Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

Zusammenfassung

Viele Merkmale der Insekten-Eusozialität beruhen auf der Kommunikation innerhalb der Kolonie und der Arbeitsteilung. Die genetische Manipulation wichtiger regulatorischer Gene in Ameisenembryonen durch Mikroinjektion und CRISPR-vermittelte Mutagenese liefert Einblicke in die Natur altruistischen Verhaltens bei eusozialen Insekten.

Zusammenfassung

Die einzigartigen Merkmale eusozialer Insekten, wie Sozialverhalten und reproduktive Arbeitsteilung, werden durch ihr genetisches System gesteuert. Um zu untersuchen, wie Gene soziale Merkmale regulieren, haben wir mutierte Ameisen entwickelt, indem wir den CRISPR-Komplex in junge Embryonen während ihres Synzytialstadiums abgegeben haben. Hier stellen wir ein Protokoll der CRISPR-vermittelten Mutagenese in Harpegnathos saltator zur Verfügung, einer ponerinen Ameisenart, die eine auffällige phänotypische Plastizität aufweist. H. saltator Ameisen werden leicht in einer Laborumgebung aufgezogen. Embryonen werden für die Mikroinjektion mit Cas9-Proteinen und in vitro synthetisierten kleinen Guide-RNAs (sgRNAs) mit hausgemachten Quarznadeln gesammelt. Embryonen nach der Injektion werden außerhalb der Kolonie aufgezogen. Nach dem Schlüpfen der ersten Larve werden alle Embryonen und Larven mit einigen Pflegekräften zur weiteren Entwicklung in einen Nistkasten transportiert. Dieses Protokoll eignet sich zur Induktion der Mutagenese zur Analyse der kastenspezifischen Physiologie und des Sozialverhaltens bei Ameisen, kann aber auch auf ein breiteres Spektrum von Hautflüglern und anderen Insekten angewendet werden.

Einleitung

Die Entwicklung der Eusozialität bei Insekten, insbesondere bei den Ordnungen Hymenoptera und Blattodea (früher Isoptera), hat zu einzigartigen und oft anspruchsvollen Verhaltensmerkmalen geführt, die sich sowohl auf individueller als auch auf Kolonieebene manifestieren. Die reproduktive Arbeitsteilung, ein Merkmal, das die fortgeschrittensten Gruppen sozialer Insekten charakterisiert, beinhaltet oft Kastensysteme, die aus mehreren verhaltensmäßig und oft morphologisch unterschiedlichen Gruppen bestehen. Diese Verhaltens- und morphologische Vielfalt zwischen den Kasten wird nicht nur durch ihr genetisches System, sondern oft auch durch die Umwelt gesteuert 1,2,3,4^, was eusoziale Insekten zu attraktiven Subjekten für genetische und epigenetische Forschung macht.

Die Fähigkeit, das genetische System eusozialer Insekten zu manipulieren, hat sich als Herausforderung erwiesen, da sich viele Arten im Labor nicht paaren und vermehren. Die meisten eusozialen Insekten haben auch sehr wenige reproduktive Individuen in einer Kolonie, was die Anzahl der Nachkommen, die produziert werden können, begrenzt und folglich die Stichprobengröße für genetische Manipulation begrenzt⁵. Darüber hinaus haben viele eusoziale Insekten eine lange Generationszeit im Vergleich zu Insekten, die üblicherweise für genetische Studien verwendet werden (wie Drosophila), was die Schwierigkeit, genetische Linien zu etablieren, erschwert⁵. Einige eusoziale Arten können jedoch einen großen Anteil an reproduktiv aktiven Individuen in einer Kolonie erzeugen, was die Herausforderungen lindert und Möglichkeiten bietet, mutierte oder transgene Linien zu etablieren.

Im Falle der ponerinen Ameisenart, Harpegnathos saltator, können alle Arbeiterinnen nach dem Tod einer Königin oder sozialer Isolation fortpflanzungsaktiv werden. Diese Arbeiter werden als "Gamergates" bezeichnet und können verwendet werden, um neue Kolonien zu generieren⁶. Darüber hinaus kann es mehr als ein Gamergate in einer Kolonie geben, wodurch die Nachkommenproduktion ^5,7,8 erhöht wird. Bisher wurden mutierte und/oder transgene Linien bei der europäischen Honigbiene, Apis mellifera, und bei den Ameisenarten H. saltator, Ooceraea biroi und Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 entwickelt. . Genetische Analysen bei sozialen Bienen und Ameisen haben den Weg zu einem besseren Verständnis der Eusozialität geebnet und bieten eine Reihe von Möglichkeiten, Gene und ihre Auswirkungen auf eusoziales Insektenverhalten und kastenspezifische Physiologie zu untersuchen.

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung über das CRISPR/Cas9-System in H. saltator zur Verfügung. Insbesondere wurde diese Technik verwendet, um eine Keimbahnmutation in Orco zu erzeugen, dem Gen, das den obligaten Co-Rezeptor aller Geruchsrezeptoren (ORs) ^kodiert10. OR-Gene wurden in eusozialen Hymenopteren-Insekten bemerkenswert erweitert¹⁶, und ORCO spielt eine wesentliche Rolle bei der Geruchswahrnehmung von Insekten; in seiner Abwesenheit montieren sich OPs nicht oder funktionieren nicht normal. Mutationen des Orco-Gens stören daher die olfaktorische Empfindung, die neuronale Entwicklung und das damit verbundene soziale Verhalten ^9,10.

In diesem Protokoll werden Cas9-Proteine und kleine Guide-RNAs (sgRNAs) mittels Mikroinjektion in Ameisenembryonen eingeführt, um die Mutagenese eines Zielgens zu induzieren. Hier werden wir das Mikroinjektionsverfahren im Detail beschreiben, zusammen mit Anweisungen zur Pflege von Kolonien und injizierten Embryonen. Diese Methoden eignen sich zur Induktion der Mutagenese in einer Vielzahl verschiedener Gene bei H. saltator-Ameisen und können auf ein breiteres Spektrum von Hautflügler-Insekten angewendet werden.

Protokoll

1. Regelmäßige Pflege von Harpegnathos saltator Kolonien

1. Pflegen Sie Wildtyp-Kolonien von H. saltator in transparenten Plastikboxen in einem Ameisenaufzuchtraum bei 22-25 ° C und einer Fotoperiode von 12 Stunden Licht: 12 Stunden dunkel (12L: 12D) Beleuchtungsplan.
   1. Verwenden Sie kleine Kisten (9,5 x 9,5 cm²), um einzelne Arbeiter oder kleine Kolonien aufzuziehen. Verwenden Sie mittlere Boxen (19 x 13,5 cm 2) oder große Boxen (27 x 19 cm²), um größere Kolonien zu züchten (Abbildung 1).
   2. Um Nistkästen zu erstellen, verwenden Sie Gips, um Böden für die Kästen herzustellen. Da der nasse Pflaster im Medium und in den großen Kästen trocknet, drücken Sie einen Schaumstoffblock einige Zentimeter tief und einige Zentimeter von der Rückseite des Kastens in den Putz, um einen unteren Nestbereich zu bezeichnen. Sobald der Gips getrocknet ist, bedecken Sie den vorgesehenen Nestbereich mit einem quadratischen Stück Glas.
      HINWEIS: In kleinen Boxen ist es nicht erforderlich, einen unteren Nestbereich zu bestimmen. Wenn Ameisen es versäumen, die vorgesehene untere Nestregion zu verwenden, kann es hilfreich sein, das Glas mit einem quadratischen Stück rotem Zellophan zu bedecken. Dies erweckt den Eindruck eines dunklen unterirdischen Raums, der Nestern ähnelt, die H. saltator in freier Wildbahn benutzt, und kann sie ermutigen, ihre Brut in die vorgesehene Region zu bringen.
2. Füttern Sie Kolonien zweimal pro Woche mit lebenden Grillen.
   HINWEIS: Kolonien sollten so weit gefüttert werden, dass sie alle Grillen vor ihrer nächsten Fütterung verzehren. Füttern Sie alle isolierten Ameisen und mutierten Ameisenkolonien mit Grillen, die von Arbeitern einer regulären Kolonie 2-3 Mal pro Woche gestochen werden.
3. Tragen Sie regelmäßig Wasser mit einer Waschflasche auf den Boden des Gipsnistkastens auf.
   HINWEIS: Das Pflaster sollte feucht genug sein, dass es sich nicht staubig anfühlt, aber es sollte trocken genug sein, dass das gesamte hinzugefügte Wasser vom Pflaster absorbiert wird. Es ist wichtig, dass die Nester nicht übermäßig bewässert werden. Im Durchschnitt benötigen Nistkästen einmal pro Woche eine kleine Menge Wasser.
4. Wann immer die Fütterung stattfindet, entfernen Sie Müll und tote Individuen. Frieren Sie alle Abfälle und toten Ameisen über Nacht bei -30 °C ein, bevor Sie diese Materialien als normalen Müll entsorgen.
5. Fügen Sie den Kolonien regelmäßig eine Prise getrocknetes Sägemehl hinzu; Dies hilft den Larven bei der Verpuppung und hilft den Arbeitern, den Nistkasten sauber zu halten.

2. Herstellung von Mikroinjektionsnadeln aus Quarzglas

1. Verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um Glas-Mikroinjektionsnadeln zu ziehen.
2. Wählen Sie das zu ziehende Glas aus. Stellen Sie sicher, dass das verwendete Glas in einer staubfreien und sauberen Umgebung gelagert wurde.
   HINWEIS: Hier wurde dünnwandiges filamentöses Quarzglas mit einem Außendurchmesser von 1,0 mm, einem Innendurchmesser von 0,5 mm und einer Länge von 7,5 cm zur Herstellung von Mikroinjektionsnadeln verwendet. Bei der Injektion eines weichen Embryos können auch Borosilikatnadeln anwendbar sein, aber Borosilikatnadeln sind nicht in der Lage, hartes Chorion zu durchdringen.
3. Legen Sie die Parametereinstellungen des Pullers fest. Verwenden Sie einen zweistufigen Prozess, um Mikroinjektionsnadeln für H. saltator-Embryonen zu ziehen: Parameter für den ersten Schritt umfassen Hitze von 575, Filament von 3, Geschwindigkeit von 35, Verzögerung von 145 und einen Zug von 75; Zu den Parametern des zweiten Schritts gehören Wärme von 425, Filament von 0, Geschwindigkeit von 15, Verzögerung von 128 und ein Zug von 200. Stellen Sie nach dem zweiten Schritt sicher, dass die resultierende Nadel eine 2-mm-Verjüngung und eine Spitze von 0,5 μm aufweist (Abbildung 2).
   HINWEIS: Dieser Parametersatz sowie Parameter für andere Nadeltypen finden Sie in der Bedienungsanleitung¹⁷. Handbücher für Pipettenzieher enthalten oft empfohlene Parameter für eine Vielzahl von Techniken. Einige Versuche und Irrtümer können erforderlich sein, um zu bestimmen, welche Parameter die besten Nadeln für bestimmte Anforderungen erzeugen. Eine kurze Verjüngung ist ideal für H. saltator-Injektionen, da sie das harte Chorion von H. saltator-Embryonen durchdringen kann . Wenn ein weicher Embryo injiziert wird, z. B. einer, der dechorioniert wurde (z. B. Drosophila), kann eine längere Verjüngung um 10 mm bessere Ergebnisse liefern. Bedienungsanleitungen für Pipettenzieher enthalten in der Regel spezifische Parameter für das Ziehen von Nadeln, die für unterschiedliche Anforderungen geeignet sind. Es ist wichtig, dass beim Umgang mit Glasfilamenten und dem Ziehen von Nadeln Handschuhe getragen werden. Öle aus bloßen Händen können auf das Glas übergehen, wenn keine Handschuhe getragen werden.
4. Sobald die Parameter eingestellt sind, verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um Nadeln für die Mikroinjektion zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass die Nadeln bis zur Verwendung in einer staubfreien und sauberen Umgebung aufbewahrt werden.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, frisch gezogene Mikroinjektionsnadeln zu verwenden. Wenn vorgezogene Nadeln verwendet werden, sollten sie ordnungsgemäß in einer Box aufbewahrt werden, um eine Beschädigung der Nadelspitzen und eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Nadeln, die einer Langzeitlagerung unterzogen wurden, werden nicht für Embryoinjektionen empfohlen.

3. Herstellung des Mikroinjektors

1. Verwenden Sie einen Mikroinjektor, um gewünschte Materialien in Ameisenembryonen zu injizieren.
2. Bereiten Sie die Mikroinjektionsmischung aus Cas9-Proteinen und in vitro synthetisierten kleinen Guide-RNAs (sgRNAs) ^vor10. Halten Sie die Mischung auf Eis, bis es Zeit ist, eine Mikroinjektionsnadel zu laden. Bei Nichtgebrauch das Mikroinjektionsgemisch bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Die Konzentrationen variieren bei verschiedenen Spezies. Eine hohe Konzentration kann zu einer hohen Mortalität führen, während eine niedrige Konzentration die Effizienz verringern kann. Wir verwenden 0,2 μg/μL Cas9-Proteine und 0,2 μg/μL sgRNAs für die Injektion von H. saltator-Embryonen. Das Design unserer sgRNAs folgte einem zuvor etablierten Protokoll¹⁸. Gensequenzen wurden aus DNA-Datenbanken gewonnen. Die Genomsequenz von H. saltator wurde zuvor ebenfalls berichtet^19,20.
3. Passen Sie die Injektionsparameter für H. saltator-Embryonen an: einen Injektionsdruck von 140 Hektopascal (hPa), einen konstanten Druck von 70 hPa und eine Zeit von 0,4 Sekunden. Stellen Sie den konstanten Druck so ein, dass das Material nur in eine Richtung fließt. Passen Sie den Injektionsdruck und die Injektionszeit nur an, wenn kein Material von der Nadel in den Embryo fließt.
   HINWEIS: Wenn Sie eine andere Art von Embryo injizieren, ist der primäre Parameter, der sich ändern kann, ein konstanter Druck, der dafür verantwortlich ist, dass Flüssigkeit aus dem Embryo nicht in die Nadel zurückfließt. Die Lautstärke wird in diesem Protokoll nicht gesteuert. Die Einstellung der Parameter des Mikroinjektors reicht aus, um konsistente Injektionen zu erhalten.
4. Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit 2 μL der Mischung unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen. Tun Sie dies langsam, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Mischung bilden.
   HINWEIS: Wenn sich Blasen bilden, kann es schwierig sein, konsistente Mikroinjektionen aufrechtzuerhalten.
5. Brechen Sie nur die Spitze der Nadel, indem Sie entlang der Kante des Bandes brechen, so dass eine schmale Verjüngung beibehalten wird. Stellen Sie sicher, dass die Nadel gerade so weit gebrochen ist, dass die Spitze geöffnet wird, aber nicht so sehr, dass die Verjüngung abgebrochen ist.
   HINWEIS: Wenn die Öffnung der Nadel nach dem Brechen zu breit ist, sieht der Benutzer, dass Flüssigkeit aus der Nadel ausläuft, wenn sie vor der Anwendung des Einspritzdrucks am unter Druck stehenden Mikroinjektor montiert wird. Einige Mikroinjektionsprotokolle empfehlen, Nadeln zu brechen, indem die Spitze mit einer Schere geschnitten wird. Diese Methode wird nicht empfohlen, da eine Schere dazu führen kann, dass die Nadelspitze zerbricht. Die Injektion von Embryonen mit einer zerbrochenen Nadel wird sehr schädlich sein.
6. Befestigen Sie die Nadel am Mikromanipulator

4. Injektion von Embryonen

1. Wählen Sie Embryonen für die Mikroinjektion aus dem Synzytialstadium aus: die Zeit während der Entwicklung, in der sich die Kerne ohne Zytokinese teilen.
   HINWEIS: Dies ist der ideale Zeitpunkt während der Entwicklung für die Genom-Editierung durch Mikroinjektion, wie zuvor in Drosophila²¹ entdeckt. H. saltator-Embryonen passieren das Synzytialstadium und erreichen die Zellular etwa 36 h nach der Eiablagerung¹⁰. Eine höhere Effizienz wird erreicht, wenn jüngere Embryonen für Injektionen verwendet werden.
2. Legen Sie Embryonen auf ein Stück doppelseitiges Klebeband, das an einem Glasobjektträger befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen gut am Klebeband befestigt sind, um Bewegungen während der Injektion zu verhindern. Legen Sie die Embryonen in eine vertikale Ausrichtung, so dass sich die laterale Seite des Embryos am Rand des Bandes befindet (Abbildung 3). Legen Sie den Objektträger und die ausgekleideten Embryonen an einem dafür vorgesehenen Mikroinjektionsarbeitsplatz auf den Tisch des Mikroskops.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Embryonen so anzuordnen, dass aufeinanderfolgende Injektionen durchgeführt werden können, indem der Objektträger auf der Bühne bewegt wird, anstatt die Nadelposition bei jeder Injektion anzupassen. Dadurch können aufeinanderfolgende Injektionen effizienter durchgeführt werden.
3. Richten Sie die Nadel mit dem ersten Embryo aus, der mit dem Mikromanipulator injiziert werden soll (Abbildung 4a).
4. Punktieren Sie die Nadel seitlich in den ersten Embryo entlang seiner dorsalen/ventralen Achse unter einem Mikroskop.
5. Injizieren Sie die Mikroinjektionsmischung. Achten Sie auf eine leichte Bewegung des Embryos, die auf einen Anstieg des Innendrucks aufgrund der injizierten Flüssigkeit hinweist. Achten Sie außerdem auf die Bildung eines kleinen Tröpfchens mit sichtbaren Spuren von Gewebe und/oder Lipiden auf der äußeren Membran des Embryos (Abbildung 4b).
   HINWEIS: Das Vorhandensein von Spuren von Gewebe und / oder Lipid im Tröpfchen zeigt an, dass die Nadel erfolgreich sowohl Chorion als auch Vitellinmembran des Embryos punktiert hat. Wenn Spuren dieser Materialien nicht vorhanden sind, wurde die Injektion nicht erfolgreich durchgeführt und sollte wiederholt werden. Nach einigen Sekunden wird das Tröpfchen vom Embryo resorbiert und ist nicht mehr sichtbar.
6. Entfernen Sie die Nadel sofort vorsichtig vom Embryo und fahren Sie mit der nächsten fort, indem Sie die Position des Objektträgers anpassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen injiziert wurden.
7. Sobald alle Embryonen auf dem Objektträger erfolgreich injiziert wurden, geben Sie den Objektträger für 1 Stunde in eine feuchte Box, um den Embryonen Zeit zu geben, sich vom Injektionsprozess zu erholen, bevor sie aus dem Objektträger entfernt werden.

5. Aufzucht injizierter Embryonen

1. Nach 1 Stunde Inkubation in einer feuchten Box entfernen Sie die injizierten Embryonen vorsichtig mit einer federleichten Pinzette vom Band und übertragen Sie sie in ein Röhrchen, das mit einer kleinen Menge von 70% Ethanol gefüllt ist. Drehen Sie die Röhre mehrmals um, um die Embryonen auf den Boden der Röhre zu übertragen. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche einmal, gefolgt von drei Wäschen mit autoklaviertem Wasser.
2. Übertragen Sie alle injizierten Embryonen mit einem kleinen und weichen Pinsel auf 1% Agarplatten mit 2% Antibiotikum-Antimykotikum. Tragen Sie das Antibiotikum-Antimykotikum nach dem Abkühlen der gegossenen Agarplatten auf, indem Sie es mit einem Zellspreizer über die Oberfläche der Platte verteilen. Verschließen Sie die Agarplatte mit Parafilm, um das Austrocknen von Agar zu verhindern.
   HINWEIS: Versuchen Sie nicht, injizierte Embryonen nach Injektionen in eine Kolonie zurückzubringen, da Arbeiter die meisten injizierten Embryonen zerstören können. Das Überleben wird daher optimiert, indem sich Embryonen auf Agarplatten außerhalb einer normalen Kolonieumgebung entwickeln können.
3. Die Agarplatten bei 25 °C ca. 4 Wochen inkubieren. Überprüfen Sie regelmäßig das Schlüpfen.
4. Sobald der erste Embryo zu einer Larve geschlüpft ist, bringen Sie alle Embryonen und Larven mit ein paar jungen Krankenschwestern in einen Nistkasten zurück, um sich um die Jungtiere zu kümmern. Füttern Sie mit Grillen, die von einer größeren Wildtypkolonie vorgestochen wurden, entfernen Sie Abfallprodukte und fügen Sie Wasser nach dem gleichen Protokoll hinzu, das in Abschnitt 1 beschrieben wird.
   HINWEIS: Kleine Boxen (9,5 x 9,5 cm²) sind ideal für solche Kolonien. H. saltator vermehrt sich gut in Gefangenschaft. Daher können mutierte Embryonen bis zum Erwachsenenalter aufgezogen werden. Die Isolierung mutierter Erwachsener induziert den Übergang in das reproduktive Gamergate-Stadium. Kontrollierte Kreuzungen werden verwendet, um mutierte Kolonien mit heterozygoten oder homozygoten Individuen zu etablieren (Abbildung 5).

Ergebnisse

Mit dem hier bereitgestellten Protokoll wurde die Genom-Editierung in Harpegnathos-saltator-Embryonen erfolgreich durchgeführt. Diese Ergebnisse wurden durch Polymerase-Kettenreaktion und pGEM-Klonierung von DNA validiert, die aus injizierten Embryonen extrahiert wurde, gefolgt von DNA-Sequenzierung. Die Effizienz der somatischen Mutagenese mit diesem Protokoll erreichte etwa 40%. F1-mutierte Männchen wurden mit Wildtyp-Weibchen verpaart, um heterozygote F2-Weibchen zu produzie...

Diskussion

Die Entwicklung der Eusozialität bei Insekten, einschließlich Ameisen, Bienen, Wespen und Termiten, hat zum Auftreten neuer Verhaltens- und morphologischer Merkmale geführt, von denen viele durch eine Kombination von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst werden^sollen 1,2,3,4. Leider wurde die Attraktivität und Nützlichkeit eusozialer Insekten als Forschungsmodelle auf dem Gebiet der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030