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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive e dimostra la somministrazione di vaccini intranasali e la raccolta di latte dai conigli in allattamento (Oryctolagus cuniculus) come mezzo per valutare l'immunità mucosa in un modello traslazionale appropriato di immunizzazione materna.

Abstract

A causa delle somiglianze nella placentation e nel trasferimento di anticorpi con l'uomo, i conigli sono un eccellente modello di immunizzazione materna. Ulteriori vantaggi di questo modello di ricerca sono la facilità di allevamento e raccolta dei campioni, il periodo di gestazione relativamente breve e le grandi dimensioni dei rifiuti. Le vie comunemente valutate di immunizzazione includono sottocutanee, intramuscolari, intranasali e intradermiche. La raccolta non clinica dei campioni per l'individuazione cronologica delle risposte immunologiche a queste vaccinazioni include la raccolta di sangue, sia da dighe che da kit, e il latte proveniente dall'allattamento lo fa. In questo articolo, dimostreremo le tecniche che il nostro laboratorio ha utilizzato negli studi sull'immunizzazione materna nei conigli bianchi della NuovaZelanda (Oryctolagus cuniculus), inclusa l'immunizzazione intranasale e la raccolta del latte.

Introduzione

Gli studi sull'immunizzazione materna e sul trasferimento di anticorpi sono inestimabili per numerose ragioni, poiché questa è la via iniziale di trasferimento dell'immunità e successiva protezione da agenti patogeni e malattie nei neonati e nei neonati. L'immunizzazione materna ha il potenziale di avere un impatto positivo sulla salute sia materna che infantile a livello globale riducendo la morbilità e la mortalità associate a determinati agenti patogeni durante questo periodovulnerabile 1. L'obiettivo principale di questa strategia è aumentare i livelli di anticorpi materni specifici durante la gravidanza. Questi anticorpi possono quindi essere trasferiti al neonato e al neonato a livelli sufficienti per proteggersi dalle infezioni fino a quando il loro sistema immunitario non è abbastanza maturo da rispondereadeguatamente alle sfide 1,2,3. Lavori precedenti hanno dimostrato che i titolo di anticorpi più elevati alla nascita sono associati a una protezione completa o a un esordio ritardato e a una ridotta gravità di numerose diverse malattie infettive nel neonato, tra cui tetano, pertosse, virus respiratorio sinciziale (RSV), influenza e infezioni streptococciche di gruppo B1,2,3.

Nell'uomo, gli anticorpi materni vengono trasferiti passivamente attraverso la placenta e vengono anche trasferiti attraverso il latte materno attraverso l'allattamento. Lavori precedenti hanno dimostrato che i livelli di IgA specifici per l'HIV nel latte materno umano delle madri infettate dal virus erano associati a una ridotta trasmissione postnatale del virus, suggerendo un ruolo protettivo per il latte materno anti-HIV IgA4. Studi su primati non umani hanno dimostrato che l'immunizzazione contro l'HIV può indurre una significativa risposta anticorpale nel latte materno, e sebbene risposte IgG siere simili siano state indotte a seguito dell'immunizzazione sistemica contro mucosa, l'immunizzazione mucosa ha indotto una risposta IgA significativamentepiù elevata all'interno del latte 5,6.

L'individuazione di un modello animale trascrittariamente appropriato per tali studi dovrebbe tener conto del tipo di placentation e dei meccanismi di trasferimento passivo degli anticorpi, nonché del trasferimento di anticorpi attraverso il latte materno. Esistono tre tipi principali di placentazione nei mammiferi in base ai tipi e agli strati tissutali nell'interfaccia materno-fetale, tra cui emocorali (primati, roditori e conigli), endoteliocorali (carnivori) ed epiteliocorali (cavalli, maiali e ruminanti). La placenta emocorale è il tipo più invasivo, consentendo la comunicazione diretta tra l'apporto di sangue materno e il corione, o la membrana fetale più esterna. In base al numero di strati di trofoblasti, ci sono diverse variazioni di placentazione emocorale, tra cui la placenta emomonocorale che si trova nei primati, la placenta emodichoriale nei conigli e la placenta emotricorale osservata nei ratti e nei topi7. Questo contatto diretto tra l'apporto di sangue materno e il corione consente il trasferimento passivo di anticorpi attraverso la placenta durante la gestazione. IgG è l'unica classe di anticorpi che attraversa significativamente la placentaumana 8, mentre L'IgA è la classe predominante di Ig che si trova nel latte maternoumano 9. Dei modelli scientificamente rilevanti, solo primati (compresi gli esseri umani), conigli e cavie trasferiscono IgG in utero e IgA nel latte10,11. Pertanto, il modello del coniglio incorpora fattori paragonabili a quelli dell'uomo che controllano il trasferimento transplacentale dell'IgG e il trasferimento lattazionale dell'IgA.

Oltre a servire come modello eccezionale per l'immunità materna e lo sviluppo del vaccino, le somiglianze tra il coniglio e le cavità nasali umane li rendono un modello appropriato per l'immunizzazione intranasale. Il volume della cavità nasale del coniglio è più simile agli esseri umani rispetto ai modelli di roditori basati sulla massa corporearelativa 12. Inoltre, Casteleyn et al. Il NALT si trova principalmente all'aspetto ventrale e ventromediale del meato nasale ventrale e all'aspetto laterale e dorsolaterale del meato nasofaringeo nei conigli, mentre nei roditori, il tessuto linfoide è presente solo lungo l'aspetto ventrale del meato nasofaringeo12. Nei conigli, la struttura e la posizione dei linfociti intraepiteliali e lamina propria, così come i follicoli linfoidi isolati, sono simili agli esseriumani 12.

Ulteriori vantaggi dell'uso del coniglio come modello per l'immunità materna e mucosa includono la loro elevata fecondità e il periodo di gestazione relativamente breve. I grandi vasi sanguigni auricolari consentono un accesso relativamente facile a grandi volumi di sangue per le raccolte seriali. Una varietà di campioni di mucosa può essere raccolta per test di risposta anticorpale specifici dell'antigene, compreso il lattematerno 13 (in allattamento), le secrezioni o lavaggi della mucosa (ad esempio,orale 14,15,16, lavanda broncoalsolare13,17,18,19,vaginale 20,21,22)e le feci20,23,24,25. I campioni di latte possono essere facilmente raccolti durante l'allattamento per valutare la presenza di risposte anticorpali specifiche dell'antigene. Sebbene non sia abbondante come per gli esseri umani e i topi, un'ampia varietà di reagenti sperimentali sono disponibili per studi e saggi specifici per conigli. In questo articolo, descriveremo e dimostreremo l'immunizzazione intranasale e la raccolta del latte nei conigli bianchi della Nuova Zelanda(Oryctolagus cuniculus).

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con le politiche della Duke University IACUC.

NOTA: I materiali necessari sono forniti nella tabella dei materiali.

1. Sedazione del coniglio e anestesia

  1. Sedare il coniglio femmina (sessualmente maturo; circa 5-30 mesi) somministrando acepromazina per via intramuscolare (IM) a una dose di 1 mg/kg. A seconda delle dimensioni dell'animale, utilizzare una siringa da 1 o 3 ml con un ago da 25 G. I muscoli epaxiali sono il sito preferito dell'iniezione intramuscolare.
    NOTA: L'acepromazina può anche essere somministrata per via sottocutanea, ma l'messaggistica istantanea è preferita dal laboratorio, in quanto agisce più rapidamente e riduce l'incidenza delle lesioni cutanee.
  2. Attendere 10-15 minuti per consentire l'effetto dell'acepromazina.
  3. Anestetizza il coniglio con isoflurane posizionando il cono del naso collegato sul naso dell'animale. Regolare il vaporizzatore fino al 4% di isoflurane combinato con fino a 4 litri / minuto di ossigeno. I conigli hanno un'alta avversione all'isoflurane, quindi è necessaria un'adeguata moderazione quando mascherano l'animale.
  4. Una volta completamente anestetizzato, come valutato dalla pinna, dal pedale e/o dal riflesso palpebrale, applicare lubrificante oftalmico su ogni occhio per evitare l'asciugatura degli occhi e la successiva ulcerazione corneale.
  5. Monitorare continuamente i riflessi e la respirazione durante l'anestesia e ridurre la velocità dell'isoflurane all'1-2% una volta raggiunto un piano adeguato di anestesia.

2. Immunizzazione intranasale

  1. Preparare la soluzione di immunizzazione prima della manipolazione degli animali.
  2. Sedate il coniglio come descritto sopra.
  3. Una volta che il membro del laboratorio è pronto a somministrare il vaccino e il coniglio si trova in un piano adeguato di anestesia, spegnere l'isoflurane e l'ossigeno e rimuovere il cono del naso.
  4. Posizionare il coniglio in recumbency dorsale e puntellare il collo e la testa con un angolo approssimativo di 45 ° che consente un facile accesso e visualizzazione di entrambi i nares da parte del membro del laboratorio che somministra il vaccino.
  5. Caricare la pipetta con non più di 100 μL della soluzione vaccinale e somministrare rapidamente la soluzione in ogni narice. La pipetta deve essere tenuta con un angolo approssimativo di 45°, angolata verso l'aspetto mediale del passaggio nasale.
    NOTA: L'obiettivo dell'immunizzazione è che la soluzione contatti la mucosa dei narici, quindi la punta non deve essere posizionata all'interno delle narici, in quanto ciò può causare abrasione o irritazione dei tessuti mucosi e potenzialmente influenzare l'immunogenicità del vaccino somministrato nasalmente. Il vaccino deve essere somministrato rapidamente e fatto allo stesso modo nell'altro rullante.
  6. Dopo la somministrazione in entrambi i passaggi nasali, mantenere il coniglio in reclinanza dorsale per 30 secondi per ridurre al minimo la perdita della soluzione vaccinale.
    NOTA: Il laboratorio in genere somministra non più di 100 μL per narice alla volta. Se deve essere somministrato un volume maggiore, con un totale massimo di 500 μL, il vaccino può essere somministrato in aliquote di 100 μL con un periodo di riposo di 30 secondi tra le vaccinazioni e somministrazioni aggiuntive di vaccino ripetute, con 30 secondi di riposo tra ogni somministrazione, fino a quando non viene consegnato il volume totale del vaccino.
  7. Dopo l'immunizzazione, posizionare il coniglio sul ventrum per il recupero e monitorare da vicino l'animale fino a quando non può mantenere la rimorsipanza sternale.

3. Raccolta del latte

  1. Sedate il coniglio in allattamento come descritto sopra.
  2. Pulire la pelle sulla vena dell'orecchio marginale con il tampone /salvietta alcolica.
  3. Utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 25 g, somministrare circa 1-2 UI di ossitocina per via endovenosa attraverso la vena dell'orecchio marginale per indurre la resa dei conti del latte.
    NOTA: A causa del rilassamento muscolare liscio, è comune che il coniglio urina o defechi dopo la somministrazione di ossitocina.
  4. Dopo la somministrazione di ossitocina, applicare pressione sul sito di iniezione con il pezzo di garza.
  5. Pur mantenendo la maschera di anestesia sul naso del coniglio, puntellare il coniglio sui quarti posteriori.
    NOTA: La raccolta del latte può anche essere eseguita con l'animale in reclinabile laterale, ma il laboratorio scopre che la raccolta è più facile quando il coniglio è sporgente sulla groppa con un assistente che tiene il coniglio in posizione verticale con la maschera di anestesia.
  6. Aprire il tubo sterile per prepararsi alla raccolta del latte e localizzare il tessuto mammario e le te capesine associate. Le capezzale sono tipicamente circondate da pellicce bagnate della recente infermieristica e il tessuto mammario è facilmente palpabile quando è pieno di latte.
  7. Afferrare il tessuto mammario associato a un tat tra il pollice e l'indice e applicare una pressione delicata e massaggiante sul tessuto ghiandolare nella direzione del tato. Posizionare il tubo di raccolta sopra il teat per raccogliere il latte espresso.
    NOTA: A volte possono essere necessario diversi minuti prima che l'ossitocina sia efficace e la produzione di latte sembra variare tra le ghiandole mammarie. Se l'espressione del latte non ha successo, attendere alcuni minuti o ruotare intorno alle ghiandole mammarie aggiuntive. Il latte di tutte le te capesine può essere raccolto nella stessa fiala. In genere, diversi millilitri di latte possono essere facilmente raccolti da una doe in allattamento.
  8. Dopo la raccolta del latte, spegnere l'isoflurane e l'ossigeno e consentire al coniglio di riprendersi mentre è attentamente monitorato fino a quando l'animale non è in grado di mantenere la reclinanza sternale.

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Risultati

Una panoramica di un tipico progetto di studio di immunizzazione intranasale materna è descritta nella figura 1, che incorpora le immunizzazioni, l'allevamento, l'adessimento, l'allattamento e il trasferimento di anticorpi. Sebbene non sia illustrato, il sangue deve essere raccolto prima dell'immunizzazione iniziale per le misurazioni di base e per tutto il resto dello studio a intervalli regolari. Il sangue si ottiene facilmente attraverso l'arteria dell'orecchio centrale con sedazione lie...

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Discussione

Sebbene non descritto nel protocollo precedente, l'allevamento riuscito dei conigli è necessario per questo modello materno e per consentire la raccolta del latte. I conigli sono facilmente allevati dalla copertura dal vivo in un ambiente di ricerca. Si raccomanda di trasferire nella gabbia del dollaro per l'allevamento, così come può essere territoriale e aggressivo se tenuto nella propria gabbia con il dollaro. Se le femmine non sono ricettive dopo 15 minuti (come indicato scappando mordendo o vocalizzando), la coni...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori vorrebbero riconoscere la Divisione di risorse animali di laboratorio della Duke University e il loro team di allevamento per la loro assistenza e grande cura fornita agli animali. Inoltre, gli autori vorrebbero riconoscere il team PhotoPath all'interno del Dipartimento di Patologia per la loro assistenza con le parti audio e video del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di ricerca discrezionali del laboratorio Staats.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needle (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Mucosal VaccineN/AN/AExperimental Vaccine
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
Pipette TipsVWR53503-290
PipettorVWR89079-962
PromAce (Acepromazine maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-plyCovidien07-839-8871
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needles (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4)Covidien07-891-5815
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL)Falcon14-959-49B

Riferimenti

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