Feldbasierter thermischer Physiologie-Assay: Kälteschockrückgewinnung unter Umgebungsbedingungen

Zusammenfassung

Hier wird ein kostengünstiges, zugängliches Protokoll beschrieben, um die Kälteschockrückgewinnung von Schmetterlingen unter Umgebungsbedingungen zu bewerten.

Zusammenfassung

Die ökologische Physiologie, insbesondere der Ektothermen, wird in dieser sich verändernden Welt immer wichtiger, da sie Messungen von Arten und Umweltmerkmalen verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Organismen und ihrer Umgebung zu untersuchen, um ihr Überleben und ihre Fitness besser zu verstehen. Herkömmliche thermische Assays sind in Bezug auf Zeit, Geld und Ausrüstung kostspielig und daher oft auf kleine Stichprobengrößen und wenige Arten beschränkt. Hier wird ein neuartiges Protokoll vorgestellt, das detaillierte Daten über das individuelle Verhalten und die Physiologie großer, volanter, terrestrischer Insekten am Beispiel von Schmetterlingen generiert. Dieses Papier beschreibt die Methoden eines Kaltschock-Wiederherstellungstests, der im Feld unter Umgebungsbedingungen durchgeführt werden kann und keine kostspielige Laborausrüstung erfordert. Diese Methode wurde verwendet, um die Reaktions- und Erholungsstrategie auf den Kälteschock tropischer Schmetterlinge zu verstehen und Daten auf individueller Ebene über ganze Schmetterlingsgemeinschaften hinweg zu generieren. Diese Methoden können sowohl in abgelegenen Feldumgebungen als auch in Klassenzimmern eingesetzt werden und können zur Generierung ökologisch relevanter physiologischer Daten und als Lehrmittel verwendet werden.

Einleitung

Die Integration von thermischer Physiologie und Ökologie in den späten 1970er und frühen 1980er Jahren^1,2 startete das Gebiet der ökologischen Physiologie. Umfangreiche thermische Studien, die an Ektothermen durchgeführt wurden, zeigen ökologisch-physiologische Synergien in verschiedenen öko-evolutionären Kontexten^{auf 3,4,5}. Die Forschung zur thermischen Physiologie ektothermer Organismen hat in jüngster Zeit angesichts des Klimawandels und der veränderten thermischen Landschaften auf der ganzen Welt wieder Anachtung erlangt^6,7. Neben der Information über Studien im akademischen Bereich der ökologischen Physiologie können thermische Physiologie-Assays für Forscher allgemein zugänglich sein und als praktischer Lehransatz für alle Ebenen dienen. Komponenten der thermischen Leistung, einschließlich thermischer Grenzen und Auswirkungen von Temperaturschocks, sind grundlegend für die Ökologie, das Verhalten und die Lebensgeschichte von Tieren^8,9.

Insbesondere werden Ökotothermen verwendet, um Fragen der Physiologie zu beantworten, da die Endothermie eine untrennbare Verbindung zwischen Umgebungs- und Organismustemperatur vorschreibt. Der Temperaturbereich, dem Organismen standhalten können (ihr kritisches thermisches Minimum bis maximal-thermischer Bereich) und die Temperaturen, bei denen ihr Verhalten und ihre Fitness maximiert werden (thermal optima), sind oft in ökologischen und evolutionären Prozessen verwurzelt. Diese physiologischen Merkmale sind von zunehmender Bedeutung, da die Temperaturen, sowohl Mittel als auch Extreme, um^{10 steigen.} Zum Beispiel haben die abiotischen Veränderungen, einschließlich Temperaturerhöhungen, die mit der Zerstörung und Fragmentierung von Lebensräumen einhergehen, Gemeinschaften von Ektothermen, einschließlich Anuren, beeinflusst und physiologisch fragile Arten (mit enger thermischer Toleranz) auf kleine Restlebensraumflecken^{beschränkt 11,12}.

Die Bewertung von Schlüsselkomponenten der thermischen Leistung kann sowohl in Bezug auf Zeit als auch Ressourcen teuer sein und erfordert traditionell Laborgeräte und standardisierte Bedingungen. Darüber hinaus spiegeln herkömmliche Assays oft nicht die Breite der Umgebungsbedingungen wider, die ein bestimmtes Tier in der Natur erlebt^13, da die Temperatur in ähnlichen physiologischen Experimenten sorgfältig kontrolliert wird und oft nichts mit den Umgebungsbedingungen eines Tieres zu tun hat. Diese Temperaturregelung kann das Verständnis der Variation der einzelnen Reaktionen verringern^2,14. Physiologen haben sich auf laborbasierte Heiz- und Kühlexperimente verlassen, bei denen programmierbare Wasserbäder verwendet wurden, um die Umgebung eines Tieres stetig zu erwärmen oder zu kühlen, um thermische Leistungskurven zu erstellen¹⁵.

Typischerweise werden Tiere in Fläschchen mit einem Thermoelement gelegt, und ihre Umgebungstemperatur wird durch die Kontrolle der Temperatur des umgebenden Wasserbades stetig verändert. Die Forscher messen die Zeit, die benötigt wird, um einen veränderten physiologischen Zustand zu erreichen (z. B. Kühlkoma, Knockdown) und die Temperatur, bei der die Statusänderung aufgetreten ist^16,17. Ab einem Minimum von 500 US$Dollar sind diese Werkzeuge groß, schwer und erfordern zusätzliche technische Ausrüstung (z. B. Computer, Thermoelemente). Folglich sind die grundlegenden Werkzeuge zur Durchführung klassischer Methoden zur Beurteilung der thermischen Leistung 1) nicht für alle wirtschaftlich zugänglich, 2) nicht für die Untersuchung von Tieren geeignet, die zu groß sind, um in üblichen Fläschchen für kleine Dipteren enthalten zu sein, und 3) nicht tragbar für den Einsatz in abgelegenen Feldumgebungen. Die Einhaltung der gängigen Praxis hat zu einer begrenzten Repräsentation über Taxonomie und experimentelle Bedingungen hinweg geführt^18,19,20.

Während vollständige thermische Leistungskurven unter anderem die Artenverteilung, die Merkmale der Lebensgeschichte und das Verhalten beeinflussen können, kann die Quantifizierung von weniger und einfacheren thermischen Metriken effizienter und dennoch äußerst informativ sein. Physiologische Assays, die den Beginn des Kaltkalkomas und die anschließende Kaltschockrückgewinnung, das Kalthärten und das Aufrichten des Verhaltens messen, sind effektive und ausführbare Proxys für das kritische thermische Minimum eines Organismus⁸. Hier wird ein Kälteschock-Assay beschrieben, der nützlich ist, um physiologische Daten von großen terrestrischen ektothermischen Insekten zu erhalten. Der Assay ist erschwinglich, zugänglich und einfach unter Feldbedingungen oder im Klassenzimmer durchzuführen. Daten zur Erholung von Kälteschocks, die durch dieses Protokoll generiert werden, können mit Merkmalsdaten auf Arten- oder individueller Ebene gekoppelt werden, um Fragen zur ökologischen Physiologie zu verfolgen und / oder verwendet werden, um Studenten über physiologische Prinzipien zu unterrichten.

Protokoll

1. Identifizierung von Arten von Interesse

1. Identifizieren Sie interessante Arten, um die Erholungszeit für Kälteschocks zu bestimmen. Denken Sie daran, dass sich jede Gruppe in der Zeit unterscheidet, die benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren (dh der Punkt, an dem das Insekt noch lebt, sich aber nicht bewegt und nicht reagiert). Wählen Sie ebenfalls basierend auf dem Organismus und der Verwendung von Daten verschiedene Cutoff-Punkte, an denen das Experiment abgebrochen werden soll, wenn die fokalen Personen nicht fliegen (siehe Abschnitt 4).
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die Verwendung auf Lepidoptera entworfen und entwickelt. Es gilt jedoch für große, volante, terrestrische Insekten, insbesondere solche, die flach in Glassinhüllen gelagert werden können, die Bewegung und Schäden einschränken (z. B. Schmetterlinge und Libellen / Libellen).

2. Durchführung eines Vorverfahrens

1. Führen Sie ein Vorverfahren an einer kleinen Stichprobe von Personen durch, um die Schlüsselparameter zu bestimmen. Befolgen Sie die Abschnitte 3 bis 5 des folgenden Protokolls mit 5-10 Personen für ein Vorverfahren.
   1. Testen Sie die Zeit, die auf Eis benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren (sich nicht zu bewegen), aber töten Sie die fokalen Spezies nicht, indem Sie Schritt 5.1 mit Behandlungen von 30 min, 60 min und 90 min befolgen.
      HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren, hängt von der Größe, dem Standort und der natürlichen Geschichte / dem Verhalten der Individuen ab.
   2. Basierend auf den Ergebnissen der Schritte 4.1-4.4 und unter Verwendung von Kenntnissen über die Ökologie der fokalen Insekten, wählen Sie einen Zeitpunkt, zu dem die Studie abgeschlossen werden kann, wenn sich eine bestimmte Person nicht vollständig erholt. Basieren Sie diese Zeit auch auf der Ökologie der Art, wobei Zu denken ist, dass nach vielen Minuten der Flugunfähigkeit viele Insekten vorveredelt sind.
      HINWEIS: Wenn zum Beispiel die meisten Vorversuche nach 15 Minuten im Flug enden, könnte man sich entscheiden, die Versuche nach 25 Minuten zu beenden, um sicherzustellen, dass auch Ausreißer eine Chance haben, sich vollständig zu erholen (dh zu fliegen). Dieses Protokoll basiert auf einer Cutoff-Zeit von 30 Minuten (Schritt 5.4).
2. Verwenden Sie Parameter aus vorgerichtlichen Daten, um die Datenerfassung für die Experimente zu informieren. Ändern Sie das unten beschriebene Protokoll basierend auf den Bedürfnissen der Fokalorganismen, einschließlich der Zeit in der Eisaufschlämmung, der Zeit, zu der Versuche beendet werden, und der auf dem Datenblatt dokumentierten Verhaltensweisen (z. B. kann Zittern ein unangemessenes Verhalten für das Insekt der Wahl sein).
   1. Definieren Sie spezifische Forschungsfragen, die mit diesen Daten beantwortet werden sollen, während Sie die Parameter verfeinern.
      HINWEIS: Wenn der Forscher beispielsweise an der Wirkung einer längeren Exposition auf die Erholung interessiert ist, ist die Zeit im Eis eine Schlüsselvariable, die es zu ändern gilt. Wenn Forscher an Unterschieden in der Physiologie zwischen hell- und dunkel gefärbten Arten interessiert sind, können sie entweder zwei deutlich gefärbte Arten wählen oder die Flügelfarbe des Insekts modifizieren, um die Wirkung der Flügelfarbe auf die Erholungszeit zu messen. Wichtig ist, dass diese Methode in hohem Maße an die Bedürfnisse und Forschungsfragen angepasst werden kann (siehe Diskussionsabschnitt).

3. Sammlung von Insekten

1. Sammeln Sie Insekten mit geeigneten Methoden wie Köderfallen und entomologischen Netzen (Ergänzende Abbildung 1). Legen Sie jede Person nach der Abholung in einen separaten Glassine-Umschlag mit einem eindeutigen Ausweis.
2. Lagern Sie die Tiere an einem schattigen, kühlen Ort, nachdem sie gefangen wurden und bevor Sie sie dem Kälteschockexperiment zustellen. Setzen Sie das Tier immer innerhalb von 24 Stunden nach dem Einfangen der experimentellen Behandlung aus und standardisieren Sie diese Zeit so weit wie möglich über Versuche hinweg.
   1. Obwohl die Lagerbedingungen variieren können, halten Sie die Insekten von der direkten Sonne fern. Wenn möglich, platzieren Sie sie drinnen in einem kühlen, dunklen Raum.
   2. Stellen Sie auf dem Feld sicher, dass sie während der Lagerung beschattet werden und vor Wind (wegwehen) und anderen Insektenfressern geschützt sind, die in die Umschläge eindringen können.

4. Richten Sie das Kälteschockexperiment ein

1. Füllen Sie einen Kühler mit Eis und Wasser. Stellen Sie sicher, dass genügend Eis vorhanden ist, um mindestens eine Stunde lang zu bestehen, und fügen Sie bei Bedarf regelmäßig Eis hinzu, um die Umgebung im Wasser bei 0 ° C zu halten.
2. Wählen Sie zwischen 1 und 4 Fokalpersonen für eine Runde des Experimentierens und stellen Sie sicher, dass jedes Individuum identifizierbar ist.
   1. Wenn Sie mehrere Arten verwenden, verwenden Sie nur eine von ihnen, um zu vermeiden, dass Individuen auf dem Datenblatt verwirrt werden. Wenn Sie nur mit einer Art experimentieren, verwenden Sie nur Individuen, die leicht zu unterscheiden sind, zum Beispiel durch einen gebrochenen Flügel oder eine deutliche Markierung.
   2. Wenn das Ziel des Experiments nichts mit der Flügelfärbung zu tun hat, markieren Sie die Flügel mit eindeutigen IDs (z. B. Zahlen) mit einem feinen Filzmarker, um Individuen zu unterscheiden.
   3. Wenn die Experimente keines der oben genannten Kriterien erfüllen, führen Sie das Experiment an einer Person gleichzeitig durch.
3. Füllen Sie die Zeilen des Datenblatts mit den Informationen, die für jedes untersuchte Insekt relevant sind, einschließlich ihrer eindeutigen ID und einer nützlichen Kennung in den Anmerkungen wie Artname oder Unterscheidungszeichen (Ergänzende Tabelle 1).
4. Legen Sie alle Fotrpersonen (noch in ihren individuell gekennzeichneten Umschlägen) in einen versiegelten Plastikbeutel mit einem Gewicht (Materialtabelle) und legen Sie den Beutel für 60 Minuten (oder bis ein Kühlkalkum verursacht wurde; siehe Diskussion) in Eiswasser (Ergänzende Abbildung 2).
   1. Stellen Sie sicher, dass das Gewicht schwer ist (z. B. große Münzen, große Unterlegscheiben oder glatte Felsen) und groß genug, um den Insektenbeutel im Eiswasser und senkrecht zur Wasseroberfläche zu halten. Verwenden Sie ein Gewicht, das keine Leckagen in der versiegelten Plastiktüte verursacht.
      HINWEIS: Während sich Insekten immer noch erholen können, wenn sie unter Wasser direkt dem Wasser ausgesetzt sind, erschweren nasse Hüllen das Entfernen jedes Einzelnen. Es ist am besten, die Insekten trocken in ihrem Beutel zu halten.
5. Zeichnen Sie Temperatur- und Lichtdaten auf.
   1. Verwenden Sie einen Datenlogger (siehe Materialtabelle),um Umgebungstemperatur- und Lichtdaten mit Schritt 5.1 oder 5.2 aufzuzeichnen.
      1. Programmieren Sie den Datenlogger so, dass er Temperatur- und Lichtdaten in Abständen von 10 s sammelt, beginnend mit dem Zeitpunkt, zu dem die Insekten freigesetzt werden.
      2. Basieren Sie die Startzeit des Datenloggers darauf, wann die Insekten in das Eiswasser gelegt wurden. Stellen Sie sicher, dass die Datenlogger-Informationen (Datum, Uhrzeit) synchronisiert sind, damit die Daten über die Umgebungsbedingungen später mit jedem einzelnen fokalen Insekt abgeglichen werden können.
   2. Verwenden Sie ein einfaches Thermometer, um Temperatur- und Lichtdaten in kurzen Abständen von Hand (von einem zweiten Forscher) aufzuzeichnen.
      1. Entscheiden Sie sich für die experimentellen Parameter, die mit der Erholungszeit verknüpft werden sollen, die ohne Datenlogger gemessen werden kann. Verwenden Sie verschiedene Behandlungen: Schatten / Sonne; Dämmerung/Mittag.
6. Platzieren Sie einen Netzkäfig für die Insekten an einem geeigneten Ort, damit die Temperatur und die Lichtumgebungen innerhalb des Käfigs so homogen wie möglich sind und die Basis des Käfigs erhöht wird und vom Beobachter angezapft werden kann.
7. Platzieren Sie den Datenlogger direkt außerhalb des Käfigs oder innerhalb des Käfigs, damit er nicht umgeworfen oder anderweitig durch kleine Bewegungen innerhalb des Käfigs beeinträchtigt wird. Wenn Sie keinen Datenlogger verwenden, positionieren Sie ein Thermometer entsprechend und/oder richten Sie die Käfige in der entsprechenden Konfiguration ein.
   HINWEIS: Der Datenlogger muss so platziert werden, dass die aufgezeichneten Umgebungsbedingungen so nah wie möglich an denen des Insekts liegen.

5. Starten Sie das Kaltschockexperiment

1. Entfernen Sie die Tiere nach 60 Minuten (oder der zeitgemäßen Zeit; siehe oben) aus dem Eiswasserbad. Entfernen Sie die Insekten sofort aus der Plastiktüte und entfernen Sie jede Person so schnell wie möglich aus ihrer Hülle, wobei die Handhabung minimiert wird (Ergänzende Abbildung 3).
2. Starten Sie die Stoppuhr, sobald sich die Tiere in den Netzkäfigen befinden (siehe Beispieldaten, Ergänzende Tabelle 1).
3. Tippen Sie mit einem Bleistift auf die Basis des Käfigs, um die sich erholenden Insekten zu rühren.
   HINWEIS: Die Bereitstellung von Reizen während der Genesung stellt sicher, dass die fokalen Insekten Erholungsstatus und Verhaltensweisen zeigen, sobald sie physiologisch in der Lage sind (Supplemental Video).
   1. Tippen Sie häufig und stark genug, um sicherzustellen, dass ein Tier nach Möglichkeit reagiert, aber keine Reaktion hervorruft.
      HINWEIS: Wenn zum Beispiel beim Klopfen auf den Käfig ein Tier in die Luft katapultiert wird und aufrecht landet, sich aber nicht bewegt, um alleine zu stehen, wird dies nicht als "Standverhalten" betrachtet, da der Organismus tatsächlich nicht für sich allein stand.
4. Markieren Sie die Studie als abgeschlossen, sobald eine Person geflogen ist (d. H. Eine vollständige Genesung gezeigt wird). Beenden Sie den Versuch und betrachten Sie, dass das Insekt eine vollständige Genesung erreicht hat, wenn es sich nach 30 Minuten nicht bewegt.
5. Entfernen Sie die Insekten aus dem Netzkäfig und legen Sie die Individuen wieder in ihre beschrifteten Glassinhüllen. Befreien Sie die Tiere oder halten Sie sie zur weiteren Datenerhebung (z.B. individuelle Merkmale von Größe, Gewicht).
6. Wenn Sie einen Datenlogger verwenden, stoppen Sie die Datenerfassung des Datenloggers und speichern Sie die Datei mit Temperatur- und Lichtdaten während des Experiments mit den entsprechenden Datums- / Uhrzeitinformationen.

6. Datenverarbeitung

1. Geben Sie die aus dem Datenblatt dargestellten Daten in eine Tabelle ein (z. B. MS Excel).
2. Wenn Sie einen Datenlogger verwenden, fügen Sie Temperatur- und Lichtdaten für jede Reaktion jedes einzelnen Assays hinzu.
   1. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Temperatur und des Lichts für jedes Verhalten jedes Einzelnen.
      HINWEIS: Da der Datenlogger alle 10 s Daten protokolliert, wenn das Standverhalten für ein Tier 48 s dauerte, verwenden Sie die ersten 5 Einträge des Datenloggers für diesen Versuch.
   2. Verknüpfen Sie jedes Wiederherstellungsverhalten jedes Einzelnen mit abiotischen Daten, die vom Datenlogger aufgezeichnet wurden, und runden Sie bei Bedarf Intervalle von 10 s auf oder ab.
3. Plotten und analysieren Sie Daten. Abbildung 1veranschaulicht beispielsweise den Einfluss von Temperatur und Licht auf die Erholungszeit von Kälteschocks. Stellen Sie weitere relevante Daten (Artenmerkmale, regionale Lebensraummerkmale) zusammen, um die ökologischen und evolutionären Muster in physiologischen Merkmalen der getesteten Gruppen zu untersuchen.
   HINWEIS: Abbildung 1 wurde mit dem ggplot2-Paket in R dargestellt. Der Detaillierungsgrad der Daten über die Umgebungsbedingungen wird je nach den instrumenten zur Messung der Umgebungsbedingungen unterschiedlich sein. Wird ein Datenlogger verwendet, können Zahlen mit einem Detail erstellt werden, der mit Abbildung 2 vergleichbar ist. Wenn ein Thermometer verwendet wird, kann der Forscher kein Diagramm erstellen, das durch Umgebungslicht informiert wird. Wenn Forscher Kategorien von Licht oder Temperatur verwenden, können diese Streudiagramme in Boxplots oder eine andere geeignete Vorlage umgewandelt werden, um diese Phänomene zu veranschaulichen.

Ergebnisse

Die in diesem Protokoll gesammelten Daten ermöglichen die Untersuchung und Aufteilung von Variablen, die für die Physiologie des Organismus wichtig sind. Zum Beispiel tragen sowohl Temperatur als auch Lichtverhältnisse zur Erholung von Schmetterlingen von einem Kälteschock bei (Abbildung 1). Die Handlung soll die Wechselwirkung zwischen Umgebungsbedingungen und Kälteschock-Erholung untersuchen. Unter Verwendung von wild gefangenen Schmetterlingen sowohl aus Fallen als auch aus Netzen zeigten 181 Schmetterlingsarten eine deutliche Erholung von einem durch Kälteschock induzierten Kühlkre koma (Abbildung 2). Die in Abbildung 2 dargestellten Daten wurden von drei Beobachtern über etwa fünf Monate (Januar, Februar, Mai-Juli 2020) in den kolumbianischen Anden erhoben. Experimente wurden immer am Morgen nach der Schmetterlingssammlung durchgeführt. Bei maximaler Effizienz war es zwei Beobachtern möglich, jeweils vier Schmetterlinge gleichzeitig zu beobachten, die sieben Mal wiederholt wurden (mindestens 7,37 Stunden), was zu einer Untersuchung von 56 Individuen an einem einzigen Morgen führte. Dies ermöglichte eine große Datenerfassung über ganze Schmetterlingsgemeinschaften hinweg, während Daten über individuelle Variationen eingeschlossen und berücksichtigt wurden. Da Assays unter Umgebungsbedingungen auftreten können, sind die Erholungsbedingungen repräsentativ für ihre Lebensräume und spiegeln die natürliche Variation wider, die Organismen in der Natur erfahren. Abbildung 3 zeigt die Überlappung zwischen Temperatur und Lichtverhältnissen des Kälteschock-Erholungsexperiments und den Bedingungen auf einer Weide, von der einige getestete Schmetterlinge gesammelt wurden.

Abbildung 1: Streudiagramme der Erholungszeit (in Sekunden) von Schmetterlingen nach einem Kälteschock. (A) Mittlere Temperatur und (B) mittlere LUX (Lichtintensität) während ihrer Genesung. Arten sind nach Familie organisiert und gefärbt. Insgesamt nimmt mit zunehmendem Licht und Temperatur die Erholungszeit für Kälteschocks ab, was eine Variabilität zwischen den Taxa zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiel für Ergebnisse des Kälteschock-Erholungstests an 181 Schmetterlingsarten aus den kolumbianischen Anden. Die Daten stellen die Anzahl der Sekunden dar, die verstrichen sind, bis der Schmetterling aus der Kälte entfernt wurde und wann er fliegen konnte. Arten sind nach Familie organisiert und gefärbt. Diese Abbildung zeigt die taxonomische Breite, über die dieses Experiment erfolgreich angewendet werden kann, und die Vielfalt der Kälteschock-Erholungsreaktionen über Arten hinweg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Umgebungstemperatur und LUX während Kaltschock-Wiederherstellungsversuchen. Darstellung der Umgebungstemperatur (blau) und LUX (Lichtintensität, rot), wie sie von Datenloggern aufgezeichnet wurden, die auf den Weiden platziert wurden, auf denen die Schmetterlingssammlung stattfand (helle Farben, Bedingungen erstrecken sich über den ganzen Tag) und Bedingungen während Kaltschock-Erholungsversuchen (dunkle Farben, nur Morgenstunden). Die dargestellten Umgebungsfeldbedingungen und Experimentellenbedingungen zeigen die Bandbreite und die durchschnittlichen Bedingungen, die Schmetterlinge während einer Woche Feldproben und -experimenten erlebt haben. Die Experimente wurden nur in den frühen Morgenstunden (07:00-13:00 Uhr) durchgeführt, während die Datenlogger eine Woche lang im Feld eingesetzt wurden (Tageslichtstunden, 06:00-18:00 Uhr). Hier wird die Überschneidung zwischen experimentellen Bedingungen und Umgebungsbedingungen von Schmetterlingen gezeigt, was die ökologische Relevanz der Durchführung physiologischer Assays unter Umgebungsbedingungen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Verfahren zum Sammeln von fokalen Insekten-in diesem Fall Schmetterlingen-mit geköderten Van-Someren-Fallen und aktiven Netzen. Fallen wurden sowohl mit verrottenden Fischen als auch mit verrottenden Fruchtködern geködert. Falle (ohne Köder) im Hintergrund, im Vordergrund ist ein Exemplar in seiner einzigartigen Hülle vor einer blauen Plastiksammelbox. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Taschen mit bis zu vier einzelnen Schmetterlingen, die in Eiswasser in einem Kühler getaunken sind. Plastiktüten wurden mit der Zeit markiert, in der sie in das Eiswasser gelegt wurden, so dass Kälteschockexperimente durch den Morgen gestaffelt werden konnten. Plastiktüten sollten versiegelt werden, um zu verhindern, dass Proben nass werden; Eine Überflutung der Säcke und des Umschlags hatte in diesem Fall jedoch keinen messbaren Effekt auf die Erholung der Schmetterlinge. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Zwei Beobachter sammeln Daten im Feld. Jeder Netzkäfig enthält vier einzigartige Schmetterlinge, die sich von einem Kälteschock erholen. Das Polyvinylchlorid-T-Gelenk im Käfig beherbergt den Datenlogger, um direkte Sonnen- oder Regeneinstrahlung zu verhindern. Jeder Beobachter hat eine Stoppuhr, die sofort nach der Entlassung des Schmetterlings in den Käfig gestartet wurde. Die Käfige werden durch Bänke angehoben, so dass die Beobachter die Basis des Käfigs bewegen können, um sicherzustellen, dass die Schmetterlinge so schnell wie physiologisch möglich verhaltensmäßig reagieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Beispieldatenblatt. Das Blatt zeigt die eindeutige ID jedes Schmetterlings, wie sie im Feld zugewiesen ist, und die Unterscheidungszeichen (Artname, Schlüsselfarben) in Notizen. Ebenfalls aufgezeichnet ist die dominante Position des Schmetterlings (d.h. welche Seite des Flügels der Sonne ausgesetzt war) während der Erholungsphase, notiert als D (dorsal) oder V (ventral). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Klopfen des Käfigs zur Erholung des Kälteschocks. Wenn sich Schmetterlinge erholen, tippt der Beobachter sanft auf die Basis des Käfigs, um Verhaltensweisen zu induzieren, sobald die Schmetterlinge dazu in der Lage sind. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Das Studium der thermischen Physiologie umfasst Messungen von Arten und Umweltmerkmalen, um die Wechselwirkungen zwischen Organismen und ihrer Umgebung, die für Überleben und Fitness entscheidend sind, besser zu verstehen. Obwohl es immer ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses der Naturgeschichte und Ökologie von Pflanzen und Tieren ist, sind thermische Merkmale angesichts des Landschafts- und Klimawandels von zunehmender Bedeutung^11,21. Mehrere Gruppen ektothermischer Terrestrischer Insekten, insbesondere Lepidoptera und Odonatan, sind relativ groß und reichlich vorhanden, zeigen unterschiedliche Verhaltensweisen und sind manipulationsfähig. Hier wird ein effizienter und kostengünstiger Assay beschrieben, um die physiologischen Reaktionen solcher Insekten effektiv zu messen. Dieses Protokoll erfordert eine Quelle gesunder Organismen, deren Handhabungszeit vor dem Experiment begrenzt ist. Obwohl die Anzahl der gleichzeitig untersuchten Organismen flexibel ist, variiert die Anzahl der Fokalpersonen pro Experiment je nach Zweck der Datenerhebung und / oder Anzahl der Beobachter.

Zum Beispiel wurde dieses Protokoll entwickelt, um detaillierte Einzeldaten über Schmetterlinge in ganzen Gemeinden zu sammeln. Die repräsentativen Ergebnisse veranschaulichen daher das Bestreben, die Datenerhebung für Individuen möglichst vieler Arten und unter einer Vielzahl von für die lokale Umwelt relevanten Bedingungen zu maximieren. Unabhängig von der Anzahl der fokalen Arten ist es für den Beobachter entscheidend, jedes Individuum im Käfig identifizieren zu können, das die Genesung erlebt. Wenn das Ziel darin besteht, Daten von nur einer Art zu sammeln, sollten nur ein oder zwei Individuen (wenn sie anhand unterschiedlicher Flügelverschleiße identifizierbar oder einzeln markiert sind) gleichzeitig untersucht werden. Die Studienfächer müssen in Übereinstimmung mit einer bestimmten Forschungsfrage oder einem bestimmten Studienplan ausgewählt werden. Basierend auf der gestellten Frage und dem Zweck der Datenerhebung (z. B. Forschung oder Unterricht) unterscheiden sich die Stichprobengröße und die Sammlung anderer Merkmale.

Um die grundlegenden Komponenten der Physiologie zu veranschaulichen, die durch dieses Protokoll erläutert werden (Induktion von Kaltkoa, Schritte der Erholung, Rolle der Umgebungsbedingungen), kann ein Klassenlehrer zwei verschiedene Arten oder Morphen einer einzigen Spezies auswählen. Wenn sich die fokussierten Individuen nur in einem Schlüsselmerkmal (z. B. Farbe) unterscheiden, ist eine kleinere Stichprobengröße erforderlich, und die Schüler können die Beziehung zwischen diesem Merkmal und der Organismenphysiologie genau untersuchen. Forscher, die sich für ökologische Physiologie interessieren, können ihre experimentellen Daten nutzen, um komplexe ökologische und evolutionäre Fragen zu untersuchen. Forscher müssen sicherstellen, dass sie fokale Insekten sorgfältig auswählen, die ihre Fragen direkt ansprechen (z. B. basierend auf Lebensstadium, Alter, Geschlecht, Standort) und basierend auf der Anzahl der beteiligten Variablen die geeignete Stichprobengröße bestimmen. Die Stichprobengrößen für komplexe Modelle sind größer als die oben beschriebenen.

Beim Sammeln von Verhaltenswiederherstellungsdaten ist es wichtig, dass der Käfig über dem Boden ruht, da der Beobachter in der Lage sein muss, auf den Boden des Käfigs zu tippen, um Wiederherstellungsverhalten hervorzubelocken. Dadurch wird sichergestellt, dass der Organismus reagiert (steht, fliegt), sobald er physiologisch dazu in der Lage ist, und das terminale Erholungsverhalten (Flug) dokumentiert wird. Die Aufzeichnung der Umgebungsbedingungen während der Kälteschock-Erholung ist ein wesentlicher Bestandteil der Untersuchung der thermischen Physiologie, da dieses Protokoll darauf ausgelegt ist, die Rolle der Umwelt in der organismischen Physiologie zu untersuchen und zu entwirren. Datenlogger (siehe Materialtabelle)sind nützlich, um standardisierte Messungen relevanter Bedingungen (z. B. Temperatur, Licht und sogar Feuchtigkeit) aufzuzeichnen. Wenn diese Werkzeuge jedoch nicht verfügbar sind, können relevante Bedingungen auf andere Weise gemessen werden, z. B. mit einem digitalen Thermometer oder durch Vereinfachung der Variablen der Umgebungsbedingungen und durch Verwendung unterschiedlicher Umgebungen wie Schatten und Sonne. Dieses Protokoll gibt dem Forscher die Möglichkeit, die Bedingungen während der Erholung des Kälteschocks basierend auf dem Zweck und dem Umfang der Studie zu messen.

Obwohl diese Methode modifiziert werden kann, um besser an bestimmte taxonomische Gruppen anzupassen, wird empfohlen, große, volante Insekten zu verwenden. Fliegende Insekten, die ihre Fähigkeit wiedererlangen, unabhängig zu fliegen, können als vollständig erholt angesehen werden. Die beschriebene Methode wurde erfolgreich bei Schmetterlingen in den Tropen und Subtropen eingesetzt. Basierend auf den thermischen Trends eines bestimmten Gebiets (d. H. Der Temperaturbereich an einem Ort, der variiert und somit die Erwartungen basierend auf Höhe, Breitengrad und Baldachinbedeckung beeinflusst), kann ein Organismus mehr oder weniger als eine Stunde in einem Eiswasserbad benötigen, um in ein kühles Koma einzutreten. Die Größe des Organismus kann auch die Zeit beeinflussen, die notwendig ist, um in ein Kühlkalk zu gelangen. Es ist wichtig, die Zeit der Kälteexposition zu finden, die notwendig ist, um ein Kühlkoma zu induzieren (sich nicht zu bewegen), aber keine fokalen Arten zu töten. Die Zeit, die benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren, hängt von der Größe, dem Standort und der natürlichen Geschichte / dem Verhalten der Individuen ab. Basierend auf den Ergebnissen des hier beschriebenen Kälteschockexperiments und unter Verwendung von Kenntnissen über die Ökologie der fokalen Insekten wählen Sie einen Zeitpunkt, zu dem die Studie abgeschlossen werden kann, wenn sich eine bestimmte Person nicht vollständig erholt.

Basierend auf den spezifischen Fragen des Forschers kann diese Methode entweder im Feld oder im Labor eingesetzt werden, um sowohl natürliche Umweltschwankungen als auch die Kontrolle wichtiger Variablen zu ermöglichen. Dieser Assay ist einfach und kostengünstig und hilft, bestehende Lücken im Bereich der thermischen Physiologie zu schließen. Die Leichtigkeit dieses Protokolls macht es für eine Vielzahl von Taxa zugänglich und öffnet das Feld für mehr als laborfreundliche Organismen. Die Neuheit der Durchführung eines standardisierten, aber dennoch umgebungsthermischen Assays füllt die Lücke zwischen Labor- und Feldergebnissen²². Die Nutzung der Umgebungsbedingungen für die Erholung des Organismus wird den Forschern helfen, die Rolle von Umwelt- und Artenfaktoren in der Physiologie^{aufzuteilen 14,22}. Schließlich kann dieses Protokoll aufgrund seiner geringen Kosten und des Mangels an erforderlichen Materialien an abgelegenen Orten im Feld mit wenig Ausrüstung - ideal für viele Feldbiologen - sowie in Klassenzimmern verwendet werden, um jungen Schülern eine praktische Lernerfahrung zu ermöglichen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage	Bioquip	1466PB	Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments.
Cooler	Any	NA
Glassine envelopes	Bioquip	1130B
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger	Onset	UA-002-08	If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information.
HOBO Optic USB Base Station	Onset	Base-U-1
Ice water	NA	NA
Insects (focal taxa)	NA	Any	Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location)
PVC T-joint	Any	Any
Sealable plastic bag	Any	NA
Stopwatch/timer	Any	NA
Weight	Any	NA	Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal.