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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este artículo describe y demuestra la administración de vacunas intranasales y la colección de leche de los conejos lactantes (Cuniculus de Oryctolagus) como medios de evaluar inmunidad de la mucosa en un modelo traslacional apropiado de la inmunización maternal.

Resumen

Debido a las similitudes en la placentación y la transferencia de anticuerpos con los humanos, los conejos son un excelente modelo de inmunización materna. Las ventajas adicionales de este modelo de investigación son la facilidad de reproducción y recolección de muestras, el período de gestación relativamente corto y los grandes tamaños de camada. Las vías de inmunización comúnmente evaluadas incluyen subcutánea, intramuscular, intranasal e intradérmica. La recolección de muestras no terminales para la detección cronológica de las respuestas inmunológicas a estas inmunizaciones incluye la recolección de sangre, tanto de presas como de kits, y la leche de la lactancia. En este artículo, demostraremos las técnicas que nuestro laboratorio ha utilizado en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda(Oryctolagus cuniculus),incluida la inmunización intranasal y la recolección de leche.

Introducción

Los estudios de inmunización materna y transferencia de anticuerpos son invaluables por numerosas razones, ya que esta es la ruta inicial de transferencia de inmunidad y la posterior protección contra patógenos y enfermedades en recién nacidos y bebés. La inmunización materna tiene el potencial de tener un impacto positivo en la salud materna y del lactante/niño a nivel mundial al reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con ciertos patógenos durante este período vulnerable1. El objetivo principal de esta estrategia es aumentar los niveles de anticuerpos maternos específicos durante todo el embarazo. Estos anticuerpos pueden entonces ser transferidos al recién nacido y al bebé a niveles suficientes para proteger contra infecciones hasta que su sistema inmunológico esté lo suficientemente maduro como para responder adecuadamente a los desafíos1,2,3. Trabajos anteriores han demostrado que los títulos de anticuerpos más altos al nacer se asocian con una protección completa o con un inicio tardío y una gravedad reducida de numerosas enfermedades infecciosas diferentes en el recién nacido, incluyendo tétanos, tos ferina, virus sincitial respiratorio (RSV), influenza e infecciones estreptocócicas del grupo B1,2,3.

En los seres humanos, los anticuerpos maternos se transfieren pasivamente a través de la placenta y también se transfieren a través de la leche materna a través de la lactancia. Trabajos anteriores han demostrado que los niveles de IgA específicos del VIH en la leche materna humana de madres infectadas con el virus se asociaron con la reducción de la transmisión postnatal del virus, lo que sugiere un papel protector de la leche materna contra el VIH IgA4. Estudios en primates no humanos han demostrado que la inmunización contra el VIH puede inducir una respuesta significativa de anticuerpos en la leche materna, y aunque se indujeron respuestas similares a la IgG sérica después de la inmunización sistémica versus de la mucosa, la inmunización de la mucosa indujo una respuesta IgA significativamente mayor dentro de la leche5,6.

La identificación de un modelo animal apropiado traslacionalmente para estos estudios debe tener en cuenta el tipo de placentación y los mecanismos de transferencia pasiva de anticuerpos, así como la transferencia de anticuerpos a través de la leche materna. Hay tres tipos principales de placentación en mamíferos basados en los tipos de tejido y capas en la interfaz materno-fetal, incluyendo hemocorial (primates, roedores y conejos), endoteliocorial (carnívoros) y epiteliocorial (caballos, cerdos y rumiantes). La placenta hemocorial es el tipo más invasivo, lo que permite la comunicación directa entre el suministro de sangre materna y el corion, o la membrana fetal más externa. Con base en el número de capas de trofoblastos, existen varias variaciones de placentación hemocorial, incluyendo la placenta hemomonocorial encontrada en primates, la placenta hemodicorial en conejos y la placenta hemotricorial observada en ratas y ratones7. Este contacto directo entre el suministro de sangre materna y el corion permite la transferencia pasiva de anticuerpos a través de la placenta durante la gestación. IgG es la única clase de anticuerpos que atraviesa significativamente la placenta humana8,mientras que IgA es la clase predominante de Ig que se encuentra en la leche materna humana9. De los modelos científicamente relevantes, sólo los primates (incluidos los humanos), los conejos y los conejillos de Indias transfieren IgG en el útero e IgA en la leche10,11. Por lo tanto, el modelo de conejo incorpora factores comparables a los de los humanos que controlan la transferencia transplacental de IgG y la transferencia de IgA.

Además de servir como un modelo excepcional para la inmunidad materna y el desarrollo de vacunas, las similitudes entre el conejo y las cavidades nasales humanas las convierten en un modelo apropiado para la inmunización intranasal. El volumen de la cavidad nasal del conejo es más similar a los humanos que los modelos de roedores basados en la masa corporal relativa12. Además, Casteleyn et al. 12 demostraron que el tejido linfoide asociado nasal (NALT) es más voluminoso en el conejo en comparación con los roedores. El NALT se localiza principalmente en el aspecto ventral y ventromedial del meato nasal ventral y en el aspecto lateral y dorsolateral del meato nasofaríngeo en conejos, mientras que en roedores, el tejido linfoide sólo está presente a lo largo del aspecto ventral del meato nasofaríngeo12. En los conejos, la estructura y localización de los linfocitos intraepiteliales y de la lámina propia, así como de los folículos linfoides aislados, son similares a los humanos12.

Las ventajas adicionales de usar el conejo como modelo para la inmunidad materna y de la mucosa incluyen su alta fecundidad y su período de gestación relativamente corto. Los vasos sanguíneos auriculares grandes permiten el acceso relativamente fácil a los grandes volúmenes de sangre para las colecciones seriales. Se puede recolectar una variedad de muestras de la mucosa para ensayos de respuesta de anticuerpos específicos del antígeno, incluida la leche materna13 (al amamantar), secreciones o lavados de la mucosa (por ejemplo,oral 14,15,16,lavado broncoalveolar13,17,18,19,vaginal20,21,22)y heces20,23,24,25. Las muestras de leche se pueden recolectar fácilmente durante la lactancia para evaluar la presencia de respuestas de anticuerpos específicos del antígeno. Aunque no es tan abundante como para los seres humanos y los ratones, una amplia variedad de reactivos experimentales están disponibles para estudios y ensayos específicos de conejos. En este artículo, describiremos y demostraremos la inmunización intranasal y la recolección de leche en conejos blancos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus).

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las políticas de la IACUC de la Universidad de Duke.

NOTA: Los materiales necesarios se proporcionan en la Tabla de materiales.

1. Sedación y anestesia del conejo

  1. Sedar el conejo hembra (sexualmente maduro; aproximadamente 5-30 meses de edad) mediante la administración de acepromazina por vía intramuscular (IM) a una dosis de 1 mg/kg. Dependiendo del tamaño del animal, use una jeringa de 1 o 3 ml con una aguja de 25 G. Los músculos epaxiales son el sitio preferido de la inyección intramuscular.
    NOTA: La acepromazina también se puede administrar por vía subcutánea, pero el laboratorio prefiere la IM, ya que actúa más rápidamente y reduce la incidencia de lesiones cutáneas.
  2. Espere de 10 a 15 minutos para permitir que la acepromazina suba efecto.
  3. Anestesiar el conejo con isoflurano colocando el cono de la nariz conectado sobre la nariz del animal. Ajuste el vaporizador a hasta un 4% de isoflurano combinado con hasta 4 litros/minuto de oxígeno. Los conejos tienen una alta aversión al isoflurano, por lo que es necesaria una restricción adecuada al enmascarar al animal.
  4. Una vez completamente anestesiado, según lo evaluado por el pabellón pinna, el pedal y/o el reflejo palpebral, aplique lubricante oftálmico a cada ojo para evitar el secado de los ojos y la posterior ulceración corneal.
  5. Monitoree continuamente los reflejos y la respiración durante la anestesia, y reduzca la tasa de isoflurano al 1-2% una vez que se ha alcanzado un plano adecuado de anestesia.

2. Inmunización intranasal

  1. Prepare la solución de la inmunización antes de la manipulación animal.
  2. Sedar el conejo como se describió anteriormente.
  3. Una vez que el miembro del laboratorio esté listo para administrar la vacuna y el conejo esté en un plano adecuado de anestesia, apague el isoflurano y el oxígeno y retire el cono de la nariz.
  4. Coloque el conejo en reclinación dorsal, y sujete el cuello y la cabeza en un ángulo aproximado de 45° que permita un fácil acceso y visualización de ambas narinas por parte del miembro del laboratorio que administra la vacuna.
  5. Cargue la pipeta con no más de 100 μL de la solución vacunal y administre rápidamente la solución en cada fosa nasal. La pipeta debe mantenerse en un ángulo aproximado de 45°, en ángulo hacia el aspecto medial del conducto nasal.
    NOTA: El objetivo de la inmunización es que la solución entre en contacto con la membrana mucosa de las narinas, por lo que la punta no debe colocarse dentro de las narinas, ya que esto puede resultar en abrasión o irritación de los tejidos de la mucosa y potencialmente influir en la inmunogenicidad de la vacuna administrada por vía nasal. La vacuna debe administrarse rápidamente y hacerse de la misma manera en la otra nara.
  6. Después de la administración en ambas fosas nasales, mantenga el conejo en reclinación dorsal durante 30 segundos para minimizar la fuga de la solución de la vacuna.
    NOTA: El laboratorio normalmente no administrará más de 100 μL por fosa nasal a la vez. Si se va a administrar un volumen mayor, con un total máximo de 500 μL, la vacuna puede administrarse en alícuotas de 100 μL con un período de descanso de 30 segundos entre inmunizaciones, y administraciones adicionales de vacuna repetidas, con 30 segundos de reposo entre cada administración, hasta que se entregue el volumen total de la vacuna.
  7. Después de la inmunización, coloque el conejo en el ventrum para su recuperación y vigile de cerca al animal hasta que pueda mantener la reclinación esternal.

3. Recolección de leche

  1. Sedar el conejo lactante como se describió anteriormente.
  2. Limpie la piel sobre la vena marginal del oído con el hisopo/toallita de alcohol.
  3. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 g, administre aproximadamente 1-2 UI de oxitocina por vía intravenosa a través de la vena marginal del oído para inducir la decepción de la leche.
    NOTA: Debido a la relajación del músculo liso, es común que el conejo orine o defeque después de la administración de oxitocina.
  4. Después de la administración de oxitocina, aplique presión al sitio de inyección con el pedazo de gasa.
  5. Mientras mantiene la máscara de anestesia sobre la nariz del conejo, apoya al conejo en sus cuartos traseros.
    NOTA: La recolección de leche también se puede realizar con el animal en reclinación lateral, pero el laboratorio encuentra que la recolección es más fácil cuando el conejo está apoyado en su grupa con un asistente que sostiene el conejo en posición vertical con la máscara de anestesia.
  6. Abra el tubo estéril para prepararse para la recolección de leche y localice el tejido mamario y las tetinas asociadas. Las tetinas están típicamente rodeadas por piel húmeda de la lactancia reciente, y el tejido mamario es fácilmente palpable cuando está lleno de leche.
  7. Agarre el tejido mamario asociado con un pezón entre el pulgar y el índice y aplique una presión suave y masajeadora al tejido glandular en la dirección del pezón. Coloque el tubo de recolección sobre el pezón para recoger la leche extraída.
    NOTA: A veces puede tomar varios minutos para que la oxitocina sea efectiva, y la producción de leche parece variar entre las glándulas mamarias. Si la expresión de la leche no es exitosa, espere varios minutos o gire alrededor de las glándulas mamarias adicionales. La leche de todas las tetinas se puede recoger en el mismo vial. Por lo general, varios mililitros de leche se pueden recolectar fácilmente de una dora lactante.
  8. Después de la recolección de leche, apague el isoflurano y el oxígeno, y permita que el conejo se recupere mientras es monitoreado de cerca hasta que el animal pueda mantener la reclinación esternal.

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Resultados

En la Figura 1se muestra una visión general de un diseño típico de un estudio de inmunización intranasal materna, que incorpora las inmunizaciones, la reproducción, el encamiento, la lactancia y la transferencia de anticuerpos. Aunque no se ilustra, la sangre se debe recoger antes de la inmunización inicial para las medidas de la línea de fondo y a través del resto del estudio a intervalos regulares. La sangre se obtiene fácilmente a través de la arteria del oído central con sedac...

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Discusión

Aunque no se describe en el protocolo anterior, la cría exitosa de los conejos es necesaria para este modelo materno y para permitir la recolección de leche. Los conejos son fácilmente criados por cubierta viva en un entorno de investigación. Se recomienda que se transfiera a la jaula del buck para la cría, ya que puede ser territorial y agresivo si se mantiene en su propia jaula con el buck. Si las hembras no son receptivas después de 15 minutos (como lo indica huir mordiendo o vocalizando), la dora debe ser coloc...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a la División de Recursos de Animales de Laboratorio de la Universidad de Duke y a su equipo de cría por su asistencia y gran cuidado prestado a los animales. Además, a los autores les gustaría reconocer al equipo de PhotoPath dentro del Departamento de Patología por su asistencia con las partes de audio y video del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación discrecionales del laboratorio Staats.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needle (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Mucosal VaccineN/AN/AExperimental Vaccine
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
Pipette TipsVWR53503-290
PipettorVWR89079-962
PromAce (Acepromazine maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-plyCovidien07-839-8871
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needles (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4)Covidien07-891-5815
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL)Falcon14-959-49B

Referencias

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