Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Resumo

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Resumo

O algodão bollworm, Helicoverpa armigera, é uma das pragas mais destrutivas do mundo. Uma combinação de genética molecular, fisiologia, genômica funcional e estudos comportamentais fez de H. armigera uma espécie modelo em Lepidoptera Noctuidae. Para estudar as funções in vivo e interações entre diferentes genes, agrupadas regularmente repetições palindômicas curtas interespaçadas (CRISPR)/ proteína associada 9 (Cas9) é um método conveniente e eficaz usado para a realização de estudos genômicos funcionais. Neste estudo, fornecemos um método sistemático passo a passo para completar o nocaute genético em H. armigera usando o sistema CRISPR/Cas9. O design e a síntese do guia RNA (gRNA) são descritos em detalhes. Em seguida, são resumidas as etapas subsequentes que consistem no projeto de primer específico de genes para criação de RNA guia (gRNA), coleta de embriões, microinjeção, criação de insetos e detecção de mutantes. Finalmente, conselhos e notas de solução de problemas são fornecidos para melhorar a eficiência da edição de genes. Nosso método servirá como referência para a aplicação da edição de genomas CRISPR/Cas9 em H. armigera , bem como outras mariposas lepidopteranas.

Introdução

A aplicação da tecnologia de edição de genomas fornece uma ferramenta eficiente para alcançar mutantes de genes-alvo em diversas espécies. O surgimento do sistema de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/proteína associada 9 (Cas9) fornece um novo método para manipular ^genomas1. O sistema CRISPR/Cas9 consiste em um RNA guia (gRNA) e o endonuclease ^Cas92,3, enquanto o gRNA pode ser ainda dividido em duas partes, um RNA CRISPR complementar de destino (crRNA) e um crRNA trans-ativante (tracrRNA). O gRNA se integra com a endonuclease Cas9 e forma uma ribonucleoproteína (RNP). Com o gRNA, o cas9 endonuclease pode ser direcionado para um local específico do genoma via complementação base. Os domínios RuvC e HNH do Cas9 têm o local alvo do genoma três bases antes da sequência protoespacial adjacente (PAM) e criam uma quebra de dois fios (DSB). O decote de DNA pode então ser reparado através de dois mecanismos, a junção final não homólogo (NHEJ) ou o reparo direcionado à e homologia (HDR)⁴. O reparo do DSB introduz inserções ou exclusões como forma de inativar o gene alvo, causando potencialmente uma perda completa da função genética. Assim, o herediável e a especificidade do sistema CRISPR/Cas9 fazem dele um método robusto para caracterizar funções genéticas in vivo e analisar interações ^genéticas5.

Com inúmeros méritos, o sistema CRISPR/Cas9 tem sido aplicado a diversos campos, incluindo ^{biomedicina6,7}, terapia ^genética8,9 e ^{agricultura10,11,12}, e tem sido utilizado para vários sistemas biológicos, incluindo microrganismos13, ^plantas14,15, nematodes16 e ^mamíferos17 . Nos invertebrados, muitas espécies de insetos foram submetidas à edição do genoma CRISPR/Cas9, como a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e além ^de 18,19,20,21,22.

A helicoverpa armigera é uma das pragas mais destrutivas do ^mundo23, e danifica inúmeras culturas, incluindo algodão, soja e sorgo24,25. Com o desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento, o genoma de H. armigera, bem como o de uma gama de espécies de insetos Lepidoptera, foram sequenciados completamente26,27,28,29. Um grande número de genes de resistência e receptores olfativos foram identificados e caracterizados a partir desses insetos nos últimos anos19,27,28,29. Alguns genes relacionados à resistência foram identificados em H. armigera, como os genes codificados para cadherin30, um transporte de de ligação ^ATP31,32, bem como HaTSPAN133. O nocaute desses genes usando a tecnologia CRISPR/Cas9 resulta em um alto nível de resistência à toxina Bacillus thuringiensis (BT) em cepas suscetíveis. Além disso, Chang et al. (2017) derrubaram um receptor de feromônio, que validou sua função significativa na regulação do tempo de acasalamento19. Esses relatórios sugerem que o CRISPR/Cas9 pode atuar como uma ferramenta eficaz para estudar a função genética in vivo em sistemas de insetos. No entanto, um procedimento detalhado para a modificação crispr/cas9 em sistemas de insetos permanece incompleto, o que limita sua gama de aplicação em genômica funcional de insetos.

Aqui, apresentamos um protocolo para eliminar um gene funcional em H. armigera usando o sistema CRISPR/Cas9. Um protocolo passo-a-passo detalhado é fornecido, incluindo o projeto e a preparação de primers específicos de genes para produção de gRNA, coleta de embriões, microinjeção, criação de insetos e identificação de mutantes. Este protocolo serve como uma referência valiosa para manipular quaisquer genes funcionais em H. armigera e pode ser estendido a outras espécies de Lepidoptera.

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Protocolo

1. Projeto de primers específicos de genes e preparação de sgRNA

1. Verifique uma região genômica conservada no gene de interesse através de análises de amplificação e sequenciamento do PCR. Amplificar o gene alvo do DNA do genoma de H. armigera e distinguir os exons e introns.
   NOTA: A especificidade da sequência do site de guias é necessária para evitar a edição de genes fora do alvo. Pesquise possíveis locais-guia nos exons estão próximos do UTR de 5' do gene. Então, é importante ter certeza de que o gene é completamente não funcional. Um resumo do caminho de fluxo para a preparação do sgRNA é ilustrado na Figura 1.
2. Escolha os alvos sgRNA. Use o site online CRISPR CRISPOR (Versão 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) para procurar possíveis sites-guia nos exons próximos ao UTR de 5' do gene. Insira a sequência de exon na caixa de texto e selecione o genoma alvo para a armigera Helicoverpa (Harm_1.0). Escolha a opção de motivo adjacente protoespaço (PAM) de "20 bp-NGG" e deixe as outras configurações nos parâmetros padrão de acordo com os manuais de usuário dos sites.
3. Compare as sequências de guia previstas do software e escolha a sequência de guias com a maior eficiência prevista e menos incompatibilidades para melhorar a eficiência de edição e reduzir a edição fora do alvo. Recomenda-se uma sequência de guia de 20 bps contendo um ou dois G no UTR de 5'', pois poderia aumentar a eficiência de corte.
   NOTA: Um par de gRNAs em regiões exon também são recomendados para obter uma grande exclusão do segmento, o que simplifica a detecção de mutantes em etapas posteriores. Certifique-se de que a distância de espaçamento entre as duas sequências guia selecionadas seja de pelo menos 100 bp. Neste protocolo, escolhemos a proteína SpCas9 comumente usada, que reconhece o motivo NGG. De acordo com a instrução do fabricante, a sequência de guias sem G também é aceitável na escolha do promotor T7 porque o promotor adiciona um G ao UTR de 5' da sequência.
4. Projete para frente e inverta oligonucleotídeos. Defina a ordem de sequência de sequência de 5'-20 bp-NGG-3' e inverta complemente a sequência guia. Adicione a sequência de promotor T7 à sequência de guia de fio para frente e reversa, respectivamente, de acordo com o guia do usuário do kit de síntese gRNA.
   NOTA: A sequência PAM NGG deve ser excluída da sequência de oligonucleotídeos.
5. Gere o sgRNA usando o kit de síntese gRNA. Este processo inclui três etapas: montagem de modelo de DNA, transcrição in vitro e purificação de sgRNA (Figura 2). Execute cada etapa de acordo com as instruções do usuário.

2. Preparação e coleta de embriões

1. Separar pupas machos e fêmeas como descrito por Hongtao et ^al.34 e segregar-os em duas gaiolas diferentes. Após a eclosão, alimente-os ~30 mL de 10% (w/v) solução de açúcar branco em algodão absorvente em uma placa de Petri.
   NOTA: 3 g de açúcar branco foi dissolvido em 30 mL de água estéril para preparar a solução de açúcar branco de 10% (w/v).
2. Selecione 50 indivíduos saudáveis de machos de 3 dias de idade e mulheres de 2 dias de idade, respectivamente, e misture-os em uma gaiola de rede limpa. Coloque um pedaço de algodão contendo 10% (w/v) solução de açúcar na gaiola e mantenha o algodão úmido. Cubra as gaiolas com gaze e conserte a gaze com um elástico. Pulverize a água na gaze para manter a úmida.
3. Permita que as mariposas masculinas e femininas selecionadas na etapa 2 acasalem completamente e observem a quantidade de fixação de ovos.
   NOTA: O pico de oviposição de H. armigera aparece depois das 21:00.m. Portanto, o tempo do acasalamento deve ser considerado para garantir um número suficiente de ovos nas etapas subsequentes. No pico da oviposição, substitua a gaze por um pano preto e habilite a oviposição livre por 30 minutos. Substitua o pano preto a cada 30 minutos para coletar ovos frescos (Figura 3A).
4. Corte o pano preto em manchas de forma irregular com um tamanho de 3 mm aproximadamente. Certifique-se de mais ovos em cada remendo.
   NOTA: Evite escolher ovos enrugados, pois geralmente não são fertilizados.
5. Cole fita dupla face em um slide de microscópio (25 mm x 75 mm) (Figura 3B). Usando fórceps, cole as manchas com ovos em uma fileira na superfície da fita de dois lados. Pressione a margem de cada patch para ter certeza de que eles grudam firmemente na fita. Coletar 50-100 ovos por slide de microscópio (Figura 3C).
   NOTA: As manchas precisam cobrir toda a superfície da fita de dupla face, caso contrário, a larva de eclosão terá dificuldade para rastejar para fora.
6. Antes da microinjeção, mantenha o microscópio deslizando no gelo para atrasar o desenvolvimento de embriões.

3. Microinjeção de embriões

1. Prepare a agulha puxando um vidro capilar usando um puxador de micropipette (Figura 4A). Definir calor para 540, Puxar para 80, Vel para 75, Tempo para 170 e Pressão para 450. Aterrar a ponta da agulha usando um micro moedor. A agulha ideal mostra uma ponta afiada (Figura 4B).
2. Preparação de soluções de injeção. Adicione 2 μL de proteína Cas9 comercializada (1 mg/mL) e sgRNA (300-500 ng/μL de concentração final) à água livre de RNase em um tubo PCR para obter uma mistura de volume de 10 μL. O volume de sgRNA depende de sua concentração. Misture bem por pipetting e coloque-o no gelo.
   NOTA: Todas as pontas de pipeta e tubos PCR usados nesta etapa são livres de RNase.
3. Defina os parâmetros do microinjetor eletrônico. Defina a pressão de injeção (pi) para 1.500 hPa, o tempo de injeção (ti) para 0,1 s e a pressão de compensação (pc) a 30 hPa.
4. Carregue 2 μL da mistura em uma agulha usando uma ponta de pipeta de micro carregadeira. O ar residual na ponta da agulha deve estar esgotado o máximo possível.
5. Conecte a agulha de injeção a um micromanípulo e garanta uma conexão apertada entre as duas partes.
6. Coloque um slide em uma placa de Petri (100 mm) e coloque-os no palco do microscópio (Figura 5A).
7. Ajuste a posição da ponta da agulha sob um microscópio leve até que tanto a ponta da agulha quanto os embriões estejam visíveis sob o microscópio (Figura 5B).
8. Ajuste o volume da gota. Pressione o pedal e observe a queda líquida na ponta da agulha. Ajuste a pressão de injeção do microinjetor até que o volume de uma gota líquida seja de cerca de um décimo do volume dos embriões.
   NOTA: A qualidade da agulha de injeção é vital para a taxa de sobrevivência dos embriões.
9. Insira cuidadosamente a ponta da agulha no hemisfério superior de um embrião em um ângulo de 45 graus (Figura 5C). Pressione o pedal para entregar a mistura no embrião. A injeção leva a uma leve expansão do embrião. Retire a agulha imediatamente do embrião e mova a placa de Petri com uma mão até que o próximo embrião esteja próximo da agulha e injete o próximo embrião com o mesmo procedimento.
   NOTA: O fluxo de saída citoplasmica no orifício é aceitável. Se o vazamento citoplasmismo for demais, ajuste o ângulo da agulha para um ângulo mais severo até que a saída do fluido seja controlada.
10. Injete pelo menos 300 embriões para garantir uma quantidade suficiente de eclosão. Cubra a tampa da placa de Petri(es) após a injeção.
    NOTA: O tempo da oviposição à injeção dos 50-100 embriões é limitado a 2 h. A maioria dos embriões ainda estão no estágio de uma célula dentro deste período de tempo. Em geral, é útil repetir o procedimento de oviposição durante a injeção de embriões para promover a eficiência.

4. Criação de insetos pós-injeção

1. Propagação de embriões G0.
   1. Incubar os embriões a 60% de umidade relativa e 28°C em uma caixa de clima artificial com 14 h de luz/10h escura.
   2. Verifique o desenvolvimento de embriões diariamente após a injeção. Quando a cor superficial dos embriões escurecer, coloque dieta artificial na placa de Petri ao redor do slide do microscópio, e verifique o desenvolvimento de embriões a cada 12 h.
      NOTA: A dieta artificial é preparada conforme descrito por Wu et ^al.35 e Jha et ^al.36.
   3. Prepare placas de cultura de 24 poços e encha cada poço a um terço de sua capacidade volumétrica com dieta artificial.
   4. Escolha larvas de eclosão (Figura 5D) usando um pequeno pincel e transfira-as para a placa de cultura de 24 poços. Insira uma larva por poço para garantir que cada larva tenha comida suficiente para sobreviver.
      NOTA: As larvas de H. armigera foram criadas individualmente em cada poço, uma vez que geralmente canibalizaram umas às outras.
2. Criação de larvas G0
   1. Vire as larvas nas mesmas condições que os embriões.
   2. Verifique as larvas eclodidas todos os dias. Quando as larvas crescerem até o terceiro estágio instar, transfira cada larva para um novo dactylethrae de vidro, preenchendo um quinto do volume com dieta artificial.
   3. Aproximadamente 12 d após a incubação, as larvas maduras devem começar a filhote.
   4. As pupas maduras G0 são distinguidas com base no sexo e colocadas em gaiolas separadas antes da eclosão. As pupas da mesma idade do tipo selvagem também são preparadas.
3. G0 adultos rearmando
   1. Verifique a eclosão tanto do tipo selvagem quanto da pupae mutante diariamente.
   2. Transfira os recém-eclosed G0 adultos do sexo masculino e adultos do tipo selvagem em uma gaiola de rede fresca e faça a relação entre G0 e tipo selvagem em aproximadamente 1:1. Forneça-os com 10% (w/v) solução de açúcar descartada em bolas de algodão.
   3. Insetos traseiros usando o método de rotina acima até a pupação da geração um (G1).
   4. Usando um dactylethrae, transfira o par único recém-fechado de adultos G1 em um frasco plástico (13 cm x 12 cm x 12 cm) fornecido com solução de açúcar de 10% (w/v). Cubra cada pote com gaze. Pegue cerca de 50 pares de adultos G1 no total.
      NOTA: A eclosão de mariposas fêmeas antecede a das mariposas machos. Em geral, um homem de 3 dias e uma mulher de 2 dias estão sexualmente maduros e prontos para acasalar. Os adultos recém-fechados não acasalarão em seu primeiro período de luz sem se alimentar.
   5. Recolhe os adultos do G1 em um pote de plástico depois de colocarem ovos. Coloque cada mariposa adulta em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.

5. Detecção de mutantes nocaute

1. Projete um par de primers abrangendo o local truncado previsto. Os primers devem ser definidos a pelo menos 50 bp de distância em ambos os lados (rio acima e rio abaixo) do local alvo.
   NOTA: Os primers para a identificação da sequência de destino geralmente cobrem grandes faixas para amplificar eficientemente.
2. Realize a reação do PCR usando os primers genotipados com DNA de genoma extraído na seção 1. Realizar ciclismo PCR a 95 °C para 20 s; 35 ciclos de 95 °C para 20 s, 55 °C para 20 s, 72 °C por 1 min; 72 °C para 5 min e 4 °C em espera. Verifique o produto de reação através de 1% (p/v) gel de agarose. O par selecionado de primers de detecção foi confirmado pela qualidade do produto PCR. Se as bandas forem evidentes e específicas, os primers podem ser usados para detecção de mutantes com base no tamanho da amplicon.
3. Tela para indivíduos editados em potencial. Remova cuidadosamente uma perna traseira usando fórceps e coloque cada perna em um tubo de matriz de lise, respectivamente. Rotule o tubo de matriz de lise consistente com o número no dactylethrae de vidro.
4. Homogeneize a perna traseira usando um homogeneizador de tecido. Afina a velocidade para 6,0 m/s e o tempo para 60 s. Extrair o DNA genômico da amostra homogeneizada usando um kit comercial de extração de gDNA de acordo com as instruções do fabricante.
5. Amplie o segmento genético usando primers genotipagem com as mesmas condições de reação pcr descritas na etapa 2. Confirme o genótipo por um serviço de sequenciamento genético. Uma vez detectados genótipos mutantes G1 (alvo do mesmo local) contidos no mesmo frasco, mantenham a prole G1 e renomeiem-na como geração dois (G2).
6. Coloque g1 indivíduos do mesmo genótipo em uma gaiola de rede. Autocruze os progens do G1 e continue a tela usando os mesmos métodos.
7. Amplie o segmento genético e confirme o genótipo com o mesmo procedimento descrito na etapa 2. Obtenha linhas homozigous G2 e mantenha a linha mutante nocauteado.

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Resultados

Este protocolo fornece etapas detalhadas para a obtenção de linhas de knock-out genéticas de H. armigera usando a tecnologia CRISPR/Cas9. Os resultados representativos obtidos por este protocolo são resumidos para seleção de GDNA, coleta e injeção de embriões, criação de insetos e detecção de mutantes.

Neste estudo, o local alvo do nosso gene de interesse foi localizado em seu segundo exon (

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Discussão

A aplicação do sistema CRISPR/Cas9 forneceu poderoso suporte técnico para a análise da função genética e interação entre vários genes. O protocolo detalhado que apresentamos aqui demonstra a geração de um mutante homozigoto em H. armigera via edição de genomas CRISPR/Cas9. Este procedimento confiável fornece uma maneira simples de mutagênese genética direcionada em H. armigera.

A escolha dos locais-alvo do CRISPR pode afetar a eficiência da

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2kb DNA ladder	TransGen Biotech	BM101
Capillary Glass	World Precision Instrucments	504949	referred to as "capillary glass" in the protocol
Double Sided Tape	Minnesota Mining and Manufacturing Corporation	665
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector	Eppendorf Corporate	E5252000021
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf Corporate	5192000051
Eppendorf Microloader Pipette Tips	Eppendorf Corporate	G2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Microscope Slide	Sail Brand	7105
Olympus Microscope	Olympus Corporation	SZX16
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040	used for mutant detection
Sutter Micropipette Puller	Sutter Instrument Company	P-1000
TIANamp Genomic DNA Kit	TIANGEN Corporate	DP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36499