquido. Conecte el tubo de entrada al puerto izquierdo del LVFC. Introduzca lentamente ~500 μL de líquido en la cámara de la muestra. Asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire durante la carga. La configuración final del tubo se muestra en el cuadro 2.

Figura 1: Montaje de celda de flujo de bajo volumen montado en el módulo láser. 

Figura 2: Configuración de tubos de celda de flujo de bajo volumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Carga del módulo láser y comprobación del sistema
   1. Inserte el módulo láser con el LVFC lleno de agua en el instrumento y bloquee en su lugar.
   2. Coloque la jeringa en la base de la bomba de jeringa y asegure. Inicialice la cámara haciendo clic en Iniciar cámara en la interfaz de software. En la pestaña Hardware de la interfaz, haga clic en Scatter para mover la posición de referencia.
   3. Ajuste el nivel de la cámara a 16 y ajuste el enfoque manualmente para comprobar el diluyente en busca de partículas. Ajuste la posición del campo de visión haciendo clic izquierdo en la ventana principal de visualización y utilizando el ratón para arrastrar hacia arriba y hacia abajo para comprobar si hay partículas. Si hay más de tres partículas en el campo de visión, esto implica un problema con la pureza del agua o el proceso de limpieza y, por lo tanto, el proceso de limpieza debe repetirse o el agua necesita ser reemplazada o filtrada.
   4. Retire el módulo láser del instrumento.
   5. Desconecte la jeringa del tubo de entrada y reemplácela únicamente por una jeringa llena de aire. Introduzca lentamente el aire en la cámara de muestra para extraer el líquido en su interior. Retire el LVFC del módulo láser y desconecte los tubos. Limpie las superficies de vidrio del LVFC y el vidrio óptico del módulo láser con agua y séquelas con un tejido y aire comprimido. Seque el tubo con aire comprimido. Vuelva a montar el LVFC en el módulo láser y conecte el tubo, listo para la carga de muestras.
      NOTA: Este paso no siempre es necesario, sin embargo, en este caso se agregó como una precaución adicional para reducir aún más cualquier posible variación.
5. Ejemplo de carga
   1. Repita el paso 2.2.2. Conecte una jeringa que contenga 1 ml de la dispersión de nanopartículas de oro de 60 nm realizada en el paso 1.1 al puerto Luer. Inyecte lentamente 750 μL de la muestra en el LVFC a través del tubo de entrada con el módulo láser visto fuera del instrumento para asegurarse de que no se introducen burbujas.
   2. Vuelva a cargar el módulo láser hasta el instrumento NTA e inicialice la cámara haciendo clic en Iniciar cámara en la interfaz de software. En la pestaña Hardware de la interfaz, haga clic en Scatter para desplazarse a la posición de enfoque de referencia, compruebe que está configurado correctamente para dar una imagen clara de las partículas.
   3. Compruebe que el campo de visión esté configurado de forma centralizada con respecto a la posición del rayo láser. Ajuste en consecuencia haciendo clic izquierdo en la ventana de visualización principal del software y el ratón arrastrando hacia arriba y hacia abajo.
   4. Ejecute la función AutoSetup para optimizar automáticamente el enfoque y el nivel de cámara, lo que garantiza que se alcance la calidad de imagen óptima.
      NOTA: La cámara automática y los parámetros de enfoque permiten una mayor consistencia entre los diferentes laboratorios, ya que se trata de un usuario independiente.
6. Análisis de muestras
   1. Cree un script de medición en medición estándar,pestaña SOP, para obtener 5 vídeos repetidos de 60 s bajo lento (las partículas deben pasar de un lado de la pantalla al otro en aproximadamente 10 s) y flujo constante(Archivo suplementario 1).
      NOTA: Se recomienda el flujo para garantizar una mejor representación de la muestra general para la medición. La precisión y la repetibilidad de las mediciones de concentración se mejoran significativamente cuando se imparte un flujo lento en la muestra para garantizar que un mayor número de nuevas partículas fluyan a través de la zona de medición y se analicen durante un experimento. La longitud del vídeo depende de la distribución del perfil y de la variable que sea a lo largo del tiempo de análisis. 5 vídeos de 60 s se consideran como una duración de medición típica.
   2. Establezca el nombre y la ubicación del archivo de experimento para los datos e inicie la ejecución. El análisis posterior al procedimiento descrito fue realizado por los siete laboratorios del proyecto Horizonte 2020 ACEnano^17.

3. Análisis de datos

NOTA: Todo el análisis de datos se realizó dentro del software v 3.4 (consulte Tabla de materiales),no se utilizan conversiones o cálculos manuales adicionales. Los datos de tamaño de partículas se presentan en forma cruda como una distribución de histograma y se calcula a partir del cambio medido en la posición de la partícula utilizando la ecuación Stokes-Einstein. El software determina la distancia media movida por cada partícula en los planos x e y. Este valor permite determinar el coeficiente de difusión de partículas (D) a partir del cual, si se conoce la temperatura de la muestra T y la viscosidad del disolvente η, se puede calcular el radio hidrodinámico esférico equivalente, R_H,de las partículas. La temperatura de la muestra es registrada automáticamente por la NTA. La viscosidad de muestra predeterminada utilizada por el software es para el agua y se incluye en el script de medición mostrado anteriormente, aunque la viscosidad puede ser modificada por el usuario cuando se utilizan diferentes diluyentes de muestra, ya sea antes o después de tomar la medición.

1. Establezca el umbral de detección (DT) arrastrando la barra deslizante o haciendo clic en los botones + y - del software en Umbral de detección,que es el parámetro de análisis para un seguimiento óptimo de las partículas visualizadas, entre 2 y 20. Asegúrese de que el valor DT elegido identifique y realice un seguimiento de tantas partículas visibles como sea posible (marcada automáticamente como cruces rojas en la pantalla de imagen de software).
   1. Como orientación para establecer el umbral de detección, el número de partículas identificadas en una imagen debe estar en el rango de aproximadamente 30-80 donde no más de 10 cruces rojas deben corresponder a sitios no considerados partículas por el observador. No debe observarse más de 5 cruces azules (indicativos de ruido).

Figura 3: Observaciones de ajuste de umbral. Una mala (izquierda) y una buena observación del umbral de detección (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Procese automáticamente los vídeos de análisis de seguimiento de partículas pulsando el botón Procesar del software. Deje todos los parámetros de procesamiento establecidos en automático y exporte los datos como un archivo de resultados de formato .csv con la distribución completa del tamaño de partícula y metadatos adicionales que describen la configuración de medición. Para verificar la calidad de la medición, consulte la pestaña Analizar del software o compruebe el .csv archivo de salida para ver cualquier mensaje o alerta de advertencia. Un ejemplo del informe de resultados pdf se muestra en el archivo complementario 2.
3. Lea los resultados del tamaño del modo y la desviación estándar asociada del informe PDF.
   NOTA: Los resultados del tamaño del modo se utilizaron para comparar los tamaños obtenidos entre los siete laboratorios y se muestran y discuten en la Sección 5.

4. Limpieza y secado

1. Después de su uso, enjuague el sistema a fondo con agua limpia para eliminar todos los rastros de la muestra de las superficies de tubos y ópticas. La eficacia de la limpieza se puede controlar mediante la observación de la cantidad de partículas en el campo de visión.
2. Retire el módulo láser del instrumento NTA.
3. Cargue una jeringa de aire a través del sistema para vaciar el tubo y el LVFC.

Resultados

Los resultados del ILC de la ronda 1 utilizando varias configuraciones del instrumento NTA se muestran en el cuadro 4. Con la excepción del laboratorio 6, la repetibilidad entre las repeticiones de captura 5 fue buena, pero varios laboratorios registraron un tamaño de modo mayor de lo esperado. Los resultados del laboratorio 6 mostraron una repetibilidad deficiente y un tamaño de modo mucho mayor medido. Después de la investigación, se encontró que los sistemas que reportaban variaciones de mayor tamaño no se mantuvieron como se recomendó o el análisis se vio afectado por la inconsistencia en la preparación de la muestra por la cual el paso de dilución puede crear variaciones causadas por diferentes equipos de pipeteo, operación y técnica del usuario, y / o la configuración de la medición incluyendo la célula de flujo no está siendo limpia, el nivel de cámara incorrecto que se utiliza, la imagen no se centra correctamente, y establecer el umbral de detección de análisis incorrectamente.

Figura 4: Resultados del tamaño del modo de la ronda 1 del ILC. El tamaño del modo es el resultado de todos los socios de benchmarking de NTA para la dispersión de nanopartículas de oro redonda de 1 60 nm llevada a cabo en diferentes instrumentos NTA (como abreviado en el eje x).

La precisión del resultado de la NTA de la Ronda 3 fue mejorada por todos los laboratorios que implementan los mismos ajustes de SOP e instrumentos. Los resultados del tamaño del modo obtenidos para esta ronda 3 del ILC se pueden ver en el cuadro 5. El modo promedio en todos los laboratorios fue de 62,02 ± 1,97 nm. Todos los resultados medidos de la Ronda 3 fueron más consistentes que los resultados de la primera etapa, con los resultados dentro del 10% del tamaño medio de 60,5 nm para el lote, según lo indicado por el fabricante. El coeficiente de variación de las muestras de oro indicadas por el fabricante fue ≤8%.

Figura 5: Resultados del tamaño del modo ILC Round 3. El tamaño del modo es el resultado de todos los socios de benchmarking NTA para 60 nm de oro ILC Ronda 3 analizado en el mismo instrumento NTA. El modo promedio en todos los laboratorios fue de 62,02 ± 1,97 nm.

Para verificar el tamaño de las partículas, según lo proporcionado por el fabricante, un pequeño número (N=82) de partículas fueron analizados por Transmission Electron Microscopy (TEM). Aproximadamente 10 μl de la dispersión sin diluir fue arrojada sobre una rejilla Cu TEM recubierta de carbono y se secó en el aire antes de tomar imágenes en un TEM analítico a 200 kV. Imágenes como la Figura Suplementaria 1 se tomaron de áreas con una superposición mínima de partículas y se analizaron mediante un proceso de análisis de imágenes semiautomáticos. Se aplicó un método automático de cuenca hidrográfica a partículas y artefactos separados de este proceso, así como a las partículas de borde^18. El diámetro medio se calculó como promedio del eje mayor y menor (61 ± 7 nm) o como una conversión del área medida (62 ± 6 nm) asumiendo partículas esféricas. Las partículas parecen ser en su mayoría esféricas con una relación de aspecto promedio de 1,1. Los resultados de TEM muestran un diámetro ligeramente mayor que el valor del fabricante (60,5 nm), pero están dentro del nivel de tolerancia. Además, existe un muy buen acuerdo con el valor derivado de la NTA del diámetro hidrodinámico.

Figura suplementaria 1: Imagen TEM de nanopartículas de oro de 60 nm. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Archivo complementario 1: Script de medición. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Ejemplo del informe de resultados pdf. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los resultados incoherentes obtenidos de la CIT de la Ronda 1 destacaron la necesidad de controles de salud de instrumentos para sistemas más antiguos, así como el desarrollo de un SOP más detallado, la necesidad de capacitación práctica y una mejor comprensión de los ajustes de medición y análisis a fin de garantizar resultados más consistentes en los diferentes laboratorios. De hecho, Hole et al. constató que la ausencia de directrices compartidas sobre cómo utilizar un sistema NTA y preparar muestras dio lugar a variabilidad en todos los laboratorios, incluso para muestras relativamente monodispersadas^16. Por lo tanto, todos los participantes de ILC asistieron a un taller de capacitación que cubre las mejores prácticas para el funcionamiento del sistema y las condiciones de medición, así como orientación de limpieza y mantenimiento para el instrumento específico de la NTA. Todos los participantes también realizaron mediciones en el mismo instrumento en sus propios laboratorios para las rondas posteriores de ILC. El procedimiento involucró primero una ronda que probó el sistema localmente en cada laboratorio mediante la ejecución de un ILC en muestras estándar de látex (ILC Ronda 2), antes de ser utilizado por los socios para repetir las mediciones de oro (ILC Ronda 3). El objetivo de medir estas muestras de oro mediante NTA era introducir confianza y claridad en los métodos y prácticas de evaluación del riesgo de nanomateriales necesarios para afectar a los protocolos de orientación sobre nanoseguridad.

NTA es una técnica que puede medir el diámetro equivalente hidrodinámico de las partículas y se puede utilizar para el análisis visual partícula por partícula en tiempo real de sistemas polidispersados que van desde 10 nm – 50 nm, hasta aproximadamente 1000 nm de tamaño (dependiendo de las propiedades de la muestra y la configuración del instrumento). Se requiere una preparación mínima de la muestra. A pesar de la mínima preparación de la muestra, este paso es fundamental para el protocolo y se debe tener mucho cuidado al diluir una muestra y elegir un diluyente. La forma puede ser un factor limitante con respecto a la NTA a medida que se obtienen mediciones de tamaño equivalente esférico y las partículas no esféricas tendrán un valor de tamaño menos preciso.

Para la tecnología NTA, siempre es de esperar alguna variación de resultados, ya que solo se observa una muestra representativa de toda la muestra. A pesar de todo, todos los resultados cumplen con el estándar ISO 19430 para el dimensionamiento de partículas. La concentración óptima a proporcionar es típicamente alrededor de 10⁸ partículas/ml dentro de un tiempo de análisis de 30-60 segundos. Para las muestras con concentraciones de partículas más bajas, se requerirán tiempos de análisis más largos para garantizar resultados reproducibles. Para las muestras que contienen una concentración de partículas superiores a 10⁹ partículas/ml, existe una mayor probabilidad de problemas de seguimiento y las muestras deberán diluirse a un rango adecuado para la medición de la NTA.

En general, los resultados de la ILC redonda de 3^rd muestran una buena reproducibilidad de las mediciones de nanopartículas de oro con NTA con mayor precisión y repetibilidad. Todas las mediciones de NTA se llevaron a cabo utilizando el nivel automático de la cámara y los ajustes de enfoque para ajustar la imagen, según lo seleccionado por la función de configuración automática en el software. El nivel de cámara establecido por el software era muy consistente, con un nivel de cámara de 10 u 11 que se establece en todos los casos que muestra que, como se esperaba, más automatización incluye un proceso, más consistencia se logra. Los resultados del tamaño fueron comparables a los obtenidos por el fabricante a través de TEM indicando que los resultados eran reproducibles, sin embargo, se esperan diferencias mínimas de diferentes técnicas ya que TEM no determina el diámetro hidrodinámico. La mejora significativa en la consistencia de los resultados muestra la importancia y los beneficios del mantenimiento de los instrumentos, sops detallados, actualizaciones de mejores prácticas, conocimiento del usuario y automatización de medición aplicada para NTA. En conclusión, la CIT validó este SOP específico de la NTA y, por lo tanto, introdujo confianza y claridad en este método específico de evaluación del riesgo de nanomateriales.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 nm gold colloid dispersion	BBI Solutions OEM Ltd.	Product EM. GC60, Batch number 024650
0.02 µm syringe filter - Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters	Sigma Aldrich	WHA68092102
NanoSight	Malvern Panalytical Ltd.	NS300
NanoSight NTA Software v3.4	Malvern Panalytical Ltd.	v3.4
Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile	Sigma Aldrich	Z230723