Ensayo de fisiología térmica basado en el campo: recuperación de choque frío en condiciones ambientales

Resumen

Aquí, un protocolo accesible y de bajo costo se describe para evaluar la recuperación de choque frío de mariposas en condiciones ambientales ambientales.

Resumen

La fisiología ecológica, particularmente de los ectotermos, es cada vez más importante en este mundo cambiante, ya que utiliza medidas de especies y rasgos ambientales para explorar las interacciones entre los organismos y su entorno para comprender mejor su supervivencia y aptitud. Los ensayos térmicos tradicionales son costosos en términos de tiempo, dinero y equipo y, por lo tanto, a menudo se limitan a tamaños de muestra pequeños y pocas especies. Aquí se presenta un nuevo protocolo que genera datos detallados sobre el comportamiento individual y la fisiología de insectos terrestres grandes, volantes, utilizando el ejemplo de las mariposas. Este papel describe los métodos de un análisis frío de la recuperación del choque que se puede realizar en el campo bajo condiciones ambientales ambientales y no requiere el equipo costoso del laboratorio. Este método se ha utilizado para comprender la respuesta y la estrategia de recuperación al choque frío de las mariposas tropicales, generando datos a nivel individual en comunidades enteras de mariposas. Estos métodos se pueden emplear tanto en entornos de campo remotos como en aulas y se pueden utilizar para generar datos fisiológicos ecológicamente relevantes y como una herramienta de enseñanza.

Introducción

La integración de la fisiología térmica y la ecología a finales de la década de 1970 y principios de la década de 1980^1,2 lanzó el campo de la fisiología ecológica. Amplios estudios térmicos realizados sobre ectotermos ponen de relieve las sinergias ecológico-fisiológicas en diversos contextos ecoevolucionarios^3,4,5. La investigación sobre la fisiología térmica de organismos ectotérmicos ha recuperado la atención recientemente frente al cambio climático y la alteración de los paisajes térmicos en todo el mundo^6,7. Además de informar los estudios en el campo académico de la fisiología ecológica, los ensayos de fisiología térmica pueden ser ampliamente accesibles para los investigadores y pueden servir como un enfoque de enseñanza práctica para todos los niveles. Los componentes del rendimiento térmico, incluidos los límites térmicos y los efectos de los choques de temperatura, son fundamentales para la ecología, el comportamiento y la historia de vida de los animales^8,9.

Específicamente, los ecotómamos se utilizan para abordar cuestiones de fisiología, ya que la endotermia dicta un vínculo inextricable entre la temperatura ambiente y la del organismo. El rango de temperatura que los organismos pueden soportar (su rango térmico crítico de mínimo a máximo térmico) y las temperaturas a las que se maximizan sus comportamientos y aptitud (optimas térmicos) a menudo están arraigados en procesos ecológicos y evolutivos. Estos rasgos fisiológicos son cada vez más importantes ya que las temperaturas, tanto medias como extremas, están aumentando^10. Por ejemplo, los cambios abióticos, incluidos los aumentos de temperatura, que acompañan a la destrucción y fragmentación del hábitat han afectado a las comunidades de ectotermos, incluidos los anuranos, limitando las especies fisiológicamente frágiles (con estrecha tolerancia térmica) a pequeños parches remanentes de hábitat^11,12.

La evaluación de los componentes clave del rendimiento térmico puede ser costosa tanto en términos de tiempo como de recursos y, tradicionalmente, requiere equipos de laboratorio y condiciones estandarizadas. Además, los ensayos convencionales a menudo no reflejan la amplitud de las condiciones ambientales experimentadas en la naturaleza por un animal dado^13, ya que la temperatura en experimentos de fisiología similares está cuidadosamente controlada y a menudo no está relacionada con las condiciones ambientales experimentadas por un animal. Este control de la temperatura puede disminuir la comprensión de la variación en las respuestas individuales^2,14. Los fisiólogos han confiado en experimentos de calefacción y refrigeración basados en laboratorio, utilizando baños de agua programables para calentar o enfriar constantemente el entorno de un animal para informar las curvas de rendimiento térmico¹⁵.

Por lo general, los animales se colocan en viales con un termopar, y su temperatura ambiente se cambia constantemente mediante el control de la temperatura del baño de agua circundante. Los investigadores miden el tiempo que se tarda en lograr un estado fisiológico alterado (por ejemplo, coma frío, caída) y la temperatura a la que se produjo el cambio de estado^16,17. A partir de un mínimo de USD $500, estas herramientas son grandes, pesadas y requieren equipo técnico adicional (por ejemplo, computadora, termopares). En consecuencia, las herramientas básicas para llevar a cabo los métodos clásicos de evaluación del rendimiento térmico son 1) no económicamente accesibles para todos, 2) no son adecuadas para ensayar animales demasiado grandes para ser contenidos en viales habituales utilizados para pequeños dípteros, y 3) no son portátiles para su uso en entornos de campo remoto. La adhesión a la práctica común ha dado lugar a una representación limitada a través de la taxonomía y las condiciones^{experimentales 18,19,20}.

Si bien las curvas de rendimiento térmico completas pueden informar la distribución de las especies, los rasgos de la historia de vida y el comportamiento, entre otros rasgos, la cuantificación de menos métricas térmicas y más simples puede ser más eficiente y aún extremadamente informativa. Los ensayos fisiológicos, que miden el inicio del coma frío y la posterior recuperación del choque frío, el endurecimiento en frío y el comportamiento corrector, son proxies efectivos y ejecutables para el mínimo térmico crítico de un organismo⁸. Aquí se describe un ensayo de choque frío útil para obtener datos fisiológicos de grandes insectos ectotérmicos terrestres. El ensayo es asequible, accesible y fácil de ejecutar en condiciones de campo o en el aula. Los datos sobre la recuperación de choques fríos generados por este protocolo se pueden combinar con datos de especies o rasgos a nivel individual para responder a preguntas relacionadas con la fisiología ecológica y / o utilizados para enseñar a los estudiantes sobre los principios fisiológicos.

Protocolo

1. Identificación de especies de interés

1. Identificar especies de interés para determinar el tiempo de recuperación del choque frío. Tenga en cuenta que cada grupo diferirá en el tiempo que se tarda en inducir un coma frío (es decir, el punto en el que el insecto todavía está vivo, pero no se mueve y no responde). Del mismo modo, en función del organismo y el uso de los datos, elija diferentes puntos de corte en los que detener el experimento si el individuo o individuos focales no vuelan (ver sección 4).
   NOTA: Este protocolo fue diseñado y desarrollado para su uso en lepidópteros. Sin embargo, es aplicable a insectos terrestres grandes y volantes, en particular, aquellos que se pueden almacenar planos en envolturas de vidrio que restringen el movimiento y el daño (por ejemplo, mariposas y libélulas / damiselas).

2. Realización de un juicio previo

1. Realizar un juicio previo en una pequeña muestra de individuos para determinar los parámetros clave. Siga las secciones 3 a 5 del protocolo a continuación con 5-10 personas para un juicio previo.
   1. Pruebe el tiempo requerido en el hielo para inducir un coma frío (no en movimiento), pero no mate a las especies focales siguiendo el paso 5.1 utilizando tratamientos de 30 min, 60 min y 90 min.
      NOTA: El tiempo necesario para inducir un coma frío dependerá del tamaño, la ubicación y la historia natural / comportamiento de los individuos.
   2. Sobre la base de los resultados de los pasos 4.1-4.4 y utilizando el conocimiento de la ecología de los insectos focales, elija un momento en el que concluir el ensayo si un individuo determinado no realiza una recuperación completa. Base este corte de tiempo en la ecología de la especie también, teniendo en cuenta que después de muchos minutos de ser incapaz de volar, muchos insectos son depredados.
      NOTA: Por ejemplo, si la mayoría de las pruebas preliminares terminan en vuelo después de 15 minutos, uno podría decidir terminar las pruebas después de 25 minutos para asegurarse de que incluso los valores atípicos tengan la oportunidad de recuperarse completamente (es decir, volar). Este protocolo se basa en un tiempo de corte de 30 minutos (paso 5.4).
2. Utilice parámetros de los datos previos al juicio para informar la recopilación de datos para los experimentos. Modificar el protocolo descrito a continuación en función de las necesidades de los organismos focales, incluido el tiempo en la suspensión de hielo, el momento en que llamar a los ensayos a un final y los comportamientos documentados en la hoja de datos (por ejemplo, el escalofrío puede ser un comportamiento inapropiado para el insecto de elección).
   1. Defina preguntas de investigación específicas que se responderán con estos datos mientras refina los parámetros.
      NOTA: Por ejemplo, si el investigador está interesado en el efecto de la exposición prolongada en la recuperación, el tiempo en hielo es una variable clave a modificar. Si los investigadores están interesados en las diferencias en la fisiología entre las especies de color claro y oscuro, pueden elegir dos especies de colores distintivos o modificar el color del ala del insecto para medir el efecto del color del ala en el tiempo de recuperación. Es importante destacar que este método es altamente personalizable a las necesidades y preguntas de investigación planteadas (consulte la sección de discusión).

3. Colección de insectos

1. Recoger insectos utilizando métodos apropiados como trampas de cebo y redes entomológicas, (Figura suplementaria 1). Tras la recolección, coloque a cada individuo en un sobre de cristal separado con una identificación única.
2. Almacene a los animales en un lugar sombreado y fresco después de ser capturados y antes de exponerlos al experimento de choque frío. Siempre exponga al animal al tratamiento experimental dentro de las 24 h de ser capturado, y estandarice esta vez tanto como sea posible a través de los ensayos.
   1. Aunque las condiciones de almacenamiento pueden variar, mantenga a los insectos fuera del sol directo. Si es posible, colóelos en el interior en una habitación fresca y oscura.
   2. En el campo, asegúrese de que estarán sombreados mientras están almacenados y están protegidos del viento (soplando) y otros depredadores de insectos que pueden entrar en los sobres.

4. Configurar el experimento de choque frío

1. Llene un refrigerador con hielo y agua. Asegúrese de que haya suficiente hielo para persistir durante al menos una hora, y agregue hielo periódicamente según sea necesario con el objetivo de mantener el medio ambiente en el agua a 0 °C.
2. Elija entre 1 y 4 individuos focales para una ronda de experimentación, asegurándose de que cada individuo sea identificable.
   1. Si utiliza varias especies, utilice sólo una de cada una para evitar confundir a los individuos en la hoja de datos. Si experimenta con una sola especie, solo use individuos que puedan distinguirse fácilmente, por ejemplo, por un ala rota o una marca distintiva.
   2. Si el objetivo del experimento no está relacionado con la coloración de las alas, marque las alas con identificaciones únicas (por ejemplo, números) con un marcador fino con punta de fieltro para distinguir a los individuos.
   3. Si los experimentos no cumplen ninguno de los criterios anteriores, realice el experimento en un individuo a la vez.
3. Rellenar las filas de la ficha técnica con la información pertinente a cada insecto ensayado incluyendo su id. único y un identificador útil en las notas como el nombre de la especie o el carácter distintivo (Tabla suplementaria 1).
4. Coloque a todos los individuos focales (aún en sus sobres marcados individualmente) en una bolsa de plástico sellada con un peso(Tabla de Materiales),y coloque la bolsa en agua helada durante 60 minutos (o hasta que se haya inducido el coma de enfriamiento; ver discusión) (Figura suplementaria 2).
   1. Asegúrese de que el peso sea pesado (por ejemplo, monedas grandes, arandelas grandes o rocas lisas) y lo suficientemente grande como para mantener la bolsa de insectos sumergida en el agua helada y perpendicular a la superficie del agua. Use un peso que no cause fugas en la bolsa de plástico sellada.
      NOTA: Mientras que los insectos todavía son capaces de recuperarse si se exponen directamente al agua mientras están sumergidos, las envolturas húmedas complican la eliminación de cada individuo. Lo mejor es mantener los insectos secos en su bolsa.
5. Registre datos de temperatura y luz.
   1. Utilice un registrador de datos (consulte la Tabla de materiales)para registrar los datos de temperatura ambiente y luz mediante los pasos 5.1 o 5.2.
      1. Programe el registrador de datos para recopilar datos de temperatura y luz a intervalos de 10 s, comenzando en el momento en que se liberarán los insectos.
      2. Base la hora de inicio del registrador de datos en cuando los insectos se colocaron en el agua helada. Asegúrese de que la información del registrador de datos (fecha, hora) esté sincronizada para que los datos sobre las condiciones ambientales puedan coincidir posteriormente con cada insecto focal individual.
   2. Utilice un termómetro simple para registrar datos de temperatura y luz a intervalos cortos a mano (por un segundo investigador).
      1. Decida los parámetros experimentales que se asociarán con el tiempo de recuperación que se puede medir sin un registrador de datos. Utilice tratamientos distintos: sombra / sol; crepúsculo/mediodía.
6. Coloque una jaula de malla para los insectos en un lugar apropiado para que la temperatura y los ambientes ligeros sean lo más homogéneos posible dentro de la jaula, y para que la base de la jaula esté elevada y pueda ser aprovechada por el observador.
7. Coloque el registrador de datos justo fuera de la jaula, o dentro de la jaula para que no sea derribado o afectado de otra manera por pequeños movimientos dentro de la jaula. Si no utiliza un registrador de datos, coloque un termómetro adecuadamente y/o configure las jaulas en la configuración adecuada.
   NOTA: El registrador de datos debe colocarse de manera que las condiciones ambientales registradas sean lo más cercanas posible a las que está experimentando el insecto.

5. Comienza el experimento de choque frío

1. Retire los animales del baño de agua helada después de 60 minutos (o el tiempo determinado apropiado; ver arriba). Retire inmediatamente los insectos de la bolsa de plástico y retire a cada individuo de su sobre lo más rápido posible, minimizando la manipulación (Figura suplementaria 3).
2. Inicie el cronómetro tan pronto como los animales estén en las jaulas de malla (véanse los datos de ejemplo, cuadro suplementario 1).
3. Toque la base de la jaula con un lápiz para agitar a los insectos en recuperación.
   NOTA: Proporcionar estímulos durante la recuperación asegura que los insectos focales demuestren el estado y los comportamientos de recuperación tan pronto como sean fisiológicamente capaces (Video Suplementario).
   1. Toque con frecuencia y con la suficiente fuerza para asegurarse de que un animal responderá si es posible, pero no causará una respuesta.
      NOTA: Por ejemplo, al tocar la jaula, si un animal es catapultado en el aire y aterriza en posición vertical, pero no se mueve para mantenerse de pie por sí mismo, eso no se considera un comportamiento de "soporte", ya que el organismo no se defendió por sí solo.
4. Marque el ensayo como completo una vez que un individuo ha volado (es decir, muestra una recuperación completa). Finalizar el ensayo y considerar que el insecto ha logrado una recuperación completa si no se mueve después de 30 min.
5. Retire los insectos de la jaula de malla y coloque a los individuos de nuevo en sus sobres de vidrio etiquetados. Libere a los animales o manténgalos para una mayor recopilación de datos (por ejemplo, rasgos individuales de tamaño, peso).
6. Si utiliza un registrador de datos, detenga la recopilación de datos del registrador de datos y guarde el archivo de datos de temperatura y luz durante el experimento con la información de fecha y hora adecuada.

6. Tratamiento de datos

1. Ingrese los datos presentados de la hoja de datos en una hoja de cálculo (por ejemplo, MS Excel).
2. Si utiliza un registrador de datos, agregue datos de temperatura y luz para cada respuesta de cada individuo ensayado.
   1. Calcular la media y la desviación estándar de la temperatura y la luz para cada comportamiento de cada individuo.
      NOTA: Como el registrador de datos registra los datos cada 10 s, si el comportamiento del soporte para un animal tardó 48 s en producirse, utilice las primeras 5 entradas del registrador de datos para ese ensayo.
   2. Asocie cada comportamiento de recuperación de cada individuo con los datos abióticos registrados por el datalogger, redondeando hacia arriba o hacia abajo a intervalos de 10 s según sea necesario.
3. Trazar y analizar datos. La Figura 1,por ejemplo, visualiza el efecto de la temperatura y la luz en el tiempo de recuperación del choque frío. Recopilar otros datos relevantes (rasgos de especies, características regionales del hábitat) para examinar los patrones ecológicos y evolutivos en los rasgos fisiológicos de los grupos analizados.
   NOTA: La Figura 1 se trazó utilizando el paquete ggplot2 en R. El nivel de detalle de los datos sobre las condiciones ambientales variará en función de los instrumentos utilizados para medir las condiciones ambientales. Si se utiliza un registrador de datos, se pueden generar cifras con detalles comparables a la Figura 2. Si se utiliza un termómetro, el investigador no podrá crear una gráfica informada por la luz ambiental. Del mismo modo, si los investigadores utilizan categorías de luz o temperatura, estas gráficas de dispersión se pueden modificar en gráficas de caja u otra plantilla apropiada para ilustrar estos fenómenos.

Resultados

Los datos recogidos en este protocolo permiten la examinación y repartir de variables importantes a la fisiología organismal. Por ejemplo, tanto la temperatura como las condiciones de luz contribuyen a la recuperación de las mariposas del choque frío (Figura 1). La trama pretende explorar la interacción entre las condiciones ambientales y la recuperación de choques fríos. Utilizando mariposas capturadas en la naturaleza tanto de trampas como de redes, 181 especies de mariposas demostraron una clara recuperación del coma frío inducido por el choque frío (Figura 2). Los datos presentados en la Figura 2 fueron recolectados por tres observadores durante aproximadamente cinco meses (enero, febrero, mayo-julio de 2020) en los Andes colombianos. Los experimentos siempre se llevaron a cabo en la mañana después de la recolección de mariposas. Con la máxima eficiencia, fue posible que dos observadores observaran simultáneamente cuatro mariposas cada una, repetidas siete veces (mínimo 7,37 horas), lo que resultó en la prueba de 56 individuos en una sola mañana. Esto permitió una gran cantidad de recopilación de datos en comunidades enteras de mariposas, al tiempo que incluía y consideraba datos sobre la variación individual. Como los ensayos pueden ocurrir bajo condiciones ambientales ambientales, las condiciones de recuperación son representativas de sus hábitats y reflejan la variación natural experimentada por los organismos en la naturaleza. La Figura 3 ilustra la superposición entre las condiciones de temperatura y luz del experimento de recuperación de choque frío y las condiciones en un pasto del que se recolectaron algunas mariposas probadas.

Figura 1:Gráficas dispersas del tiempo de recuperación (en segundos) de las mariposas después del choque frío. (A)Temperatura media y(B)LUX medio (intensidad de la luz) durante su recuperación. Las especies están organizadas y coloreadas por familia. En general, a medida que aumenta la luz y la temperatura, el tiempo de recuperación del choque frío disminuye, mostrando variabilidad entre los taxones. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de resultados del ensayo de recuperación de choque frío en 181 especies de mariposas de los Andes colombianos. Los datos representan el número de segundos que transcurrieron para sacar a la mariposa del frío y cuándo pudo volar. Las especies están organizadas y coloreadas por familia. Esta figura demuestra la amplitud taxonómica a través de la cual este experimento se puede aplicar con éxito, y la variedad de respuestas de recuperación de choque frío a través de las especies. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3:Temperatura ambiente y LUX durante los ensayos de recuperación de choques fríos. Gráfica de temperatura ambiente (azul) y LUX (intensidad de la luz, rojo) según lo registrado por los registradores de datos colocados en los pastos donde se llevó a cabo la recolección de mariposas (colores claros, condiciones que abarcan todo el día) y condiciones durante las pruebas de recuperación de choque frío (colores oscuros, solo horas de la mañana). Las condiciones ambientales del campo y las condiciones experimentales trazadas muestran el rango y las condiciones promedio experimentadas por las mariposas durante una semana de muestreo y experimentación en el campo. Los experimentos solo se llevaron a cabo en horas tempranas (07:00-13:00 h), mientras que los dataloggers se desplegaron en el campo durante una semana (se muestran las horas del día, 06:00-18:00 h). Aquí se muestra la superposición entre las condiciones experimentales y las condiciones ambientales experimentadas por las mariposas, lo que demuestra la relevancia ecológica de la realización de ensayos de fisiología en condiciones ambientales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura suplementaria 1: Procedimiento para la recogida de insectos focales-eneste caso, mariposas-utilizando trampas Van-Someren con cebo y redes activas. Las trampas fueron cebadas con peces en descomposición y cebos de frutas podridas. Trampa (sin cebo) en el fondo, en primer plano es un espécimen en su envoltura única contra una caja de colección de plástico azul. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2:Bolsas con hasta cuatro mariposas individuales sumergidas en agua helada en un refrigerador. Las bolsas de plástico se marcaron con el tiempo en que se colocaron en el agua helada, para que los experimentos de choque frío pudieran escalonarse a lo largo de la mañana. Las bolsas de plástico deben sellarse para evitar que las muestras se mojen; sin embargo, la inundación de las bolsas y el sobre en este caso no tuvo un efecto medible en la recuperación de las mariposas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Dos observadores recopilan datos sobre el terreno. Cada jaula de malla contiene cuatro mariposas únicas que se recuperan del choque frío. La articulación en T de cloruro de polivinilo en la jaula alberga el registrador de datos para evitar la exposición directa al sol o la lluvia. Cada observador tiene un cronómetro que se inició inmediatamente después de la liberación de la mariposa en la jaula. Las jaulas son elevadas por bancos, lo que permite a los observadores agitar la base de la jaula para asegurarse de que las mariposas respondieron de manera conductual lo más rápido posible fisiológicamente. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Ejemplo de hoja de datos. La hoja muestra el ID único de cada mariposa según lo asignado en el campo y los caracteres distintivos (nombre de la especie, colores clave) en las notas. También se registra la posición dominante de la mariposa (es decir, qué lado del ala estuvo expuesto al sol) durante el período de recuperación, anotado como D (dorsal) o V (ventral). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Video suplementario 1: Tapping de la jaula para la recuperación de choque frío. A medida que las mariposas se recuperan, el observador toca la base de la jaula suavemente para inducir comportamientos tan pronto como las mariposas son capaces. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

El estudio de la fisiología térmica incorpora medidas de especies y rasgos ambientales para comprender mejor las interacciones entre los organismos y su entorno que son clave para la supervivencia y la aptitud. Si bien siempre son parte integral de la comprensión de la historia natural y la ecología de las plantas y los animales, los rasgos térmicos son de creciente importancia frente al paisaje y el cambio climático^11,21. Varios grupos de insectos terrestres ectotérmicos, en particular, lepidópteros y odonatanes, son relativamente grandes y abundantes, exhiben comportamientos distintos y son susceptibles de manipulación. Aquí se describe un ensayo eficiente y de bajo costo para medir eficazmente las respuestas fisiológicas de tales insectos. Este protocolo requiere una fuente de organismos sanos para ensayar, cuyo tiempo de manejo antes del experimento es limitado. Si bien es flexible en el número de organismos ensayados a la vez, el número de individuos focales por experimento variará según el propósito de la recopilación de datos y/o el número de observadores.

Por ejemplo, este protocolo fue desarrollado para recopilar datos individuales detallados sobre mariposas en comunidades enteras. Como tal, los resultados representativos ilustran un esfuerzo por maximizar la recopilación de datos para individuos de tantas especies como sea posible y bajo una variedad de condiciones relevantes para el medio ambiente local. Independientemente del número de especies focales, es crucial que el observador pueda identificar a cada individuo en la jaula que experimenta la recuperación. Si el objetivo es recopilar datos de una sola especie, entonces solo uno o dos individuos (si son identificables en función de un desgaste diferente del ala o si están marcados individualmente) deben ser ensayados a la vez. Los temas de estudio deben ser elegidos de acuerdo con una pregunta de investigación específica o plan de estudio. Según la pregunta planteada y el propósito de la recopilación de datos (investigación o aula, por ejemplo), el tamaño de la muestra y la recopilación de otros rasgos diferirán.

Para ilustrar los componentes fundamentales de la fisiología dilucidada por este protocolo (inducción del coma frío, pasos de la recuperación, papel de las condiciones ambientales), un instructor de aula puede elegir dos especies distintas o morfos de una sola especie. Si los individuos focales difieren solo en un rasgo clave (por ejemplo, el color), será necesario un tamaño de muestra más pequeño, y los estudiantes pueden estudiar de cerca la relación de ese rasgo y la fisiología del organismo. Los investigadores interesados en la fisiología ecológica pueden utilizar sus datos experimentales para explorar cuestiones ecológicas y evolutivas complejas. Los investigadores deben asegurarse de elegir cuidadosamente los insectos focales que abordan directamente sus preguntas (por ejemplo, en función de la etapa de la vida, la edad, el sexo, la ubicación) y, en función del número de variables involucradas, determinar el tamaño de la muestra apropiado. Los tamaños de muestra para modelos complejos serán mayores que los descritos anteriormente.

Al recopilar datos de recuperación de comportamiento, es clave que la jaula descanse por encima del suelo porque el observador debe ser capaz de tocar la parte inferior de la jaula para provocar comportamientos de recuperación. Esto asegura que el organismo responda (se para, vuele) tan pronto como sea fisiológicamente capaz de hacerlo, y se documente el comportamiento de recuperación terminal (vuelo). El registro de las condiciones ambientales durante la recuperación del choque frío es parte integral del estudio de la fisiología térmica, ya que este protocolo está diseñado para estudiar y desentrañar el papel del medio ambiente en la fisiología del organismo. Los registradores de datos (consulte la Tabla de materiales)son útiles para registrar medidas estandarizadas de condiciones relevantes (por ejemplo, temperatura, luz e incluso humedad). Sin embargo, si estas herramientas no están disponibles, las condiciones relevantes se pueden medir de otras maneras, como con un termómetro digital o simplificando la variable de las condiciones ambientales y utilizando entornos distintos como la sombra y el sol. Este protocolo le da al investigador opciones para medir las condiciones durante la recuperación del choque frío en función del propósito y el alcance del estudio.

Aunque este método se puede modificar para adaptarse mejor a grupos taxonómicos específicos, se recomienda que se utilicen insectos volantes grandes. Se puede considerar que los insectos voladores que recuperan su capacidad de volar de forma independiente han logrado una recuperación completa. El método, como se describe, se utilizó con éxito en mariposas en los trópicos y subtrópicos. Con base en las tendencias térmicas de un área determinada (es decir, el rango de temperaturas experimentadas en un sitio que variará, influyendo así en las expectativas basadas en la elevación, la latitud, la cubierta del dosel), un organismo puede requerir más o menos de una hora en un baño de agua helada para entrar en un coma frío. El tamaño del organismo también puede afectar el tiempo necesario para entrar en coma frío. Es clave encontrar el tiempo de exposición al frío necesario para inducir un coma frío (no moverse), pero no matar a las especies focales. El tiempo requerido para inducir un coma frío dependerá del tamaño, la ubicación y la historia natural / comportamiento de los individuos. De acuerdo con los resultados del experimento frío del choque descrito aquí y usando el conocimiento de la ecología de los insectos focales, elija un momento en el cual concluir el ensayo si un individuo dado no hace una recuperación completa.

Basado en las preguntas específicas del investigador, este método se puede emplear en el campo o en el laboratorio para permitir tanto la variación ambiental natural como el control de variables importantes, respectivamente. Este ensayo es simple y barato y ayuda a llenar los vacíos existentes en el campo de la fisiología térmica. La facilidad de este protocolo hace que sea accesible para el empleo de una amplia gama de taxones, abriendo el campo a más de organismos amigables con el laboratorio. La novedad de realizar un ensayo térmico estandarizado pero ambiental llena el vacío entre los resultados de laboratorio y de campo²². Aprovechar las condiciones ambientales para la recuperación de organismos ayudará a los investigadores a dividir el papel de los factores ambientales y de las especies en^{la fisiología 14,22}. Finalmente, debido a su bajo costo y la falta de materiales requeridos, este protocolo se puede utilizar en lugares remotos en el campo con poco equipo, ideal para muchos biólogos de campo, así como en las aulas para permitir a los jóvenes estudiantes una experiencia de aprendizaje práctico.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage	Bioquip	1466PB	Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments.
Cooler	Any	NA
Glassine envelopes	Bioquip	1130B
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger	Onset	UA-002-08	If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information.
HOBO Optic USB Base Station	Onset	Base-U-1
Ice water	NA	NA
Insects (focal taxa)	NA	Any	Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location)
PVC T-joint	Any	Any
Sealable plastic bag	Any	NA
Stopwatch/timer	Any	NA
Weight	Any	NA	Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal.