Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Resumen

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Resumen

El desarrollo adecuado del cerebro de los mamíferos se basa en un fino equilibrio de proliferación de células madre neurales y diferenciación en diferentes tipos de células neuronales. Este equilibrio está estrictamente controlado por la expresión génica que está afinada en múltiples niveles, incluyendo transcripción, post-transcripción y traducción. En este sentido, un creciente cuerpo de evidencia destaca un papel crítico de la regulación traslacional en la coordinación de las decisiones sobre el destino de las células madre neurales. El fraccionamiento de polisomas es una poderosa herramienta para la evaluación del estado traslacional del ARNM tanto a nivel global como individual. Aquí, presentamos una tubería interna de perfiles de polisoma para evaluar la eficiencia traslacional en las células de la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Describimos los protocolos para la preparación del gradiente de sacarosa, lisis tisular, ultracentrifugación y análisis basado en fraccionamientos del estado traslacional del ARNm.

Introducción

Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, las células madre neurales proliferan y se diferencian para generar neuronas y glia^1,2. La perturbación de este proceso puede conducir a alteraciones en la estructura y función cerebral, como se ve en muchos trastornos del neurodesarrollo^3,4. El comportamiento adecuado de las células madre neurales requiere la expresión orquestada de genes específicos^5. Si bien el control epigenético y transcripcional de estos genes ha sido estudiado intensamente, hallazgos recientes sugieren que la regulación genética a otros niveles también contribuye a la coordinación de la proliferación y diferenciación de células madre neuronales^6,7,8,9,10. Por lo tanto, abordar los programas de control traslacional avanzará en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la decisión del destino de las células madre neuronales y el desarrollo del cerebro.

Se han aplicado ampliamente tres técnicas principales con diferentes fortalezas para evaluar el estado traslacional del ARNM, incluyendo la elaboración de perfiles ribosomas, la purificación de afinidad ribosoma traducible (TRAP) y el perfilado de polisomas. La elaboración de perfiles ribosomas utiliza secuenciación de ARN para determinar fragmentos de ARNM protegidos por ribosomas, lo que permite el análisis global del número y la ubicación de los ribosomas traduciendo en cada transcripción para inferir indirectamente la tasa de traducción comparándola con la abundancia de transcripción¹¹. TRAP aprovecha las proteínas ribosomales etiquetadas con epitopos para capturar los mRNAs ribosomas unidos al ribosoma^12. Dado que las proteínas ribosomales etiquetadas se pueden expresar en tipos celulares específicos utilizando enfoques genéticos, TRAP permite el análisis de la traducción de una manera específica del tipo celular. En comparación, la elaboración de perfiles de polisomas, que utiliza el fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa para separar la porción libre y mal traducida (monosomas más ligeros) de aquellos que se traducen activamente por ribosomas (polisomas más pesados), proporciona una medición directa de la densidad ribosoma en el ARNm^13. Una ventaja que ofrece esta técnica es su versatilidad para estudiar la traducción de mRNA específica de interés, así como el análisis de translatome en todo el genoma^14.

En este artículo, describimos un protocolo detallado de perfilado de polisoma para analizar la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Utilizamos un sistema ensamblado en casa para preparar gradientes de densidad de sacarosa y recoger fracciones para aplicaciones posteriores. El protocolo presentado aquí se puede adaptar fácilmente para analizar otros tipos de tejidos y organismos.

Protocolo

Todo el uso de animales fue supervisado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Calgary. Los ratones CD1 utilizados para el experimento fueron comprados al proveedor comercial.

1. Preparación de soluciones

NOTA Para evitar la degradación del ARN, rocíe la mesa de trabajo y todos los equipos con solución de descontaminación RNase. Los consejos sin RNase se utilizan para el experimento. Todas las soluciones se preparan en agua sin RNase.

1. Preparar solución de material de cicloheximida (100 mg/ml) en DMSO y almacenar a -20 °C.
2. Prepare la solución de caldo de sacarosa de 2,2 M añadiendo 75,3 g de sacarosa al agua libre de RNase y rematando el volumen a 100 ml (para una preparación de gradiente ~16). La solución se puede mantener a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo.
3. Preparar solución de sal 10x (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl_2).
4. Preparar solución de persecución de sacarosa del 60% (w/v), que contenga 30 g de sacarosa, 5 ml de solución de sal de 10x y cubra el volumen hasta 50 ml con agua libre de RNase.
5. Opcionalmente, añadir una mota de bromophenol azul o aproximadamente 5 μL de 1% azul bromophenol en agua libre de RNase a la solución de persecución. 1.6. Almacene soluciones a 4 °C.

2. Preparación del gradiente de sacarosa

NOTA: La precisión en la preparación de gradientes de sacarosa es fundamental para obtener resultados consistentes y reproducibles.

1. Para preparar seis gradientes de sacarosa del 10-50%, diluya la solución de sacarosa de 2,2 M como en la Tabla 1.

Solución de sacarosa	10%	20%	30%	40%	50%
Sacarosa de 2,2 M	2 ml	4 ml	6 ml	8 ml	10 mL
Solución de sal 10 veces	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml
cicloheximida	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
Agua	11.5 mL	9,5 ml	7,5 ml	5,5 ml	3,5 ml
Volumen total	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL

Tabla 1: Diluciones de sacarosa para preparaciones de gradientes de sacarosa.

NOTA: Prepare siempre degradados de sacarosa en múltiplos de dos para equilibrar el peso durante la ultracentrifugación.

2. Limpie la aguja del extremo contundente metálico con la solución de descontaminación RNase. Enjuague brevemente los tubos ultracentrífugas, el tubo y la jeringa utilizando agua libre de RNase. Secar el aire los tubos de tal manera que no quede gota de agua en los tubos, ya que cualquier agua restante alterará la concentración de sacarosa.
3. Coloque la aguja metálica en el soporte de la abrazadera y el tubo centrífuga en la etapa motorizada. Para preparar los gradientes de forma consistente, se utilizó un sistema ensamblado en casa que contiene una etapa motorizada para sostener el tubo ultracentrífuga y una bomba de jeringa para inyectar soluciones de sacarosa(Figura 1, ver paso 9 para más detalles).
4. Llene una jeringa de 30 ml con ~16 ml de sacarosa al 10% (suficiente para seis gradientes), colóquela en la bomba de jeringa y conéctelo a la aguja. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa, el tubo y la aguja. Limpie la punta de la aguja para eliminar cualquier solución residual.
5. Mueva la etapa motorizada hacia arriba de tal forma que la punta de la aguja toque el centro del tubo en la parte inferior.
6. Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de 2 ml/min para un volumen de 2,3 ml.
7. Después de dispensar 2,3 ml de solución de sacarosa al 10%, baje la etapa motorizada y repita el proceso para los seis gradientes.
8. Repita los pasos 2.4-2.7 para agregar una solución de sacarosa del 20% a la parte inferior de los tubos, seguida de soluciones de sacarosa del 30%, 40% y 50% de manera similar.
9. Después de la preparación del gradiente, selle el tubo ultracentrífuga usando una película de parafina.
10. Deje los tubos durante la noche a 4 °C de tal manera que las diferentes capas de sacarosa se difundan juntas para dar un gradiente continuo.

3. Disección de tejidos

NOTA: Los ratones embarazadas fueron eutanasiados por la dislocación cervical precedida por anestesia con un 5% de isoflurano.

1. Recoge embriones de ratón CD1 en el día embrionario 12, u otros puntos de tiempo según sea necesario, y coloca embriones en una placa de Ø 10 cm que contiene la Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hank helada en hielo para retener la viabilidad celular.
2. Bajo el alcance de disección, transfiera un embrión a una placa de Ø 6 cm que contenga HBSS helada.
3. Utilice agujas de 21-23 G para fijar la posición de la cabeza penetrando a través de los ojos en un ángulo de aproximadamente 45° y aplique fuerza para asegurarse de que las agujas estén fijas en la placa (Figura 2A).
4. Utilice fórceps no.5 para eliminar la piel y el cráneo, desde el centro hasta los lados.
5. Utilice fórceps para cortar las bombillas olfativas y eliminar las meninges para exponer los tejidos corticales.3.6.Use fórceps curvas para cortar los tejidos corticales en 2-3 ml de medio neurobástico sobre hielo (Figura 2B). Alarse tejidos corticales de diferentes embriones según sea necesario. Los tejidos de 8-10 embriones generalmente dan ~200 μg de ARN total.

4. Lisis celular

1. El día de la disección de tejidos, prepare el amortiguador de lisis celular fresca como se describe en la Tabla 2.

solución	Concentración final	volumen
Tris-HCl (pH 7.5)	20 mM	100 μL
Kcl	100 mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
Tritón X-100	1% (v/v)	500 μL
Desoxicolato de sodio	0,5% (w/v)	500 μL
Dithiothreitol (TDT)	1 mM	5 μL
cicloheximida	100 μg/ml	5 μL
RNase agua libre		Recarga hasta 5 ml
total	5 ml	5 ml

Tabla 2: Preparación del búfer de lisis polisoma.

NOTA: Suplementar el tampone de lisis con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.

2. Añadir cicloheximida al medio neurobasal con tejidos diseccionados a una concentración final de 100 μg/ml e incubar a 37 °C durante 10 min. Cicloheximida bloquea la alargamiento de la traducción y, por lo tanto, evita la escorrentía ribosoma ¹⁵.
3. Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
4. Lave los tejidos dos veces con solución salina amortiguada por fosfato frío (PBS) complementada con 100 μg/ml de cicloheximida.
5. Añadir 500 μL de tampón de lisis celular complementado con 4 μL de inhibidor de la RNase. Pipeta arriba y abajo para resuspend el tejido en tampón de lisis. Utilice una aguja de insulina para liar suavemente el tejido.
6. Incubar los tejidos sobre hielo durante 10 min con un breve vórtice cada 2-3 min.
   NOTA: Para prevenir la degradación del tejido, asegúrese de que todos los pasos de lisis tisular se llevan a cabo en el hielo.
7. Centrífuga a 2.000 x g durante 5 minutos a 4 °C.
8. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo.
9. Centrífuga a ~13,000 x g durante 5 min a 4 °C.
10. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo.
11. Mida la concentración de ARN en el tejido lisato utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
    NOTA: Si se incluyen varias muestras en el experimento, diluya las muestras a la misma concentración con un búfer de lisis celular adicional para minimizar la variación.

5. Carga de muestras y ultracentrifugación

1. Preenfríe el rotor de ultracentrifugación y los cubos de oscilación a 4 °C, y ajuste la temperatura de la ultracentrífuga a 4 °C.
2. Mantenga 20 μL del tejido lisato como entrada total de ARN.
3. Cargue muestras (ARN de 50-300 μg con un volumen igual) en la parte superior de los gradientes de sacarosa dispensando lentamente el lisato a las paredes de los tubos ultracentrífugas.
4. Coloque suavemente los tubos ultracentrífugas en el cubo de oscilación. Asegúrese de que todos los cubos diametralmente opuestos estén equilibrados.
5. Cargue los cubos de oscilación en el rotor. Ajuste la ultracentrífuga a 190.000 x g (~39.000 rpm) a 4 °C durante 90 min.
6. Coloque suavemente los gradientes sobre hielo después de la centrifugación.

6. Fraccionamiento y recolección de muestras

NOTA: Se utiliza un sistema de fraccionamiento, grabación y recolección ensamblado en casa para el análisis y la recopilación de muestras de los degradados(Figura 3,consulte Componentes del dispositivo).

1. Coloque un tubo de ultracentrífuga vacío en el perforador del tubo y penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior.
2. Encienda el monitor UV y abra el software de grabación de señal digital.
3. Llene una jeringa de 30 ml con 25 ml de solución de persecución de sacarosa al 60%. Presione suavemente la jeringa de tal manera que la solución de persecución llene el tubo vacío y pase por el monitor UV de 254 nm para establecer la línea de base para su detección.
4. Pulse auto-cero en el monitor UV para registrar una línea base para su detección. Pulse reproducir en el software para comenzar a grabar.
5. Una vez que el sistema establece una línea base, pausa la grabación en el software y retrae la solución de persecución. Asegúrese de que no quede ninguna solución de persecución residual en el sistema.
   NOTA: Enjuague el sistema con agua libre de RNase para eliminar las soluciones de sacarosa residual restantes de la ejecución anterior.
6. Cargue un tubo de muestra en el perforador del tubo. Penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior.
7. Comience a grabar en el software. Inicie la bomba de jeringa (caudal de 1 mL/min para un volumen de 25 ml) y el colector de fracción para recoger fracciones de polisoma. Establezca la configuración del fraccionarios en 30 s.
   NOTA: Antes de cada carrera, asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa o en el tubo presionando suavemente la jeringa para permitir que la solución de persecución fluya continuamente a través de la aguja.
8. Recoger las fracciones en tubos de 1,5 ml (500 μL cada uno) utilizando un colector de fracción.
9. Las fracciones se pueden procesar inmediatamente o almacenarse a -80 °C.
10. Después de la recolección de fracciones, enjuague el sistema con agua libre de RNase para eliminar cualquier sacarosa remanente.

7. Extracción de ARN

1. A cada fracción, agregue 10 ng de control de arnesa luciferasa.
2. Agregue tres volúmenes de reactivo de aislamiento de ARN comercial basado en cloróxido de guanidium a cada fracción.
3. Vórtice brevemente durante 15 s.
4. Extraiga ARN utilizando un kit de extracción de ARN compatible con la solución utilizada en 7.2.

8. Transcripción inversa y PCR en tiempo real

1. Mida la concentración del ARN utilizando espectrofotómetro UV-Vis.
2. Someta el ARN a la transcripción inversa utilizando un kit de síntesis cDNA, según el protocolo del fabricante.
3. Utilice el PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) para examinar la distribución polisomal del ARNm gapdh como ejemplo. qPCR se realizó utilizando un sistema de detección qPCR y un reactivo de mastermix qPCR, con las siguientes condiciones de ciclismo: 95 °C durante 10 min, luego 40 ciclos de 95 °C para 15 s, 60 °C para 30 s, 72 °C para 40 s, seguido de 95 °C para 60 s.
4. Obtenga valores de ciclo de umbral (Ct) de las gráficas de amplificación y se utiliza para calcular el cambio de pliegue mediante el método ΔΔCt.

9. Gradiente de sacarosa haciendo montaje del sistema

NOTA: Siga los pasos para ensamblar cada componente (como se describe en la Tabla 3)del fabricante de degradado de sacarosa (Figura 1).

1. Monte dos soportes verticales (A2) en la placa base (A1).
2. Utilice dos soportes delgados de ángulo recto (B2) para montar el actuador de etapa lineal en la placa base (A1).
3. Utilice el tornillo de fijación en el poste de aluminio de Ø12,7 mm (C2) para fijarlo en la placa base del soporte de tubo (C1) como soporte para el soporte del tubo.
4. Monte la abrazadera de poste de ángulo recto de Ø1/2" a Ø6 mm (C3) con el poste (C2) y el poste óptico de la miniserie (C4).
5. Utilice el tornillo de fijación en el poste óptico (C4) para conectar una pequeña abrazadera en V (C5) como soporte del tubo.
6. Coloque un tubo centrífuga en el soporte del tubo y ajuste el ángulo para que sea vertical. Marque la posición del tubo y monte el soporte del poste de pedestal (C6) en la placa base (C1) para apoyar el tubo.
7. Al otro lado de la placa de pan (A1), utilice el setcrew del poste de aluminio de Ø12,7 mm (D1) para fijarlo y conectar un poste óptico de miniserie (D3) utilizando una abrazadera de poste de ángulo recto de Ø1/2" a Ø6 mm (D2).
8. Conecte la abrazadera en V en miniatura (D4) con aguja de extremo contundente (D5) al poste (D3). Ajuste el ángulo de la abrazadera para ajustar la aguja vertical y ajuste la longitud del poste para asegurarse de que la aguja se encuentra con el tubo centrífuga.
9. Conecte el actuador (B1) al controlador de motor paso a paso (E1) y utilice la placa controladora UNO R3 y el módulo de joystick del kit de arranque UNO (E2) para controlar el actuador. Se puede utilizar un adaptador de potencia (por ejemplo, adaptador de potencia ajustable de CA/CC de 9-24 V) para conducir el motor por separado.
10. Coloque la bomba de jeringa (F) junto a la estación de fabricación de gradiente y conecte la jeringa con la aguja.
11. Controle la etapa del soporte del tubo hacia arriba y hacia abajo con el joystick.

componente	artículo
B1	Actuador lineal de etapa
E1	Conductor de motor paso a paso
E2	Kit de super-arranque del proyecto UNO
A1	Protoboard
A2	Soporte vertical
B2	Soporte delgado de ángulo recto
C1	Placa de pan de la miniserie
C5	Pequeña abrazadera en V
D4	Abrazadera en miniatura en V
C2	Poste de aluminio de Ø12,7 mm
C4, D3	Poste óptico de la miniserie
D1	Poste de aluminio de Ø12,7 mm
C3, D2	Abrazadera de poste de ángulo recto de Ø1/2" a Ø6 mm
C6	Base de soporte de poste de pedestal de la serie mini
D5	Aguja final contundente
F	Bomba de jeringa

Tabla 3: Degradado que fabrica componentes del sistema.

10. Fraccionamiento y detección del conjunto del sistema (Figura 2).

1. Utilice una abrazadera de bureta redonda redonda regular para montar el módulo óptico del monitor UV en el perforador del tubo. Fije un extremo del tubo (1 cm de largo y 0,56 mm de diámetro interno) al conectador del perforador de tubo y el otro extremo al puerto fluid in del módulo óptico. Conecte el puerto Fluid Out al fraccionaridor.
2. Conecte el módulo óptico con la unidad de control del monitor UV según el manual del fabricante.
3. Utilice un cable de ruptura para conectar la toma de salida de señal al convertidor digital en el suelo y conexiones de entrada analógicas, según el manual del fabricante.
4. Conecte el convertidor digital a un ordenador portátil mediante un cable USB normal y grabe las señales digitales convertidas mediante el software de adquisición de datos.

Resultados

Como demostración, el lisato cortical que contenía 75 μg de ARN (agrupado de 8 embriones) fue separado por el gradiente de sacarosa en 12 fracciones. Picos de absorbancia UV a 254 nm identificaron fracciones que contienen el subunidad 40S, subunidad 60S, monosoma 80S y polisomas (Figura 4A). Análisis de fracciones por mancha occidental para la gran subunidad ribosomal, Rpl10 mostró su presencia en la subunidad 60S (fracción 3), monosoma (fracción 4) y polisomas (fracciones 5-12) (

Discusión

El perfilado de polisomas es una técnica comúnmente utilizada y potente para evaluar el estado traslacional en niveles únicos de genes y de todo el genoma^14. En este informe, presentamos un protocolo de perfilado de polisoma utilizando una plataforma montada en casa y su aplicación para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Esta plataforma rentable es fácil de montar y generar gradientes de sacarosa robustos y reproducibles y perfiles de polisoma con alta sensibilidad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M