Инъекции эмбрионов при CRISPR-опосредованном мутагенезе в соляном аппарате муравьиного харпегнатоса

Резюме

Многие характеристики эусоциальности насекомых зависят от коммуникации внутри колонии и разделения труда. Генетическое манипулирование ключевыми регуляторными генами у эмбрионов муравьев с помощью микроинъекции и CRISPR-опосредованного мутагенеза дает представление о природе альтруистического поведения у эусоциальных насекомых.

Аннотация

Уникальные черты эусоциальных насекомых, такие как социальное поведение и репродуктивное разделение труда, контролируются их генетической системой. Чтобы решить, как гены регулируют социальные черты, мы разработали мутантных муравьев путем доставки комплекса CRISPR в молодые эмбрионы во время их синцитиальной стадии. Здесь мы приводим протокол CRISPR-опосредованного мутагенеза у Harpegnathos saltator, вида понериновых муравьев, который демонстрирует поразительную фенотипическую пластичность. H. муравьи-солиторы легко выращиваются в лабораторных условиях. Эмбрионы собирают для микроинъекции с белками Cas9 и in vitro синтезируют малые направляющие РНК (sgRNAs) с помощью самодельных кварцевых игл. Эмбрионы после инъекции выращиваются вне колонии. После появления первой личинки все эмбрионы и личинки транспортируются в гнездовой ящик с несколькими кормящими работниками для дальнейшего развития. Этот протокол подходит для индуцирования мутагенеза для анализа кастовой физиологии и социального поведения у муравьев, но также может быть применен к более широкому спектру перепончатокрылых и других насекомых.

Введение

Эволюция эусоциальности у насекомых, а именно у отрядов перепончатокрылых и Blattodea (ранее Isoptera), привела к уникальным и часто сложным поведенческим чертам, которые проявляются как на индивидуальном, так и на колониальном уровнях. Репродуктивное разделение труда, черта, характеризующая наиболее развитые группы общественных насекомых, часто включает кастовые системы, состоящие из нескольких поведенчески и часто морфологически отличительных групп. Такое поведенческое и морфологическое разнообразие между кастами контролируется не только их генетической системой, но и часто окружающей средой 1,2,3,4, что делает эусоциальных насекомых привлекательными объектами для генетических и эпигенетических исследований.

Способность манипулировать генетической системой эусоциальных насекомых оказалась сложной задачей, поскольку многие виды не спариваются и не размножаются в лабораторных условиях. Большинство эусоциальных насекомых также имеют очень мало репродуктивных особей в колонии, что ограничивает количество потомства, которое может быть произведено, и, следовательно, ограничивает размер выборки для генетических манипуляций⁵. Кроме того, многие эусоциальные насекомые имеют длительное время генерации по сравнению с насекомыми, обычно используемыми для генетических исследований (такими как дрозофила), что затрудняет установление генетических линий⁵. Некоторые эусоциальные виды, однако, могут генерировать большую долю репродуктивно активных особей в колонии, что облегчает проблемы и предоставляет возможности для установления мутантных или трансгенных линий.

В случае вида муравьев-понеринов, Harpegnathos saltator, все работницы могут стать репродуктивно активными после смерти королевы или социальной изоляции. Эти рабочие называются «гамергатами» и могут быть использованы для создания новых колоний⁶. Кроме того, в колонии может присутствовать более одного геймергейта, что увеличивает производство потомства^{на 5,7,8}. До сих пор мутантные и/или трансгенные линии были разработаны у европейской медоносной пчелы, Apis mellifera, и у видов муравьев, H. saltator, Ooceraea biroi и Solenopsis invicta ^{9,10,11,12,13,14,15} . Генетический анализ у социальных пчел и муравьев проложил путь к лучшему пониманию эусоциальности, предоставляя множество возможностей для изучения генов и их влияния на эусоциальное поведение насекомых и кастовую физиологию.

Здесь мы предоставляем протокол генетической модификации через систему CRISPR/Cas9 в H. saltator. В частности, этот метод был использован для генерации мутации зародышевой линии в orco, гене, кодирующем облигатный корецептор всех рецепторов одоранта (ORs)¹⁰. Гены OR были замечательно расширены у перепончатокрылых эусоциальных насекомых¹⁶, и orco играет важную роль в обонянии насекомых; при его отсутствии операционные системы не собираются и не функционируют нормально. Таким образом, мутации гена orco нарушают обонятельные ощущения, нервное развитие и связанное с ними социальное поведение ^9,10.

В этом протоколе белки Cas9 и малые направляющие РНК (sgRNAs) вводятся в эмбрионы муравьев с использованием микроинъекции с целью индуцирования мутагенеза гена-мишени. Здесь мы подробно опишем процедуру микроинъекции вместе с указаниями по уходу за колониями и введенными эмбрионами. Эти методы подходят для индуцирования мутагенеза в различных генах у муравьев H. saltator и могут быть применены к более широкому спектру перепончатокрылых насекомых.

протокол

1. Регулярное обслуживание колоний сальтаторов Harpegnathos

1. Поддерживайте колонии H. saltator дикого типа в прозрачных пластиковых коробках в комнате для выращивания муравьев при 22-25 ° C и фотопериоде 12 часов света: 12 часов темного (12L: 12D) графика освещения.
   1. Используйте небольшие ящики (9,5 х 9,5^см2) для выращивания отдельных рабочих или небольших колоний. Используйте средние коробки (19 x 13,5^см2) или большие коробки (27 x 19^см2) для выращивания более крупных колоний (рисунок 1).
   2. Чтобы создать гнездовые ящики, используйте штукатурку, чтобы сделать полы для ящиков. Поскольку мокрая штукатурка высыхает в средних и больших ящиках, вдавите пеноблок в штукатурку на несколько сантиметров глубиной и на несколько сантиметров от задней части коробки, чтобы обозначить более низкую область гнезда. Как только штукатурка высохнет, накройте выделенную область гнезда квадратным куском стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В небольших коробочках нет необходимости обозначать нижнюю область гнезда. Если муравьи пренебрегают использованием обозначенной нижней области гнезда, это может помочь покрыть стекло квадратным куском красного целлофана. Это создает впечатление темного подземного пространства, напоминающего гнезда, которые H. saltator использует в дикой природе, и может побудить их переместить свой выводок в назначенный регион.
2. Кормите колонии живыми сверчками два раза в неделю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии должны быть накормлены достаточно, чтобы они потребляли всех сверчков до их следующего кормления. Кормите любых изолированных муравьев и колонии муравьев-мутантов сверчками, предварительно ужаленными работниками обычной колонии 2-3 раза в неделю.
3. Регулярно наносите воду на напольное покрытие гипсового гнезда с помощью бутылки для мытья.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Штукатурка должна быть достаточно влажной, чтобы она не чувствовала себя пыльной на ощупь, но она должна быть достаточно сухой, чтобы вся добавленная вода впитывалась штукатуркой. Важно, чтобы гнезда не поливали чрезмерно. В среднем, гнездовые ящики потребуют небольшого количества воды, добавляемой один раз в неделю.
4. Всякий раз, когда происходит кормление, удаляйте мусор и мертвых особей. Заморозьте все отходы и мертвых муравьев на ночь при -30 °C, прежде чем утилизировать эти материалы как обычный мусор.
5. Периодически добавляйте в колонии щепотку высушенных опилок; это помогает личинкам, когда они подвергаются окукливанию, и помогает рабочим содержать гнездовой ящик в чистоте.

2. Приготовление микроинъекционных игл кварцевого стекла

1. Используйте съемник микропипетки, чтобы вытащить стеклянные микроинъекционные иглы.
2. Выберите стекло, которое нужно потянуть. Убедитесь, что используемое стекло хранилось в свободной от пыли и чистой среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для производства микроинъекционных игл использовалось тонкостенное нитевидное кварцевое стекло с наружным диаметром 1,0 мм, внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 7,5 см. При инъекции мягкотелого эмбриона также могут быть применимы боросиликатные иглы, но боросиликатные иглы не способны проникать в твердый хорион.
3. Задайте параметры съемника. Используйте двухэтапный процесс для вытягивания микроинъекционных игл для эмбрионов H. saltator : параметры для первой стадии включают теплоту 575, нить накала 3, скорость 35, задержку 145 и тягу 75; Параметры второй ступени включают теплоту 425, нить накала 0, скорость 15, задержку 128 и тягу 200. Следуя второму этапу, убедитесь, что полученная игла имеет конус 2 мм и наконечник 0,5 мкм (рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот набор параметров, наряду с параметрами для других типов игл, можно найти в Руководстве по эксплуатации¹⁷. Руководства по изготовлению пипеток часто содержат рекомендуемые параметры для различных техник. Может потребоваться некоторое количество проб и ошибок, чтобы определить, какие параметры генерируют лучшие иглы для конкретных потребностей. Короткий конус идеально подходит для инъекций H. saltator , так как он может проникать в твердый хорион эмбрионов H. saltator . При введении мягкого эмбриона, такого как тот, который был дехорионирован (например, дрозофила), более длинный конус около 10 мм может дать лучшие результаты. Руководства по эксплуатации съемников пипеток обычно содержат конкретные параметры для вытягивания игл, подходящих для различных нужд. Важно, чтобы перчатки носились при работе со стеклянными нитями и вытягивании игл. Масла с голых рук могут переноситься на стекло, если перчатки не надеты.
4. После того, как параметры установлены, используйте съемник микропипетки, чтобы вытащить иглы для микроинъекции. Убедитесь, что иглы хранятся в свободной от пыли и чистой среде до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать свежевытянутые микроинъекционные иглы. Если используются предварительно вытащенные иглы, их следует правильно хранить в коробке, чтобы предотвратить повреждение кончиков игл и потенциальное загрязнение. Иглы, подвергшиеся длительному хранению, не рекомендуются для инъекций эмбриона.

3. Подготовка микроинъектора

1. Используйте микроинъектор для инъекции желаемых материалов в эмбрионы муравьев.
2. Готовят микроинъекционную смесь белков Cas9 и in vitro синтезируют малые направляющие РНК (sgRNAs)¹⁰. Держите смесь на льду до тех пор, пока не придет время загружать микроинъекционную иглу. Когда смесь микроинъекций не используется, храните при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации варьируются у разных видов. Высокая концентрация может привести к высокой смертности, тогда как низкая концентрация может снизить эффективность. Мы используем 0,2 мкг/мкл белков Cas9 и 0,2 мкг/мкл sgRNAs для инъекции эмбриона H. saltator. Проектирование наших sgRNAs осуществлялось в соответствии с ранее установленным протоколом¹⁸. Последовательности генов были получены из баз данных ДНК. Последовательность генома H. saltator также ранее сообщалось о^19,20.
3. Отрегулируйте параметры инъекции для эмбрионов H. saltator : давление инъекции 140 гектопаскаль (гПа), постоянное давление 70 гПа и время 0,4 секунды. Отрегулируйте постоянное давление таким образом, чтобы материал тек только в одном направлении. Регулируйте давление и время инъекции только в том случае, если из иглы в эмбрион не течет материал.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При введении другого типа эмбриона основным параметром, который может измениться, является постоянное давление, которое отвечает за обеспечение того, чтобы жидкость из эмбриона не текла обратно в иглу. Громкость не контролируется в этом протоколе. Установка параметров микроинжектора достаточна для получения последовательных инъекций.
4. Загрузите микроинъекционную иглу 2 мкл смеси с помощью наконечников пипетки микрозагрузчика. Делайте это медленно, чтобы убедиться, что в смеси не образуются пузырьки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если образуются пузырьки, может быть трудно поддерживать последовательные микроинъекции.
5. Сломайте только кончик иглы, сломав вдоль края ленты так, чтобы узкая конус все еще сохранялась. Убедитесь, что игла сломана ровно настолько, чтобы наконечник был открыт, но не настолько, чтобы конус был сломан.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что если отверстие иглы слишком широкое после разрыва, пользователь увидит, что жидкость вытекает из иглы при установке на микроинжектор под давлением до применения давления впрыска. Некоторые протоколы микроинъекции советуют ломать иглы, разрезая наконечник ножницами. Этот метод не рекомендуется, так как ножницы могут привести к разрушению кончика иглы. Инъекция эмбрионов с раздробленной иглой будет очень вредной.
6. Прикрепите иглу к микроманипулятору

4. Инъекция эмбрионов

1. Отбираем эмбрионы для микроинъекции из синцитиальной стадии: время развития, в течение которого ядра делятся без цитокинеза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это идеальное время во время разработки для редактирования генома с помощью микроинъекции, как было обнаружено ранее в Drosophila²¹. Эмбрионы H. saltator проходят синцитиальную стадию и достигают клеточной обработки примерно через 36 ч после отложения яйцеклетки¹⁰. Более высокая эффективность достигается, если для инъекций используются более молодые эмбрионы.
2. Выровняйте эмбрионы на куске двусторонней ленты, приклеенной к стеклянному слайду микроскопа. Убедитесь, что эмбрионы хорошо прикреплены к ленте, чтобы предотвратить движение во время инъекции. Уложите эмбрионы в вертикальной ориентации, так, чтобы боковая сторона эмбриона находилась на краю ленты (рисунок 3). Поместите слайд и выровненные эмбрионы на сцену микроскопа на специально отведенном рабочем месте для микроинъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы эмбрионы были расположены таким образом, чтобы последовательные инъекции можно было выполнять, перемещая слайд на сцене вместо корректировки положения иглы с каждой инъекцией. Это позволяет выполнять последовательные инъекции более эффективно.
3. Выровняйте иглу с первым эмбрионом, который будет введен с помощью микроманипулятора (рисунок 4а).
4. Латерально проколоть иглу в первый эмбрион вдоль его дорсальной/вентральной оси под микроскопом.
5. Вводят микроинъекционную смесь. Следите за незначительным движением эмбриона, свидетельствующим о повышении внутреннего давления из-за введенной жидкости. Кроме того, следите за образованием небольшой капли, содержащей видимые следы ткани и/или липидов на внешней мембране эмбриона (рисунок 4b).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие следа ткани и/или липида в капле указывает на то, что игла успешно проколола как хорион, так и вителлиновую мембрану эмбриона. Если следов этих материалов нет, инъекция не была выполнена успешно и должна быть повторена. Через несколько секунд капля будет реабсорбирована эмбрионом и больше не будет видна.
6. Осторожно немедленно извлеките иглу из эмбриона и приступайте к следующему, регулируя положение предметной области микроскопа. Повторяйте до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы.
7. После того, как все эмбрионы на слайде были успешно введены, перенесите слайд во влажную коробку на 1 час, чтобы дать эмбрионам время для восстановления после процесса инъекции до удаления с слайда.

5. Выращивание введенных эмбрионов

1. После 1 часа инкубации во влажной коробке аккуратно извлеките введенные эмбрионы из ленты с помощью легких щипцов и перенесите их в трубку, заполненную небольшим количеством 70% этанола. Переверните трубку несколько раз, чтобы перенести эмбрионы на дно трубки. Повторите промывку этанолом один раз, а затем три промывки автоклавной водой.
2. Используя небольшую и мягкую кисть, перенесите все введенные эмбрионы на 1% агаровые пластины с 2% антибиотиками-антимикотами. Нанесите антибиотик-антимикот после того, как налитые агаровы пластины остынут, распределив по поверхности пластины с помощью клеточного распределителя. Запечатайте агаровую пластину парапленкой, чтобы предотвратить высыхание агара.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не пытайтесь вернуть введенные эмбрионы в колонию после инъекций, так как рабочие могут уничтожить большинство введенных эмбрионов. Таким образом, выживаемость оптимизируется, позволяя эмбрионам развиваться на агаровых пластинах за пределами нормальной среды колонии.
3. Инкубируйте агаровые пластины при 25 °C в течение примерно 4 недель. Регулярно проверяйте наличие штриховки.
4. Как только первый эмбрион вылупится в личинку, верните все эмбрионы и личинки в гнездовой ящик с несколькими молодыми работниками-медсестрами для ухода за детенышами. Кормите с помощью сверчков, предварительно ужаленных более крупной колонией дикого типа, удаляйте отходы и добавляйте воду в соответствии с тем же протоколом, обсуждаемым в разделе 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие коробочки (9,5 х 9,5^см2) идеально подходят для таких колоний. H. saltator хорошо размножается в неволе. Поэтому мутантные эмбрионы могут быть выращены до зрелого возраста. Изоляция мутантных взрослых (взрослых) вызывает переход в репродуктивную стадию геймергейта. Контролируемые скрещивания используются для создания мутантных колоний с гетерозиготными или гомозиготными особями (рисунок 5).

Результаты

Используя протокол, представленный здесь, редактирование генома эмбрионов Harpegnathos saltator было успешно выполнено. Эти результаты были подтверждены с помощью полимеразной цепной реакции и pGEM-клонирования ДНК, извлеченной из введенных эмбрионов с последующим секвен?...

Обсуждение

Эволюция эусоциальности среди насекомых, включая муравьев, пчел, ос и термитов, привела к появлению новых поведенческих и морфологических признаков, многие из которых, как считается, находятся под влиянием комбинации экологических и генетических факторов 1,2,3,4.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030