Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

Resumen

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

Resumen

Los rasgos únicos de los insectos eusociales, como el comportamiento social y la división reproductiva del trabajo, están controlados por su sistema genético. Para abordar cómo los genes regulan los rasgos sociales, hemos desarrollado hormigas mutantes a través de la entrega del complejo CRISPR en embriones jóvenes durante su etapa sincitial. Aquí, proporcionamos un protocolo de mutagénesis mediada por CRISPR en Harpegnathos saltator, una especie de hormiga ponerina que muestra una sorprendente plasticidad fenotípica. Las hormigas H. saltator se crían fácilmente en un entorno de laboratorio. Los embriones se recogen para microinyección con proteínas Cas9 y se sintetizan in vitro pequeños ARN guía (sgRNAs) utilizando agujas de cuarzo caseras. Los embriones posteriores a la inyección se crían fuera de la colonia. Después de la aparición de la primera larva, todos los embriones y larvas son transportados a una caja nido con unas pocas obreras lactantes para su posterior desarrollo. Este protocolo es adecuado para inducir mutagénesis para el análisis de la fisiología específica de casta y el comportamiento social en hormigas, pero también se puede aplicar a un espectro más amplio de himenópteros y otros insectos.

Introducción

La evolución de la eusocialidad en insectos, a saber, los de los órdenes Hymenoptera y Blattodea (anteriormente Isoptera), ha dado lugar a rasgos de comportamiento únicos y a menudo sofisticados que se manifiestan tanto a nivel individual como de colonia. La división reproductiva del trabajo, un rasgo que caracteriza a los grupos más avanzados de insectos sociales, a menudo involucra sistemas de castas compuestos por varios grupos conductuales y a menudo morfológicamente distintivos. Tal diversidad conductual y morfológica entre castas está controlada no sólo por su sistema genético, sino también a menudo por el medio ambiente 1,2,3,4^, lo que hace que los insectos eusociales sean sujetos atractivos para la investigación genética y epigenética.

La capacidad de manipular el sistema genético de los insectos eusociales ha demostrado ser un desafío, ya que muchas especies no se aparean y se reproducen en entornos de laboratorio. La mayoría de los insectos eusociales también tienen muy pocos individuos reproductores en una colonia, lo que limita el número de crías que se pueden producir y, en consecuencia, limita el tamaño de la muestra para la manipulación genética⁵. Además, muchos insectos eusociales tienen largos tiempos de generación en comparación con los insectos comúnmente utilizados para estudios genéticos (como Drosophila), lo que aumenta la dificultad de establecer líneas genéticas⁵. Algunas especies eusociales, sin embargo, pueden generar una gran proporción de individuos reproductivamente activos en una colonia, lo que alivia los desafíos y brinda oportunidades para establecer líneas mutantes o transgénicas.

En el caso de la especie de hormiga ponerina, Harpegnathos saltator, todas las obreras pueden volverse reproductivamente activas tras la muerte de una reina o el aislamiento social. Estas obreras se conocen como "gamergates" y pueden ser utilizadas para generar nuevas colonias⁶. Además, puede haber más de una gamergate presente en una colonia, aumentando así la producción de descendencia ^5,7,8. Hasta ahora, se han desarrollado líneas mutantes y/o transgénicas en la abeja melífera europea, Apis mellifera, y en las especies de hormigas, H. saltator, Ooceraea biroi y Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Los análisis genéticos en abejas y hormigas sociales han allanado el camino hacia una mejor comprensión de la eusocialidad, proporcionando una serie de oportunidades para estudiar los genes y sus impactos en el comportamiento de los insectos eusociales y la fisiología específica de la casta.

Aquí, proporcionamos un protocolo para la modificación genética a través del sistema CRISPR / Cas9 en H. saltator. Específicamente, esta técnica se utilizó para generar una mutación de la línea germinal en orco, el gen que codifica el correceptor obligado de todos los receptores odoríferos (OR)¹⁰. Los genes OR se han expandido notablemente en los insectos eusociales himenópteros¹⁶, y el orco desempeña un papel esencial en el olfato de los insectos; en su ausencia, las RUP no se ensamblan ni funcionan normalmente. Por lo tanto, las mutaciones del gen orco interrumpen la sensación olfativa, el desarrollo neuronal y los comportamientos sociales asociados ^9,10.

En este protocolo, las proteínas Cas9 y los ARN guía pequeños (sgRNA) se introducen en embriones de hormigas mediante microinyección con el fin de inducir la mutagénesis de un gen diana. Aquí, describiremos el procedimiento de microinyección en detalle junto con instrucciones sobre el cuidado de colonias y embriones inyectados. Estos métodos son apropiados para inducir mutagénesis en una variedad de genes diferentes en hormigas H. saltator y pueden aplicarse a un espectro más amplio de insectos himenópteros.

Protocolo

1. Mantenimiento regular de las colonias de saltator de Harpegnathos

1. Mantener colonias silvestres de H. saltator en cajas de plástico transparente en una sala de cría de hormigas a 22-25 °C y un fotoperiodo de 12 horas de luz: 12 horas de iluminación oscura (12L:12D).
   1. Use cajas pequeñas (9.5 x 9.5 cm²) para criar obreras individuales o colonias pequeñas. Use cajas medianas (19 x 13.5 cm 2) o cajas grandes (27 x 19 cm²) para criar colonias más grandes (Figura 1).
   2. Para crear cajas nido, use yeso para hacer pisos para las cajas. A medida que el yeso húmedo se seca en las cajas medianas y grandes, presione un bloque de espuma en el yeso a unos pocos centímetros de profundidad y unos centímetros de la parte posterior de la caja para designar una región de nido inferior. Una vez que el yeso se haya secado, cubra la región designada del nido con una pieza cuadrada de vidrio.
      NOTA: En cajas pequeñas, no es necesario designar una región de nido inferior. Si las hormigas descuidan usar la región designada del nido inferior, puede ayudar cubrir el vaso con una pieza cuadrada de celofán rojo. Esto da la impresión de un espacio subterráneo oscuro que se asemeja a los nidos que H. saltator usa en la naturaleza y puede alentarlos a mover su cría a la región designada.
2. Alimente a las colonias con grillos vivos dos veces por semana.
   NOTA: Las colonias deben ser alimentadas lo suficiente como para consumir todos los grillos antes de su próxima alimentación. Alimente a las hormigas aisladas y colonias de hormigas mutantes con grillos picados previamente por las obreras de una colonia regular 2-3 veces por semana.
3. Aplique agua regularmente al piso de la caja nido de yeso con una botella de lavado.
   NOTA: El yeso debe estar lo suficientemente húmedo como para que no se sienta polvoriento al tacto, pero debe estar lo suficientemente seco como para que toda el agua agregada sea absorbida por el yeso. Es importante que los nidos no se rieguen excesivamente. En promedio, las cajas nido necesitarán una pequeña cantidad de agua agregada una vez por semana.
4. Siempre que se alimente, retire la basura y las personas muertas. Congele todos los desechos y hormigas muertas durante la noche a -30 ° C antes de desechar estos materiales como basura regular.
5. Agregue una pizca de aserrín seco a las colonias periódicamente; Esto ayuda a las larvas a medida que se someten a la pupación y ayuda a las obreras a mantener limpia la caja nido.

2. Preparación de agujas de microinyección de vidrio de cuarzo

1. Use un extractor de micropipetas para tirar de las agujas de microinyección de vidrio.
2. Seleccione el vaso que desea extraer. Asegúrese de que el vidrio que se utiliza se ha almacenado en un ambiente limpio y libre de polvo.
   NOTA: Aquí, el vidrio de cuarzo filamentoso de paredes delgadas con un diámetro exterior de 1.0 mm, un diámetro interior de 0.5 mm y una longitud de 7.5 cm se ha utilizado para producir agujas de microinyección. Si se inyecta un embrión de cuerpo blando, las agujas de borosilicato también pueden ser aplicables, pero las agujas de borosilicato no pueden penetrar el corion duro.
3. Establezca la configuración de parámetros del extractor. Utilice un proceso de dos pasos para extraer agujas de microinyección para embriones de H. saltator : los parámetros para el primer paso incluyen calor de 575, filamento de 3, velocidad de 35, retraso de 145 y un tirón de 75; Los parámetros del segundo paso incluyen calor de 425, filamento de 0, velocidad de 15, retraso de 128 y un tirón de 200. Después del segundo paso, asegúrese de que la aguja resultante tenga una conicidad de 2 mm y una punta de 0,5 μm (Figura 2).
   NOTA: Este conjunto de parámetros, junto con los parámetros para otros tipos de agujas, se puede encontrar en el Manual de operación¹⁷. Los manuales para extractores de pipetas a menudo proporcionan parámetros recomendados para una variedad de técnicas. Es posible que se requiera un poco de prueba y error para determinar qué parámetros generan las mejores agujas para necesidades específicas. Una reducción corta es ideal para las inyecciones de H. saltator, ya que puede penetrar el corion duro de los embriones de H. saltator. Si se inyecta un embrión blando, como uno que ha sido descorionado (por ejemplo, Drosophila), una reducción más larga de alrededor de 10 mm puede producir mejores resultados. Los manuales de operación para extractores de pipetas suelen proporcionar parámetros específicos para tirar de agujas adecuadas para diferentes necesidades. Es importante que se usen guantes mientras se manipulan filamentos de vidrio y se tiran de agujas. Los aceites de las manos desnudas pueden transferirse al vidrio si no se usan guantes.
4. Una vez establecidos los parámetros, utilice un extractor de micropipetas para tirar de las agujas para la microinyección. Asegúrese de que las agujas se mantengan en un ambiente limpio y libre de polvo hasta que se utilicen.
   NOTA: Se recomienda utilizar agujas de microinyección recién tiradas. Si se utilizan agujas pre-tiradas, deben almacenarse adecuadamente en una caja para evitar daños en las puntas de las agujas y una posible contaminación. Las agujas que se han sometido a almacenamiento a largo plazo no se recomiendan para inyecciones de embriones.

3. Preparación del microinyector

1. Use un microinyector para inyectar los materiales deseados en embriones de hormiga.
2. Preparar la mezcla de microinyección de proteínas Cas9 y ARN guía pequeños sintetizados in vitro (sgRNAs)¹⁰. Mantenga la mezcla en hielo hasta que sea el momento de cargar una aguja de microinyección. Cuando no esté en uso, conservar la mezcla de microinyección a -80 °C.
   NOTA: Las concentraciones varían en diferentes especies. La alta concentración puede causar una alta mortalidad, mientras que la baja concentración puede reducir la eficiencia. Utilizamos proteínas Cas9 de 0,2 μg/μL y sgRNAs de 0,2 μg/μL para la inyección de embriones de H. saltator. El diseño de nuestros sgRNAs siguió un protocolo previamente establecido¹⁸. Las secuencias de genes se obtuvieron de bases de datos de ADN. La secuencia del genoma de H. saltator también fue reportada previamente^19,20.
3. Ajuste los parámetros de inyección para embriones de H. saltator : una presión de inyección de 140 hectopascal (hPa), una presión constante de 70 hPa y un tiempo de 0,4 segundos. Ajuste la presión constante de modo que el material solo fluya en una dirección. Ajuste la presión y el tiempo de inyección solo si no fluye material de la aguja al embrión.
   NOTA: Si se inyecta un tipo diferente de embrión, el parámetro principal que puede cambiar es la presión constante, que es responsable de garantizar que el líquido del embrión no fluya de nuevo en la aguja. El volumen no se controla en este protocolo. Establecer los parámetros del microinyector es suficiente para obtener inyecciones consistentes.
4. Cargue una aguja de microinyección con 2 μL de la mezcla utilizando puntas de pipeta de microcargador. Haga esto lentamente para asegurarse de que no se formen burbujas en la mezcla.
   NOTA: Si se forman burbujas, puede ser difícil mantener microinyecciones constantes.
5. Rompa solo la punta de la aguja rompiendo a lo largo del borde de la cinta de modo que aún se mantenga un cono estrecho. Asegúrese de que la aguja esté rota lo suficiente como para que se abra la punta, pero no tanto como para que la conicidad se rompa.
   NOTA: Es importante destacar que si la abertura de la aguja es demasiado ancha después de romperse, el usuario verá que el líquido se queda sin la aguja cuando se monta en el microinyector presurizado antes de la aplicación de la presión de inyección. Algunos protocolos de microinyección aconsejan romper agujas cortando la punta con tijeras. Este método no se recomienda, ya que las tijeras pueden hacer que la punta de la aguja se rompa. Inyectar embriones con una aguja rota será muy perjudicial.
6. Monte la aguja en el micromanipulador

4. Inyección de embriones

1. Seleccione embriones para microinyección de la etapa sincitial: el tiempo durante el desarrollo en el que los núcleos se dividen sin citocinesis.
   NOTA: Este es el momento ideal durante el desarrollo para la edición del genoma por microinyección, como se descubrió anteriormente en Drosophila²¹. Los embriones de H. saltator pasan la etapa sincitial y alcanzan la celularización alrededor de 36 h después de la deposición de óvulos¹⁰. Se logra una mayor eficiencia si se utilizan embriones más jóvenes para inyecciones.
2. Forra embriones en un trozo de cinta de doble cara pegado a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Asegúrese de que los embriones estén bien asegurados a la cinta para evitar el movimiento durante la inyección. Coloque los embriones en una orientación vertical, de modo que el lado lateral del embrión esté en el borde de la cinta (Figura 3). Coloque el portaobjetos y los embriones revestidos en el escenario del microscopio en una estación de trabajo de microinyección designada.
   NOTA: Se recomienda que los embriones estén dispuestos de tal manera que se puedan realizar inyecciones sucesivas moviendo la diapositiva en el escenario en lugar de ajustar la posición de la aguja con cada inyección. Esto permite que las inyecciones sucesivas se realicen de manera más eficiente.
3. Alinee la aguja con el primer embrión que se inyectará utilizando el micromanipulador (Figura 4a).
4. Perfore lateralmente la aguja en el primer embrión a lo largo de su eje dorsal/ventral bajo un microscopio.
5. Inyecte la mezcla de microinyección. Busque un ligero movimiento del embrión, lo que indica un aumento en la presión interna debido al líquido inyectado. Además, observe la formación de una pequeña gota que contiene rastros visibles de tejido y / o lípidos en la membrana externa del embrión (Figura 4b).
   NOTA: La presencia de trazas de tejido y/o lípidos en la gota indica que la aguja ha perforado con éxito tanto la corion como la membrana vitelina del embrión. Si no hay trazas de estos materiales, la inyección no se realizó con éxito y debe repetirse. Después de unos segundos, la gotita será reabsorbida por el embrión y ya no será visible.
6. Retire suavemente la aguja del embrión inmediatamente y proceda a la siguiente ajustando la posición del portaobjetos del microscopio. Repita hasta que todos los embriones hayan sido inyectados.
7. Una vez que todos los embriones en el portaobjetos se hayan inyectado con éxito, transfiera el portaobjetos a una caja húmeda durante 1 hora para que los embriones tengan tiempo de recuperarse del proceso de inyección antes de ser retirados del portaobjetos.

5. Crianza de embriones inyectados

1. Después de 1 hora de incubación en una caja húmeda, retire suavemente los embriones inyectados de la cinta con pinzas de peso pluma y transfiéralos a un tubo lleno con una pequeña cantidad de etanol al 70%. Invierta el tubo varias veces para transferir los embriones al fondo del tubo. Repita el lavado con etanol una vez, seguido de tres lavados con agua esterilizada en autoclave.
2. Usando un pincel pequeño y suave, transfiera todos los embriones inyectados a placas de agar al 1% con 2% de antibiótico-antimicótico. Aplique el antibiótico-antimicótico después de que las placas de agar vertidas se hayan enfriado extendiendo sobre la superficie de la placa con un esparcidor celular. Selle la placa de agar con parafilm para evitar la desecación en agar.
   NOTA: No intente devolver los embriones inyectados a una colonia después de las inyecciones, ya que las obreras pueden destruir la mayoría de los embriones inyectados. Por lo tanto, la supervivencia se optimiza al permitir que los embriones se desarrollen en placas de agar fuera de un entorno normal de colonia.
3. Incubar las placas de agar a 25 °C durante aproximadamente 4 semanas. Verifique regularmente si hay eclosión.
4. Una vez que el primer embrión haya eclosionado en una larva, devuelva todos los embriones y larvas a una caja nido con algunas enfermeras jóvenes para cuidar a las crías. Alimente con grillos picados previamente por una colonia de tipo silvestre más grande, elimine los productos de desecho y agregue agua siguiendo el mismo protocolo discutido en la Sección 1.
   NOTA: Las cajas pequeñas (9,5 x 9,5 cm²) son ideales para este tipo de colonias. H. saltator se reproduce bien en cautividad. Por lo tanto, los embriones mutantes pueden ser criados hasta la edad adulta. El aislamiento de adultos mutantes induce la transición a la etapa de gamergate reproductivo. Los cruces controlados se utilizan para establecer colonias mutantes con individuos heterocigotos u homocigotos (Figura 5).

Resultados

Utilizando el protocolo proporcionado aquí, la edición del genoma en embriones saltadores de Harpegnathos se realizó con éxito. Estos resultados se validaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa y la clonación pGEM de ADN extraído de embriones inyectados seguida de la secuenciación del ADN. La eficiencia de la mutagénesis somática utilizando este protocolo alcanzó aproximadamente el 40%. Los machos mutantes F1 se aparearon con hembras de tipo salvaje para pr...

Discusión

La evolución de la eusocialidad entre insectos, incluyendo hormigas, abejas, avispas y termitas, ha resultado en la aparición de nuevos rasgos de comportamiento y morfológicos, muchos de los cuales se entiende que están influenciados por una combinación de factores ambientales y genéticos 1,2,3,4. Desafortunadamente, el atractivo y la utilidad de los insectos eusociales como modelos de in...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030