ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

要約

哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。

要約

哺乳類の脳の適切な発達は、神経幹細胞増殖と異なる神経細胞タイプへの分化の細かいバランスに依存しています。このバランスは、転写、転写後、翻訳など、複数のレベルで微調整された遺伝子発現によって厳しく制御されます。この点で、証拠の成長体は、神経幹細胞の運命決定を調整する際の翻訳調節の重要な役割を強調しています。ポリサム分画は、グローバルおよび個々の遺伝子レベルの両方でmRNA翻訳状態を評価するための強力なツールです。ここでは、開発中のマウス大脳皮質からの細胞の翻訳効率を評価するための社内ポリソームプロファイリングパイプラインを提示する。我々は、sucrose勾配調製、組織ライシス、超遠心分離及び分画ベースのmRNA翻訳状態の分析のためのプロトコルを記述する。

概要

哺乳類の脳の発達の間に、神経幹細胞は増殖し、分化してニューロンとグリア^1、2を生成する。このプロセスの摂動は、脳の構造と機能の変化につながることができます, 多くの神経発達障害に見られるように^3,4.神経幹細胞の適切な行動は、特定の遺伝子⁵の調整された発現を必要とする。これらの遺伝子のエピジェネティックおよび転写制御は鋭意的に研究されているが、最近の知見は、他のレベルでの遺伝子調節が、神経幹細胞増殖と分化^{6、7、8、9、10}の協調にも寄与することを示唆している。このように、翻訳制御プログラムに取り組むことは、神経幹細胞の運命決定と脳の発達の根底にあるメカニズムの理解を大きく進める。

リボソームプロファイリング、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)およびポリソームプロファイリングを含むmRNAの翻訳状態を評価するために、異なる強みを有する3つの主要な技術が広く適用されている。リボソームプロファイリングはRNAシーケンシングを使用してリボソームで保護されたmRNA断片を決定し、各転写物の翻訳リボソームの数と位置をグローバルに分析し、転写量¹¹と比較して間接的に翻訳速度を推測することを可能にする。TRAPはエピトープタグ付きリボソームタンパク質を利用してリボソーム結合mRNA¹²を捕捉する。タグ付きリボソームタンパク質が遺伝的アプローチを用いて特定の細胞型で発現できることを考えると、TRAPは細胞型特異的な方法で翻訳を分析することを可能にする。これに対して、ポリソームプロファイリングは、ショ糖密度勾配分画を使用して、自由で翻訳不良な部分(軽いモノソーム)をリボソーム(重いポリソーム)によって積極的に翻訳されているものから分離し^、mRNA13上のリボソーム密度を直接測定する。この技術が提供する1つの利点は、ゲノム全体の翻訳法解析¹⁴と同様に、関心のある特定のmRNAの翻訳を研究するための汎用性である。

本論文では、開発中のマウス大脳皮質を分析するためのポリソームプロファイリングの詳細なプロトコルについて述べている。私たちは、ショ糖密度勾配を準備し、下流のアプリケーションの分数を収集するために、ホームアセンブルシステムを使用しています。ここで提示されるプロトコルは、他のタイプの組織および生物を分析するために容易に適応することができる。

プロトコル

すべての動物の使用はカルガリー大学の動物ケア委員会によって監督されました。実験に用いたCD1マウスは、市販業者から購入した。

1. ソリューションの準備

注: RNA の劣化を防ぐために、RNase 除染ソリューションを使用して、ワークベンチとすべての機器をスプレーします。RNaseフリーのヒントは実験に使用されます。すべてのソリューションは、RNaseフリーの水で調製されます。

1. DMSOでシクロヘキシミドストック液(100mg/mL)を調製し、-20°Cで保管してください。
2. RNaseフリー水に75.3 gのスクロースを加え、体積を100 mL(〜16勾配調製用)に上げて2.2Mスクロースストック溶液を準備します。溶液は長期保存のために-20 °Cで保つことができる。
3. 10x塩溶液(1 M NaCl;200 mMトリス-HCl、pH 7.5;50 mM MgCl₂₎を準備する)。
4. 60%(w/v)スクロースチェイス溶液を調製し、30gのスクロース、5 mLの10倍の塩溶液を含み、RNaseフリー水で最大50mLの体積を上回ります。
5. 必要に応じて、ブロモフェノールブルーの斑点または1%ブロモフェノールブルーの約5μLをRNaseフリーウォーターに加えて、チェイス溶液に加えます。1.6. 4 °Cでソリューションを保管する

2. スクロース勾配の調製

注: スクロース勾配の準備における精度は、一貫性のある再現性のある結果を得る上で重要です。

1. 6つの10〜50%のショ糖勾配を調製するために、 表1のように2.2Mスクロース溶液を希釈する。

スクロース溶液	10%	20%	30%	40%	50%
2.2 M スクロース	2 mL	4 mL	6 mL	8 mL	10 mL
10倍の塩溶液	1.5 mL	1.5 mL	1.5 mL	1.5 mL	1.5 mL
シクロヘキシミド	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
水	11.5 mL	9.5 mL	7.5 mL	5.5 mL	3.5 mL
総量	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL

表1:ショ糖勾配の調製のためのスクロース希釈液。

注:超遠心の間に重量のバランスを取るために、常に2の倍数のショ糖勾配を準備してください。

2. RNase除染液で金属鈍い端の針を拭く。RNaseフリーの水を使用して、超遠心チューブ、チューブ、シリンジを簡単にすすいでください。残りの水がスクロース濃度を変えるため、チューブに水滴が残らないようにチューブを空気乾燥させます。
3. クランプホルダーに金属針を、電動ステージに遠心分離チューブを置きます。勾配を一貫して調製するために、超遠心チューブを保持する電動ステージとショ糖溶液を注入する注射器ポンプを含む家庭用組み立てシステムを使用しました(図1、詳細はステップ9を参照)。
4. 30 mL のシリンジに、10% スクロースの 16 mL (6 つの勾配に十分) を充填し、注射器ポンプに置き、針に接続します。注射器、チューブ、および針に気泡がないことを確認します。針の先端を拭き取り、残留液を取り除きます。
5. 針の先端が下部のチューブの中心に触れるようなモーターステージを上に移動します。
6. 2.3 mLの体積に対して、2 mL/minの流量でシリンジポンプをセットします。
7. 10%のスクロース溶液の2.3 mLを分配した後、電動ステージを下に移動し、6つの勾配すべてについてプロセスを繰り返します。
8. ステップ2.4~2.7を繰り返して、チューブの底部に20%のスクロース溶液を添加し、続いて30%、40%、50%のスクロース溶液を同様に添加します。
9. 勾配の調製後、パラフィンフィルムを用いて超遠心チューブを密封する。
10. 異なるショ糖層が一緒に拡散して連続勾配を与えるような4°Cでチューブを一晩放置します。

3. 組織解剖

注:妊娠中のマウスは、5%イオブルランで麻酔が先行する子宮頸部脱臼によって安楽死させた。

1. 胚性12日目にCD1マウス胚を収集し、必要に応じて他のタイムポイントを収集し、氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を含むØ 10 cmプレートに胚を入れ、細胞の生存率を保持します。
2. 解剖スコープの下で、1つの胚を氷冷HBSSを含むØ 6 cmプレートに移す。
3. 21-23 G針を使用して、約45°の角度で目を貫通して頭部の位置を固定し、針がプレートに固定されていることを確認するために力を加える(図2A)。
4. 皮膚と頭蓋骨を中央から側面に取り除くためにNo.5鉗子を使用してください。
5. 鉗子を使用して嗅球を切断し、髄膜を取り除いて皮質組織を露出させる.3.6.湾曲した鉗子を使用して皮質組織を氷上の神経基底培地の2〜3mLに切断する(図2B)。必要に応じて異なる胚から皮質組織をプールします。8~10個の胚からの組織は、通常、約200μgの総RNAを与える。

4. 細胞の起水

1. 組織解剖の日に、 表2に記載されているように新鮮な細胞のライシスバッファーを調製する。

解決	最終濃度	容積
トリス-HCl (pH 7.5)	20mM	100 μL
KCl	100mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
トリトンX-100	1% (v/v)	500 μL
デオキシコール酸ナトリウム	0.5% (w/v)	500 μL
ジチオスレイトール (DTT)	1 mM	5 μL
シクロヘキシミド	100 μg/mL	5 μL
RNaseフリーウォーター		トップ最大5 mL
トータル	5 mL	5 mL

表2:ポリソームライシス緩衝液の調製。

注:プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤でリシスバッファーを補います。

2. 100 μg/mLの最終濃度に解剖した組織を用いた神経基底培地にシクロヘキシミドを加え、37°Cで10分間インキュベートする。シクロヘキシミドは、翻訳伸びをブロックし、したがって、リボソームの流出を防ぎます ¹⁵.
3. 4°Cで5分間500xgで遠心分離機を出し、上清を捨てます。
4. 氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で100 μg/mLシクロヘキシミドを加え、組織を2回洗浄します。
5. 4 μLの RNase 阻害剤を添加した細胞のリシスバッファーを 500 μL 加えます。ピペットは、リシスバッファー内の組織を再中断するために上下.インスリン針を使用して、組織を穏やかに取り付けます。
6. 氷の上の組織を2〜3分ごとに短い渦で10分間インキュベートします。
   注:組織の劣化を防ぐために、組織の分解のすべてのステップが氷の上で行われることを確認してください。
7. 4°Cで5分間2,000 x g で遠心分離機。
8. 上清を氷上の新しい遠心管に移します。
9. 遠心分離機は約13,000xgで5°Cで5分間。
10. 上清を氷上の新しい遠心管に移します。
11. UV-Vis分光光度計を用いて、組織ライセート中のRNA濃度を測定します。
    注:複数のサンプルが実験に含まれている場合は、余分な細胞のリシスバッファーで同じ濃度にサンプルを希釈して、変動を最小限に抑えます。

5. サンプルローディングと超遠心分離

1. 4°Cで超遠心回転子とスイングバケットを予冷し、超遠心分離機の温度を4°Cに設定します。
2. 20μLの組織ライセートを全RNA入力として保管します。
3. スクロース勾配の上部に、リゼートを超遠心管の壁にゆっくりと分配することで、サンプル(50〜300 μgのRNAと等量のRNA)をロードします。
4. 超遠心チューブをスイングバケットにそっと入れろ。すべての正反対のバケットがバランスを取っていることを確認します。
5. 回転子にスイング バケットをロードします。超遠心分離機を4°Cで190,000 x g( 約39,000 rpm)に設定し、90分間設定します。
6. 遠心後に氷の上に勾配をそっと置きます。

6. 分数とサンプルコレクション

注: ホームアセンブルされた分画、記録、収集システムは、分析と勾配からのサンプルの収集に使用されます (図 3デバイス コンポーネントを参照)。

1. チューブピアサーに空の超遠心チューブを置き、下から針でチューブをそっと貫通します。
2. UVモニタのスイッチを入れ、デジタル信号記録ソフトウェアを開きます。
3. 30 mL のシリンジに 25 mL の 60% スクロースチェイス溶液を充填します。チェイス溶液が空のチューブを満たすよう注射器を軽く押し、254 nmのUVモニタを通過して検出基準を設定します。
4. UV モニタの自動ゼロを押して、検出用のベースラインを登録します。ソフトウェアの再生を押して録音を開始します。
5. ベースラインが確立されたら、ソフトウェアの記録を一時停止し、追跡ソリューションを撤回します。システムに残った追跡溶液が残らないようにします。
   注:RNaseフリーの水でシステムをリンスし、以前の実行から残った残りのショ糖溶液を除去してください。
6. サンプルチューブをチューブピアサーに1本積み込みます。下から針でチューブをそっと貫通します。
7. ソフトウェアでの録画を開始します。シリンジポンプ(体積25mLの場合は流量1mL/分)と分数コレクターを起動して、ポリサム分画を収集します。分数設定を 30 秒に設定します。
   注:各実行前に、注射器またはチューブに気泡が入らないように、注射器を軽く押して、追跡液が針を通して連続的に流れるようにします。
8. 分数コレクターを使用して、1.5 mLチューブ(それぞれ500 μL)に分数を収集します。
9. 分数は、すぐに処理するか、-80°Cで保存することができます。
10. 分数の収集後、RNaseフリーの水でシステムをすすいで、残ったスクロースを取り除きます。

7. RNAの抽出

1. 各画分に、10 ngのルシメラーゼmRNAスパイクインコントロールを加える。
2. グアニジウムヒドロコライドベースの市販のRNA分離試薬を各画分に3ボリューム加えます。
3. 15 sの渦を簡単に。
4. 7.2で使用されている溶液と互換性のあるRNA抽出キットを使用してRNAを抽出します。

8. 逆転写とリアルタイム PCR

1. UV-Vis分光光度計を用いてRNAの濃度を測定します。
2. メーカーのプロトコルに従って、cDNA合成キットを使用して逆転写にRNAを対象とします。
3. 定量的リアルタイムPCR(qPCR)を使用して、 例としてgapdh mRNAの多ソーム分布を調べます。qPCRはqPCR検出システムとqPCRマスターミックス試薬を用いて行い、次のサイクリング条件で95°C、15sの95°Cの40サイクル、30sの場合は60°C、40sの場合は72°C、60sの場合は95°Cが続いた。
4. 増幅プロットからしきい値サイクル(Ct)値を取得し、ΔΔCt法を用いて折り畳み変化の計算に使用します。

9. スクロース勾配作りシステムアセンブリ

メモ:ショ糖勾配メーカーの各コンポーネントを組み立てる手順に従います(図1)。

1. ベースのブレッドボード(A1)に2つの垂直ブラケット(A2)を取り付けます。
2. 2 つのスリムな直角ブラケット (B2) を使用して、リニア ステージ アクチュエータをベースブレッドボード (A1) に取り付けます。
3. Ø12.7 mm アルミニウム ポスト(C2)のセットスクリューを使用して、チューブホルダーのスタンドとしてチューブホルダーベースブレッドボード(C1)に固定します。
4. ポスト(C2)とミニシリーズ光ポスト(C4)で、直角Ø1/2インチをØ6 mmポストクランプ(C3)に組み立てます。
5. 小さなVクランプ(C5)をチューブホルダーとして接続するには、光ポスト(C4)のセットスクリューを使用します。
6. チューブホルダーに遠心管を入れ、角度を調整して垂直にします。チューブの位置をマークし、ベースブレッドボード(C1)に台座ポストホルダー(C6)を取り付け、チューブを支えます。
7. ブレッドボード(A1)の反対側で、Ø12.7 mmアルミニウムポスト(D1)のセットスクリューを使用して固定し、直角Ø1/2"を使用してミニシリーズの光学ポスト(D3)をØ6 mmポストクランプ(D2)に接続します。
8. ミニチュア V クランプ (D4) を鈍端の針 (D5) でポスト (D3) に接続します。クランプの角度を調整して針を垂直に設定し、針が遠心管に合致するようにポストの長さを調整します。
9. アクチュエータ(B1)をステッパーモータードライバ(E1)に接続し、UNO R3コントローラボードとジョイスティックモジュールをUNOスターターキット(E2)から使用してアクチュエータを制御します。電源アダプタ(例えば、9-24 V AC/DC調整可能なパワーアダプタ)を使用して、モータを個別に駆動できます。
10. 勾配製造ステーションの隣に注射器ポンプ (F) を置き、注射器を針で接続します。
11. ジョイスティックを使用してチューブホルダーステージを上下に制御します。

コンポーネント	アイテム
B1	リニアステージアクチュエータ
E1	ステッパーモータードライバー
E2	UNOプロジェクトスーパースターターキット
A1	ブレッド ボード
A2	垂直ブラケット
B2	スリムな直角ブラケット
C1	ミニシリーズブレッドボード
C5	小型Vクランプ
D4	ミニチュアVクランプ
C2	Ø12.7 mmアルミニウムポスト
C4, D3	ミニシリーズ光学ポスト
D1	Ø12.7 mmアルミニウムポスト
C3,D2	直角Ø1/2"Ø6 mmポストクランプ
C6	ミニシリーズ台座ポストホルダーベース
D5	鈍い終わりの針
ヘ	シリンジポンプ

表3:システムコンポーネントを作るグラデーション

10. システムアセンブリの分画と検出 (図 2)。

1. チューブピアサーにUVモニターの光学モジュールを取り付けるには、通常の丸い顎のビュレットクランプを使用してください。チューブピアのコネタにチューブの一方の端(長さ1cm、内径0.56mm)を取り付け、もう一方の端を光学モジュールのFluid Inポートに取り付けます。流体アウトポートを分数部に接続します。
2. メーカーのマニュアルに従って、光学モジュールをUVモニタの制御ユニットに接続します。
3. ブレイクアウトケーブルを使用して、信号出力ソケットをグラウンドおよびアナログ入力接続のデジタルコンバータに接続します(製造元のマニュアルに従います)。
4. 通常のUSBケーブルを使用してデジタルコンバータをラップトップに接続し、データ収集ソフトウェアを使用して変換されたデジタル信号を記録します。

結果

デモンストレーションとして、75μg RNA(8胚からプール)を含む皮質リセートを、スクロース勾配によって12画分に分離した。254 nmにおけるUV吸光度のピークは、40Sサブユニット、60Sサブユニット、80Sモノソームおよびポリソームを含む画分を同定した(図4A)。大きいリボソームサブユニットのウェスタンブロットによる分画の分析は、Rpl10は60Sサブユニット(画分3)、単数(画?...

ディスカッション

ポリサムプロファイリングは、単一遺伝子およびゲノムワイドレベル¹⁴ の両方で翻訳状態を評価する一般的かつ強力な技術である。本レポートでは、開発中のマウス皮質を分析するための、ホームアセンブルプラットフォームとそのアプリケーションを用いたポリソームプロファイリングのプロトコルを紹介する。この費用対効果の高いプラットフォームは、堅牢で再現性?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M