Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Resumo

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Resumo

O desenvolvimento adequado do cérebro mamífero depende de um bom equilíbrio de proliferação de células-tronco neurais e diferenciação em diferentes tipos de células neurais. Esse equilíbrio é fortemente controlado pela expressão genética que é ajustada em vários níveis, incluindo transcrição, pós-transcrição e tradução. Nesse sentido, um conjunto crescente de evidências destaca um papel crítico da regulação translacional na coordenação das decisões de destino das células-tronco neurais. O fracionamento polissário é uma ferramenta poderosa para a avaliação do status translacional mRNA em níveis genéticos globais e individuais. Aqui, apresentamos um pipeline de perfil de polimento interno para avaliar a eficiência translacional nas células do córtex cerebral do camundongo em desenvolvimento. Descrevemos os protocolos de preparação de gradiente de sacarose, lise tecidual, ultracentrifugação e análise baseada em fracionamento do status translacional mRNA.

Introdução

Durante o desenvolvimento do cérebro mamífero, as células-tronco neurais proliferam e se diferenciam para gerar neurônios e glia^1,2 . A perturbação desse processo pode levar a alterações na estrutura e função cerebral, como visto em muitos distúrbios neurodesenvolvimentos^3,4. O comportamento adequado das células-tronco neurais requer a expressão orquestrada de genes específicos⁵. Embora o controle epigenético e transcricional desses genes tenha sido intensamente estudado, achados recentes sugerem que a regulação genética em outros níveis também contribui para a coordenação da proliferação e diferenciação de células-tronco neurais^6,7,8,9,10. Assim, abordar os programas de controle translacional avançará muito nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à decisão do destino das células-tronco neurais e ao desenvolvimento cerebral.

Três técnicas principais com diferentes pontos fortes foram amplamente aplicadas para avaliar o status translacional do mRNA, incluindo perfil ribossomo, tradução de purificação de afinidade ribossosome (TRAP) e perfil de polimento. O perfil ribossomo usa sequenciamento de RNA para determinar fragmentos de mRNA protegidos por ribossomo, permitindo a análise global do número e localização da tradução de ribossomos em cada transcrição para inferir indiretamente a taxa de tradução, comparando-a à transcrição¹¹. TRAP aproveita as proteínas ribossômicas marcadas por epitope para capturar mRNAs¹²com limite ribossomo . Dado que as proteínas ribossômicas marcadas podem ser expressas em tipos de células específicas usando abordagens genéticas, o TRAP permite a análise da tradução de forma específica do tipo celular. Em comparação, o perfil polissário, que usa fracionamento de gradiente de densidade de sacarose para separar porção livre e mal traduzida (monossomos mais leves) daqueles que estão sendo ativamente traduzidos por ribossomos (polissomos mais pesados), fornece uma medição direta da densidade ribossomo no mRNA¹³. Uma vantagem que essa técnica oferece é sua versatilidade para estudar a tradução de mRNA específico de interesse, bem como análise de translatome em todo o genoma¹⁴.

Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado de perfil polisso para analisar o córtex cerebral do camundongo em desenvolvimento. Usamos um sistema montado em casa para preparar gradientes de densidade de sacarose e coletar frações para aplicações a jusante. O protocolo aqui apresentado pode ser adaptado facilmente para analisar outros tipos de tecidos e organismos.

Protocolo

Todo o uso de animais foi supervisionado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Calgary. Os camundongos CD1 usados para o experimento foram comprados de fornecedor comercial.

1. Preparação de soluções

NOTA Para evitar a degradação do RNA, pulverizar bancada e todos os equipamentos com solução de descontaminação RNase. Dicas sem RNase são usadas para o experimento. Todas as soluções são preparadas em água sem RNase.

1. Prepare a solução de estoque de cicloheximida (100 mg/mL) em DMSO e armazene a -20 °C.
2. Prepare a solução de caldo de sacarose de 2,2 M adicionando 75,3 g de sacarose à água sem RNase e aumentando o volume para 100 mL (para preparação de ~16 gradientes). A solução pode ser mantida a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
3. Prepare solução de sal 10x (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl₂).
4. Prepare 60% (w/v) solução de perseguição de sacarose, contendo 30 g de sacarose, 5 mL de solução de sal 10x e cubra o volume até 50 mL com água sem RNase.
5. Opcionalmente, adicione uma mancha de azul bromofenol ou aproximadamente 5 μL de 1% de azul bromofenol em água livre de RNase à solução de perseguição. 1.6. Armazene soluções a 4 °C.

2. Preparação de gradiente de sacarose

NOTA: A precisão na preparação de gradientes de sacarose é fundamental para obter resultados consistentes e reprodutíveis.

1. Para preparar seis gradientes de sacarose de 10 a 50%, diluir a solução de sacarose de 2,2 M como na Tabela 1.

Solução de sacarose	10%	20%	30%	40%	50%
2,2 M de sacarose	2 mL	4 mL	6 mL	8 mL	10 mL
Solução de sal 10X	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL
Cicloheximida	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
Água	11,5 mL	9,5 mL	7,5 mL	5,5 mL	3,5 mL
Volume total	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL

Tabela 1: Diluições de sacarose para preparações de gradientes de sacarose.

NOTA: Prepare sempre gradientes de sacarose em múltiplos de dois para equilibrar o peso durante a ultracentrifugação.

2. Limpe a agulha final de metal com solução de descontaminação RNase. Enxágue brevemente os tubos de ultracentrifuuge, tubos e a seringa usando água sem RNase. Seque o ar dos tubos de tal forma que nenhuma gota de água permaneça nos tubos, pois qualquer água restante alterará a concentração de sacarose.
3. Coloque a agulha metálica no suporte do grampo e o tubo de centrífuga no estágio motorizado. Para preparar os gradientes de forma consistente, foi utilizado um sistema montado em casa que contém um estágio motorizado para segurar o tubo ultracentrífuga e uma bomba de seringa para injetar soluções de sacarose(Figura 1, ver o passo 9 para obter detalhes).
4. Encha uma seringa de 30 mL com ~16 mL de sacarose de 10% (suficiente para seis gradientes), coloque-a na bomba de seringa e conecte-a à agulha. Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa, tubos e agulha. Limpe a ponta da agulha para remover qualquer solução residual.
5. Mova o estágio motorizado para cima de tal forma que a ponta da agulha toque o centro do tubo na parte inferior.
6. Ajuste a bomba de seringa a uma vazão de 2 mL/min para um volume de 2,3 mL.
7. Depois de dispensar 2,3 mL de solução de sacarose de 10%, mova-se para baixo da fase motorizada e repita o processo para todos os seis gradientes.
8. Repetimos passos 2,4-2,7 para adicionar 20% de solução de sacarose ao fundo dos tubos, seguido por 30%, 40% e 50% soluções de sacarose da mesma forma.
9. Após a preparação do gradiente, sele o tubo de ultracentrífas usando um filme de parafina.
10. Deixe os tubos durante a noite a 4 °C de modo que as diferentes camadas de sacarose se difundam juntas para dar um gradiente contínuo.

3. Dissecção tecidual

NOTA: Os camundongos gestantes foram eutanizados por luxação cervical precedida por anestesia com 5% de isoflurane.

1. Colete embriões de camundongos CD1 no dia 12, ou outros pontos de tempo, conforme necessário, e coloque embriões em uma placa de Ø de 10 cm contendo solução de sal balanceado (HBSS) no gelo para reter a viabilidade celular.
2. Sob o escopo de dissecção, transfira um embrião para uma placa de Ø de 6 cm contendo HBSS gelado.
3. Use agulhas de 21-23 G para fixar a posição da cabeça penetrando através dos olhos em um ângulo de aproximadamente 45° e aplique força para garantir que as agulhas estejam fixadas na placa(Figura 2A).
4. Use fórceps nº 5 para remover a pele e o crânio, do meio para os lados.
5. Use fórceps para cortar as lâmpadas olfativas e remover as meninges para expor os tecidos corticais.3.6.Use fórceps curvos para cortar os tecidos corticais em 2-3 mL de meio neurobásal no gelo(Figura 2B). Agrupar tecidos cortical de diferentes embriões, conforme necessário. Tecidos de 8-10 embriões geralmente dão ~200 μg RNA total.

4. Lise celular

1. No dia da dissecção tecidual, prepare o tampão de lise celular fresco, conforme descrito na Tabela 2.

solução	Concentração final	volume
Tris-HCl (pH 7.5)	20 mM	100 μL
Kcl	100 mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
Tritão X-100	1% (v/v)	500 μL
Desoxicolato de sódio	0,5% (w/v)	500 μL
Dithiothreitol (DTT)	1 mM	5 μL
Cicloheximida	100 μg/mL	5 μL
Água livre RNase		Topo até 5 mL
total	5 mL	5 mL

Tabela 2: Preparação de tampão de polise.

NOTA: Tampão de lise suplementar com inibidores de protease e fosfatase.

2. Adicione cicloheximida ao meio neurobásio com tecidos dissecados a uma concentração final de 100 μg/mL e incubar a 37 °C por 10 minutos. Cicloheximida bloqueia o alongamento da tradução e, portanto, evita o escoamento ribossomo ¹⁵.
3. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernaspe.
4. Lave os tecidos duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato gelado (PBS) complementado com cicloheximida de 100 μg/mL.
5. Adicione 500 μL de tampão de lise celular suplementado com 4 μL de inibidor de RNase. Pipeta para cima e para baixo para resuspensar o tecido em tampão de lise. Use uma agulha de insulina para lise suavemente o tecido.
6. Incubar os tecidos no gelo por 10 minutos com breve vórtice a cada 2-3 minutos.
   NOTA: Para evitar a degradação tecidual, certifique-se de que todas as etapas de lise tecidual sejam realizadas no gelo.
7. Centrifugar a 2.000 x g por 5 min a 4 °C.
8. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga no gelo.
9. Centrifugar a ~13.000 x g por 5 min a 4 °C.
10. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga no gelo.
11. Meça a concentração de RNA no liseto tecidual usando um especttômetro UV-Vis.
    NOTA: Se várias amostras estiverem incluídas no experimento, diluir amostras para a mesma concentração com tampão de lise celular extra para minimizar a variação.

5. Carga de amostras e ultracentrifugação

1. Pré-esfrie o rotor de ultracentrifugação e gire os baldes a 4 °C, e ajuste a temperatura da ultracentrifugação para 4 °C.
2. Mantenha 20 μL do tecido lysate como entrada total de RNA.
3. Carregar amostras (RNA de 50-300 μg com um volume igual) na parte superior dos gradientes de sacarose, distribuindo lentamente o lysate para as paredes dos tubos ultracentrifuuge.
4. Coloque suavemente os tubos de ultracentrifuuge no balde de balanço. Certifique-se de que todos os baldes diametralmente opostos estejam equilibrados.
5. Carregue os baldes de balanço no rotor. Defina a ultracentrifugação para 190.000 x g (~39.000 rpm) a 4 °C por 90 min.
6. Coloque suavemente os gradientes no gelo após a centrifugação.

6. Fracionamento e coleta de amostras

NOTA: Um sistema de fracionamento, gravação e coleta montado em casa é utilizado para a análise e coleta de amostras dos gradientes(Figura 3, ver componentes do dispositivo).

1. Coloque um tubo de ultracentrifutura vazio no perfurador do tubo e penetre suavemente o tubo com a agulha de baixo.
2. Ligue o monitor UV e abra o software de gravação de sinal digital.
3. Encha uma seringa de 30 mL com 25 mL de solução de perseguição de sacarose de 60%. Pressione suavemente a seringa de modo que a solução de perseguição encha o tubo vazio e passe pelo monitor UV de 254 nm para definir a linha de base para detecção.
4. Pressione o auto-zero no monitor UV para registrar uma linha de base para detecção. Pressione play no software para começar a gravar.
5. Uma vez que o sistema estabeleça uma linha de base, pausa a gravação no software e retraia a solução de perseguição. Certifique-se de que nenhuma solução de perseguição residual permaneça no sistema.
   NOTA: Enxágüe o sistema com água livre de RNase para remover soluções residuais de sacarose remanescentes da execução anterior.
6. Carregue um tubo de amostra para o perfurador do tubo. Penetre suavemente o tubo com a agulha de baixo.
7. Comece a gravar no software. Inicie a bomba de seringa (taxa de fluxo de 1 mL/min para um volume de 25 mL) e o coletor de frações para coletar frações de polísomees. Defina as configurações do fracionador para 30 s.
   NOTA: Antes de cada corrida, certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa ou na tubulação pressionando suavemente a seringa para deixar a solução de perseguição fluir continuamente através da agulha.
8. Colete as frações em tubos de 1,5 mL (500 μL cada) usando um coletor de frações.
9. As frações podem ser processadas imediatamente ou armazenadas a -80 °C.
10. Após a coleta de frações, enxágue o sistema com água livre de RNase para remover qualquer sacarose remanescente.

7. Extração de RNA

1. A cada fração, adicione 10 ng de controle de pico de mRNA de luciferase.
2. Adicione três volumes de reagente de isolamento RNA comercial à base de hidrocholride de guanidium a cada fração.
3. Vórtice brevemente para 15 s.
4. Extrair RNA utilizando um kit de extração de RNA compatível com a solução utilizada em 7.2.

8. Transcrição reversa e PCR em tempo real

1. Meça a concentração do RNA usando espectrofotômetro UV-Vis.
2. Sujeito rna a transcrição reversa usando um kit de síntese cDNA, de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Use pcr quantitativo em tempo real (qPCR) para examinar a distribuição polissômica do gapdh mRNA como exemplo. qPCR foi realizado utilizando um sistema de detecção qPCR e um reagente de mastermix qPCR, com as seguintes condições de ciclismo: 95 °C para 10 min, depois 40 ciclos de 95 °C para 15 s, 60 °C para 30 s, 72 °C para 40 s, seguido por 95 °C para 60 s.
4. Obtenha valores de ciclo limiar (Ct) das parcelas de amplificação e usado para calcular a alteração do fold usando o método ΔΔCt.

9. Montagem do sistema de gradiente de sacarose

NOTA: Siga os passos para montar cada componente (conforme descrito na Tabela 3) do fabricante de gradiente de sacarose(Figura 1).

1. Monte dois suportes verticais (A2) na placa base (A1).
2. Use dois suportes finos de ângulo reto (B2) para montar o atuador de estágio linear na tábua de pão base (A1).
3. Use o parafuso de estículo no poste de alumínio Ø12,7 mm (C2) para fixá-lo na placa base do suporte do tubo (C1) como suporte para o suporte do tubo.
4. Monte o ângulo reto Ø1/2" para Ø6 mm de grampo pós (C3) com o poste (C2) e o poste óptico mini-série (C4).
5. Use o parafuso de conjunto no poste óptico (C4) para conectar um pequeno grampo V (C5) como suporte do tubo.
6. Coloque um tubo de centrífuga no suporte do tubo e ajuste o ângulo para torná-lo vertical. Marque a posição do tubo e monte o porta-correio pedestal (C6) na tábua de pão base (C1) para suportar o tubo.
7. Do outro lado da prancha (A1), use o parafuso de 12,7 mm do poste de alumínio Ø12,7 mm (D1) para corrigi-lo e conectar um poste óptico de mini-série (D3) usando um ângulo reto Ø1/2" para Ø6 mm de grampo pós (D2).
8. Conecte o v-clamp em miniatura (D4) com agulha de extremidade sem corte (D5) ao poste (D3). Ajuste o ângulo do grampo para definir a agulha vertical e ajuste o comprimento do poste para garantir que a agulha atenda ao tubo centrífuga.
9. Conecte o atuador (B1) ao motor de estepe (E1) e use a placa controladora UNO R3 e o módulo joystick do kit de partida UNO (E2) para controlar o atuador. Um adaptador de potência (por exemplo, 9-24 V AC/DC adaptador de potência ajustável) pode ser usado para dirigir o motor separadamente.
10. Coloque a bomba de seringa (F) ao lado da estação de fabricação de gradiente e conecte a seringa com a agulha.
11. Controle o estágio do suporte do tubo para cima e para baixo usando o joystick.

componente	item
B1	Atuador linear de palco
E1	Motorista de motor stepper
E2	UNO projeto super starter kit
A1	Breadboard
A2	Suporte vertical
B2	Suporte fino de ângulo reto
C1	Tábua de pão mini-série
C5	Pequeno grampo em V
D4	Pinça V em miniatura
C2	Poste de alumínio de Ø12,7 mm
C4	Post óptico de mini-série
D1	Poste de alumínio de Ø12,7 mm
C3	Ângulo reto Ø1/2" para Ø6 mm grampo pós
C6	Base de pós-pedestal mini-série
D5	Agulha de extremidade cega
fá	Bomba de seringa

Tabela 3: Componentes do sistema de fabricação de gradiente.

10. Montagem do sistema de fracionamento e detecção(Figura 2).

1. Use um grampo de burette de mandíbula redonda regular para montar o módulo óptico do monitor UV no perfurador do tubo. Fixar uma extremidade da tubulação (1 cm de comprimento e 0,56 mm de diâmetro interno) ao conector do perfurador do tubo e a outra extremidade ao fluido na porta do módulo óptico. Conecte a porta Fluid Out ao fracionador.
2. Conecte o módulo óptico com a unidade de controle do monitor UV de acordo com o manual do fabricante.
3. Use um cabo de fuga para conectar o soquete de saída do sinal ao conversor digital no solo e conexões de entrada analógicas, de acordo com o manual do fabricante.
4. Conecte o conversor digital a um laptop usando um cabo USB normal e regissu o sinal digital convertido usando software de aquisição de dados.

Resultados

Como demonstração, o lysato cortical contendo 75 μg de RNA (agrupado de 8 embriões) foi separado pelo gradiente de sacarose em 12 frações. Picos de absorvância UV a 254 nm identificaram frações contendo a subunidade 40S, subunidade 60S, monossóis 80S e polisomáticos(Figura 4A). Análise de frações por mancha ocidental para a grande subunidade ribossômica, Rpl10 mostrou sua presença na subunidade 60S (fração 3), monossóica (fração 4) e polisomas (frações 5-12)

Discussão

O perfil polimento é uma técnica comumente usada e poderosa para avaliar o status translacional nos níveis de gene único e genoma¹⁴ . Neste relatório, apresentamos um protocolo de perfil polisome utilizando uma plataforma montada em casa e seu aplicativo para analisar o córtex do mouse em desenvolvimento. Esta plataforma econômica é fácil de montar e gerar gradientes robustos e reprodutíveis de sacarose e perfil polisso com alta sensibilidade.

Vale ressaltar q...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M