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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Resumen

El gusano del algodón, Helicoverpa armigera, es una de las plagas más destructivas del mundo. Una combinación de genética molecular, fisiología, genómica funcional y estudios de comportamiento ha hecho de H. armigera una especie modelo en Lepidoptera Noctuidae. Para estudiar las funciones in vivo y las interacciones entre diferentes genes, la tecnología de edición del genoma agrupadas regularmente interespaciadas de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / proteína 9 asociada (Cas9) es un método conveniente y efectivo utilizado para realizar estudios genómicos funcionales. En este estudio, proporcionamos un método sistemático paso a paso para completar la eliminación de genes en H. armigera utilizando el sistema CRISPR / Cas9. El diseño y la síntesis del ARN guía (ARNg) se describen en detalle. Luego, se resumen los pasos posteriores que consisten en el diseño de cebadores específicos de genes para la creación de ARN guía (ARNg), la recolección de embriones, la microinyección, la cría de insectos y la detección de mutantes. Finalmente, se proporcionan consejos y notas para la solución de problemas para mejorar la eficiencia de la edición de genes. Nuestro método servirá como referencia para la aplicación de la edición del genoma CRISPR/Cas9 en H. armigera así como en otras polillas lepidópteras.

Introducción

La aplicación de la tecnología de edición del genoma proporciona una herramienta eficiente para lograr mutantes de genes objetivo en diversas especies. La aparición del sistema agrupado de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)/proteína 9 asociada (Cas9) agrupadas regularmente interespaciadas proporciona un método novedoso para manipular genomas1. El sistema CRISPR/Cas9 consiste en un ARN guía (ARNg) y la endonucleasa Cas92,3, mientras que el ARNg se puede dividir en dos partes, un ARN CRISPR complementario objetivo (ARNcr) y un ARNcr transactivante (ARNtra). El ARNg se integra con la endonucleasa Cas9 y forma una ribonucleoproteína (RNP). Con el ARNg, la endonucleasa Cas9 se puede dirigir a un sitio específico del genoma a través de la complementación de la base. Los dominios RuvC y HNH del Cas9 escinden el sitio objetivo del genoma tres bases antes de la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) y crean una ruptura de doble hebra (DSB). La escisión del ADN se puede reparar a través de dos mecanismos, la unión final no homóloga (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR)4. La reparación del DSB introduce inserciones o deleciones como una forma de inactivar el gen objetivo, lo que podría causar una pérdida completa de la función del gen. Por lo tanto, la heredabilidad y la especificidad del sistema CRISPR/Cas9 lo convierten en un método robusto para caracterizar las funciones genéticas in vivo y analizar las interacciones génicas5.

Con numerosos méritos, el sistema CRISPR/Cas9 se ha aplicado a diversos campos, incluyendo la biomedicina6,7, la terapia génica8,9 y la agricultura10,11,12, y se ha utilizado para diversos sistemas biológicos incluyendo microorganismos13, plantas14,15, nematodos16 y mamíferos17 . En los invertebrados, muchas especies de insectos han sido sometidas a la edición del genoma CRISPR/Cas9, como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y más allá18,19,20,21,22.

Helicoverpa armigera es una de las plagas más destructivas a nivel mundial23, y daña numerosos cultivos, incluyendo algodón, soja y sorgo24,25. Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación, el genoma de H. armigera, así como el de una serie de especies de insectos lepidópteros, han sido secuenciados completamente26,27,28,29. En los últimos años se han identificado y caracterizado un gran número de genes de resistencia y receptores olfativos de estos insectos19,27,28,29. Se han identificado algunos genes relacionados con la resistencia en H. armigera, como los genes que codifican para cadherina30, un transportador de casete de unión a ATP31,32, así como HaTSPAN133. La eliminación de estos genes utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 da como resultado un alto nivel de resistencia a la toxina Bacillus thuringiensis (BT) en cepas susceptibles. Además, Chang et al. (2017) eliminaron un receptor de feromonas, lo que validó su función significativa en la regulación del tiempo de apareamiento19. Estos informes sugieren que CRISPR / Cas9 puede actuar como una herramienta efectiva para estudiar la función génica in vivo en los sistemas de insectos. Sin embargo, un procedimiento detallado para la modificación de CRISPR / Cas9 en sistemas de insectos sigue siendo incompleto, lo que limita su rango de aplicación en genómica funcional de insectos.

Aquí, presentamos un protocolo para eliminar un gen funcional en H. armigera utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Se proporciona un protocolo detallado paso a paso, que incluye el diseño y la preparación de cebadores específicos de genes para la producción de ARNg, la recolección de embriones, la microinyección, la cría de insectos y la identificación de mutantes. Este protocolo sirve como una referencia valiosa para manipular cualquier gen funcional en H. armigera y se puede extender a otras especies de lepidópteros.

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Protocolo

1. Diseño de cebadores específicos de genes y preparación de sgRNA

  1. Verificar una región genómica conservada en el gen de interés mediante análisis de amplificación y secuenciación por PCR. Amplificar el gen diana del ADN genómico de H. armigera y distinguir los exones e intrones.
    NOTA: La especificidad de la secuencia del sitio guía es necesaria para evitar la edición de genes fuera del objetivo. Busque posibles sitios guía en los exones que están cerca de los 5' UTR del gen. Entonces, es importante asegurarse de que el gen no funcione por completo. Un resumen de la ruta de flujo para la preparación de sgRNA se ilustra en la Figura 1.
  2. Elija los objetivos de sgRNA. Utilice el sitio web en línea crispor CRISPOR (Versión 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) para buscar posibles sitios guía en los exones cercanos a los 5' UTR del gen. Introduzca la secuencia de exones en el cuadro de texto y seleccione el genoma objetivo de Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Elija la opción de motivo adyacente del protoespaciador (PAM) de "20 bp-NGG" y deje las otras configuraciones en los parámetros predeterminados de acuerdo con los manuales de usuario de los sitios web.
  3. Compare las secuencias de guía predichas desde el software y elija la secuencia de guía con la mayor eficiencia predicha y la menor cantidad de desajustes para mejorar la eficiencia de edición y reducir la edición fuera del objetivo. Se recomienda una secuencia guía de 20 pb que contenga uno o dos G en el UTR de 5 ', ya que podría aumentar la eficiencia de corte.
    NOTA: También se recomienda un par de gRNAs en todas las regiones exónicas para obtener una eliminación de segmentos grandes, lo que simplifica la detección de mutantes en pasos posteriores. Asegúrese de que la distancia de espaciado entre las dos secuencias de guía seleccionadas sea de al menos 100 pb. En este protocolo, elegimos la proteína SpCas9 de uso común, que reconoce el motivo NGG. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la secuencia guía que carece de G también es aceptable al elegir el promotor T7 porque el promotor agrega una G a los 5' UTR de la secuencia.
  4. Diseñar oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás. Establezca el orden de la secuencia en 5'-20 pb de la secuencia de guía-NGG-3' y complemente inversamente la secuencia de la guía. Agregue la secuencia promotora T7 a la secuencia de guía de hebras hacia adelante y hacia atrás, respectivamente de acuerdo con la guía del usuario del kit de síntesis de ARNg.
    NOTA: La secuencia PAM NGG debe excluirse de la secuencia de oligonucleótidos.
  5. Generar el sgRNA utilizando el kit de síntesis de gRNA. Este proceso incluye tres pasos: ensamblaje de plantillas de ADN, transcripción in vitro y purificación de sgRNA (Figura 2). Realice cada paso de acuerdo con las instrucciones del usuario.

2. Preparación y recolección de embriones

  1. Separar las pupas macho y hembra como se describe en Hongtao et al.34 y segregarlas en dos jaulas de red diferentes. Después de la eclosión, aliméntelos ~ 30 ml de solución de azúcar blanco al 10% (p / v) en algodón absorbente en una placa de Petri.
    NOTA: Se disolvieron 3 g de azúcar blanco en 30 ml de agua estéril para preparar la solución de azúcar blanco al 10% (p/v).
  2. Seleccione 50 individuos sanos de machos de 3 días de edad y hembras de 2 días de edad, respectivamente, y mézclelos en una jaula de red limpia. Coloque un trozo de algodón que contenga una solución de azúcar al 10% (p/v) en la jaula y mantenga el algodón húmedo. Cubra las jaulas de la red con una gasa y fije la gasa con una banda elástica. Rocíe agua sobre la gasa para mantenerla húmeda.
  3. Permita que las polillas macho y hembra seleccionadas en el paso 2 se apareen completamente y observen la cantidad de puesta de huevos.
    NOTA: El pico de oviposición de H. armigera aparece después de las 9:00 p.m. Por lo tanto, se debe considerar el momento del apareamiento para garantizar un número suficiente de huevos en los pasos posteriores. En el pico de la oviposición, reemplace la gasa con un paño negro y habilite la oviposición libre durante 30 minutos. Reemplace el paño negro cada 30 minutos para recolectar huevos frescos (Figura 3A).
  4. Cortar el paño negro en parches de forma irregular con un tamaño de 3 mm aproximadamente. Asegúrese de que haya más huevos en cada parche.
    NOTA: Evite elegir huevos arrugados, ya que generalmente no están fertilizados.
  5. Pegue la cinta de doble cara en un portaobjetos de microscopio (25 mm x 75 mm) (Figura 3B). Con fórceps, pegue los parches con huevos en una fila en la superficie de la cinta de doble cara. Presione el margen de cada parche para asegurarse de que se adhieran firmemente a la cinta. Recolectar 50-100 huevos por portaobjetos de microscopio (Figura 3C).
    NOTA: Los parches deben cubrir toda la superficie de la cinta de doble cara, de lo contrario, la larva que eclosiona tendrá dificultades para arrastrarse.
  6. Antes de la microinyección, mantenga el portaobjetos del microscopio sobre hielo para retrasar el desarrollo de los embriones.

3. Microinyección de embriones

  1. Prepare la aguja tirando de un vidrio capilar con un extractor de micropipetas (Figura 4A). Ajuste el calor a 540, tire a 80, Vel a 75, el tiempo a 170 y la presión a 450. Moler la punta de la aguja con una micro amoladora. La aguja ideal muestra una punta de borde afilado (Figura 4B).
  2. Preparación de soluciones inyectables. Añadir 2 μL de proteína Cas9 comercializada (1 mg/mL) y sgRNA (concentración final de 300-500 ng/μL) al agua libre de RNasa en un tubo de PCR para obtener una mezcla de volumen de 10 μL. El volumen de sgRNA depende de su concentración. Mezclar bien mediante pipeteo y ponerlo sobre hielo.
    NOTA: Todas las puntas de pipeta y tubos de PCR utilizados en este paso están libres de RNasa.
  3. Establezca los parámetros del microinyector electrónico. Ajuste la presión de inyección (pi) a 1.500 hPa, el tiempo de inyección (ti) a 0,1 s y la presión de compensación (pc) a 30 hPa.
  4. Cargue 2 μL de la mezcla en una aguja con una punta de pipeta de micro cargador. El aire residual en la punta de la aguja debe agotarse tanto como sea posible.
  5. Conecte la aguja de inyección a un micromanipulador y asegúrese de una conexión estrecha entre las dos partes.
  6. Coloque un portaobjetos en una placa de Petri (100 mm) y colóquelos en el escenario del microscopio (Figura 5A).
  7. Ajuste la posición de la punta de la aguja bajo un microscopio de luz hasta que tanto la punta de la aguja como los embriones sean visibles bajo el microscopio (Figura 5B).
  8. Ajuste el volumen de la gota. Presione el pedal y observe la caída de líquido en la punta de la aguja. Ajuste la presión de inyección del microinyector hasta que el volumen de una gota líquida sea aproximadamente una décima parte del volumen de los embriones.
    NOTA: La calidad de la aguja de inyección es vital para la tasa de supervivencia de los embriones.
  9. Inserte cuidadosamente la punta de la aguja en el hemisferio superior de un embrión en un ángulo de 45 grados (Figura 5C). Presione el pedal para entregar la mezcla en el embrión. La inyección conduce a una ligera expansión del embrión. Retraiga la aguja inmediatamente del embrión y mueva la placa de Petri con una mano hasta que el siguiente embrión esté cerca de la aguja e inyecte al siguiente embrión con el mismo procedimiento.
    NOTA: La salida citoplasmática en el agujero de alfiler es aceptable. Si la fuga citoplasmática es excesiva, ajuste el ángulo de la aguja a un ángulo más severo hasta que se controle la salida de líquido.
  10. Inyecte al menos 300 embriones para asegurar una cantidad suficiente de eclosión. Cubra la tapa de la(s) placa(s) de Petri después de la inyección.
    NOTA: El tiempo desde la oviposición hasta la inyección de los 50-100 embriones está limitado a 2 h. La mayoría de los embriones todavía están en la etapa de una célula dentro de este marco de tiempo. En general, es útil repetir el procedimiento de oviposición durante la inyección de embriones para promover la eficiencia.

4. Cría de insectos después de la inyección

  1. Propagación de embriones G0.
    1. Incubar los embriones al 60% de humedad relativa y 28°C en una caja climática artificial con 14 h de luz/10 h de oscuridad.
    2. Comprobar el desarrollo de embriones diariamente después de la inyección. Cuando el color de la superficie de los embriones se haya oscurecido, coloque la dieta artificial en la placa de Petri alrededor del portaobjetos del microscopio y verifique el desarrollo de los embriones cada 12 h.
      NOTA: La dieta artificial se prepara como se describe en Wu et al.35 y Jha et al.36.
    3. Prepare placas de cultivo de 24 pocillos y llene cada pozo hasta un tercio de su capacidad volumétrica con dieta artificial.
    4. Seleccione las larvas de eclosión (Figura 5D) con un pincel pequeño y transfiéralas a la placa de cultivo de 24 pocillos. Inserte una larva por pozo para asegurarse de que cada larva tenga suficiente alimento para sobrevivir.
      NOTA: Las larvas de H. armigera fueron criadas individualmente en cada pozo ya que generalmente se canibalizaban entre sí.
  2. Cría de larvas G0
    1. Criar las larvas en las mismas condiciones que los embriones.
    2. Revise las larvas eclosionadas todos los días. Cuando las larvas crecen a la tercera etapa instar, transfiera cada larva a una nueva dactiletra de vidrio, llenando una quinta parte del volumen con dieta artificial.
    3. Aproximadamente 12 días después de la incubación, las larvas maduras deben comenzar a pupar.
    4. Las pupas maduras G0 se distinguen en función del sexo y se colocan en jaulas separadas antes de la eclosión. También se preparan las pupas de la misma edad de tipo salvaje.
  3. G0 adultos criados
    1. Verifique la eclosión de pupas silvestres y mutantes diariamente.
    2. Transfiera los adultos machos G0 recién eclosados y los adultos hembras de tipo salvaje a una jaula de red fresca y haga que la proporción entre G0 y el tipo salvaje sea de aproximadamente 1: 1. Suministrarles una solución de azúcar al 10% (p/v) dejada caer en bolas de algodón.
    3. Insectos de retaguardia utilizando el método de rutina anterior hasta la pupación de la generación uno (G1).
    4. Usando una dactiletra, transfiera el par único de adultos G1 recién eclosados a un frasco de plástico (13 cm x 12 cm x 12 cm) suministrado con una solución de azúcar al 10% (p/v). Cubra cada frasco con una gasa. Tome alrededor de 50 pares de adultos G1 en total.
      NOTA: La exclusión de las polillas hembra es anterior a la de las polillas macho. En general, un macho de 3 días de edad y una hembra de 2 días de edad son sexualmente maduros y están listos para aparearse. Los adultos recién eclosionados no se aparearán en su primer período de luz sin alimentarse.
    5. Recoja a los adultos G1 en un frasco de plástico después de que hayan puesto huevos. Coloque cada polilla adulta en un tubo de centrífuga de 1.5 ml.

5. Detección de mutantes knock-out

  1. Diseñe un par de cebadores que abarquen el sitio truncado previsto. Los cebadores deben establecerse a una distancia de al menos 50 pb a cada lado (aguas arriba y aguas abajo) del sitio objetivo.
    NOTA: Los cebadores para la identificación de la secuencia objetivo a menudo cubren grandes tramos para amplificarse de manera eficiente.
  2. Realizar la reacción de PCR utilizando los cebadores de genotipado con ADN genómico extraído en la sección 1. Realizar ciclo de PCR a 95 °C durante 20 s; 35 ciclos de 95 °C durante 20 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 1 min; 72 °C durante 5 min, y 4 °C en espera. Verifique el producto de reacción a través del gel de agarosa al 1% (p/v). El par de cebadores de detección seleccionados fue confirmado por la calidad del producto de PCR. Si las bandas son evidentes y específicas, los cebadores podrían usarse para una mayor detección de mutantes basada en el tamaño del amplicón.
  3. Pantalla para posibles individuos editados. Retire una pata trasera con cuidado usando fórceps y coloque cada pierna en un tubo de matriz de lisado, respectivamente. Etiquete el tubo de la matriz de lisado consistente con el número en la dactiletra de vidrio.
  4. Homogeneizar la pata trasera utilizando un homogeneizador de tejido. Establezca la velocidad en 6.0 m / s y el tiempo en 60 s. Extraiga el ADN genómico de la muestra homogeneizada utilizando un kit de extracción comercial de gDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  5. Amplificar el segmento de genes utilizando cebadores de genotipado con las mismas condiciones de reacción de PCR que se describen en el paso 2. Confirmar el genotipo mediante un servicio de secuenciación de genes. Una vez que se detectaron los genotipos mutantes G1 (objetivo del mismo sitio) contenidos en el mismo frasco, mantenga la progenie G1 y cámbiele el nombre a generación dos (G2).
  6. Coloque a los individuos G1 del mismo genotipo en una jaula de red. Cruce las progenies G1 y continúe examinando utilizando los mismos métodos.
  7. Amplificar el segmento génico y confirmar el genotipo con el mismo procedimiento descrito en el paso 2. Obtener líneas homocigotas G2 y mantener la línea mutante knock-out.

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Resultados

Este protocolo proporciona pasos detallados para obtener líneas de eliminación de genes de H. armigera utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. Los resultados representativos obtenidos por este protocolo se resumen para la selección de gDNA, la recolección e inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes.

En este estudio, el sitio objetivo de nuestro gen de interés se localizó en su segund...

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Discusión

La aplicación del sistema CRISPR/Cas9 ha proporcionado un potente soporte técnico para el análisis de la función génica y la interacción entre varios genes. El protocolo detallado que presentamos aquí demuestra la generación de un mutante homocigoto en H. armigera a través de la edición del genoma CRISPR/Cas9. Este procedimiento confiable proporciona una forma sencilla para la mutagénesis genética dirigida en H. armigera.

La elección de los sitios diana CRISPR po...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31725023, 31861133019 a GW y 31171912 a CY).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2kb DNA ladderTransGen BiotechBM101
Capillary GlassWorld Precision Instrucments504949referred to as "capillary glass" in the protocol
Double Sided TapeMinnesota Mining and Manufacturing Corporation665
Eppendorf FemtoJet 4i MicroinjectorEppendorf CorporateE5252000021
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulatorEppendorf Corporate5192000051
Eppendorf Microloader Pipette TipsEppendorf CorporateG2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis KitThermo Fisher ScientificA29377
Microscope SlideSail Brand7105
Olympus MicroscopeOlympus CorporationSZX16
PrimeSTAR HS (Premix)Takara Biomedical TechnologyR040used for mutant detection
Sutter Micropipette PullerSutter Instrument CompanyP-1000
TIANamp Genomic DNA KitTIANGEN CorporateDP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36499

Referencias

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