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Resumo

Este artigo descreve e demonstra a administração de vacinas intranasais e a coleta de leite de coelhos lactadores (Oryctolagus cuniculus) como forma de avaliar a imunidade mucosa em um modelo translacionalmente apropriado de imunização materna.

Resumo

Devido às semelhanças na placenta e transferência de anticorpos com humanos, os coelhos são um excelente modelo de imunização materna. Outras vantagens deste modelo de pesquisa são a facilidade de reprodução e coleta de amostras, período de gestação relativamente curto e grandes tamanhos de lixo. As rotas comumente avaliadas de imunização incluem subcutânea, intramuscular, intranasal e intradérmica. A coleta de amostras não terminais para a detecção cronológica das respostas imunológicas a essas imunizações incluem a coleta de sangue, tanto de barragens quanto de kits, e leite da lactação. Neste artigo, demonstraremos técnicas que nosso laboratório tem utilizado em estudos de imunização materna em coelhos brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus), incluindo imunização intranasal e coleta de leite.

Introdução

Estudos de imunização materna e transferência de anticorpos são inestimáveis por inúmeras razões, pois esta é a rota inicial de transferência de imunidade e posterior proteção contra patógenos e doenças em recém-nascidos e bebês. A imunização materna tem o potencial de impactar positivamente a saúde materno-infantil em nível global, reduzindo a morbidade e a mortalidade associadas a certos patógenos durante este período vulnerável1. O principal objetivo dessa estratégia é aumentar os níveis de anticorpos maternos específicos ao longo da gravidez. Esses anticorpos podem então ser transferidos para o recém-nascido e o bebê em níveis suficientes para proteger contra infecções até que seu sistema imunológico esteja maduro o suficiente para responder adequadamente aos desafios1,2,3. Trabalhos anteriores demonstraram que os maiores títulos de anticorpos ao nascer estão associados à proteção completa ou a um início de início atrasado e à redução da gravidade de inúmeras doenças infecciosas diferentes no recém-nascido, incluindo tétano, coqueluche, vírus sincicial respiratório (RSV), influenza e infecções estreptocócicas do grupo B1,2,3.

Em humanos, os anticorpos maternos são transferidos passivamente através da placenta e também são transferidos através do leite materno via enfermagem. Trabalhos anteriores demonstraram que os níveis de IgA específicos do HIV no leite materno humano de mães infectadas pelo vírus estavam associados à redução da transmissão pós-natal do vírus, sugerindo um papel protetor para o leite materno anti-HIV IgA4. Estudos em primatas não humanos demonstraram que a imunização contra o HIV pode induzir uma resposta significativa de anticorpos no leite materno, e embora respostas semelhantes de IgG sérico tenham sido induzidas após a imunização sistêmica versus mucosa, a imunização mucosa induziu uma resposta de IgA significativamente maior dentro do leite5,6.

A identificação de um modelo animal traduções apropriados para esses estudos deve levar em conta o tipo de placentação e mecanismos de transferência passiva de anticorpos, bem como a transferência de anticorpos através do leite materno. Existem três tipos principais de placenta em mamíferos baseados nos tipos de tecidos e camadas na interface materno-fetal, incluindo hemocolar (primatas, roedores e coelhos), endoteliococorar (carnívoros) e epiteliocorial (cavalos, porcos e ruminantes). A placenta hemocolarial é o tipo mais invasivo, permitindo a comunicação direta entre o suprimento de sangue materno e o chorão, ou a membrana fetal mais externa. Com base no número de camadas de trophoblasto, há várias variações de placenta hemocolarial, incluindo a placenta hemomonochorial encontrada em primatas, a placenta hemodichorial em coelhos e a placenta hemotrichorial observada em ratos e camundongos7. Esse contato direto entre o suprimento de sangue materno e a corão permite a transferência passiva de anticorpos através da placenta durante a gestação. O IgG é a única classe de anticorpos que cruza significativamente a placenta humana8, enquanto o IgA é a classe predominante de Ig encontrada no leite materno humano9. Dos modelos cientificamente relevantes, apenas primatas (incluindo humanos), coelhos e cobaias transferem IgG no útero e IgA no leite10,11. Portanto, o modelo coelho incorpora fatores comparáveis aos humanos que controlam a transferência transplacental do IgG e a transferência lactoracional de IgA.

Além de servirem como modelo excepcional para imunidade materna e desenvolvimento vacinal, semelhanças entre o coelho e as cavidades nasais humanas fazem deles um modelo adequado para a imunização intranasal. O volume da cavidade nasal do coelho é mais semelhante aos humanos do que os modelos de roedores baseados na massa relativa do corpo12. Além disso, Casteleyn et al. 12 demonstraram que o tecido linfoide associado nasal (NALT) é mais volumoso no coelho em comparação com roedores. O NALT está localizado principalmente no aspecto ventral e ventromedial do meatus nasal ventral e no aspecto lateral e dorsolateral do meatus nasofaríngeo em coelhos, enquanto nos roedores, o tecido linfoide só está presente ao longo do aspecto ventral da carne nasofaríngea12. Em coelhos, a estrutura e a localização dos linfócitos intraepithelial e lamina propria, bem como os folículos linfoides isolados, são semelhantes aos humanos12.

Vantagens adicionais de usar o coelho como modelo de imunidade materna e mucosa incluem sua alta fecundidade e período de gestação relativamente curto. Grandes vasos sanguíneos auriculares permitem acesso relativamente fácil a grandes volumes de sangue para coletas seriais. Uma variedade de amostras mucosas podem ser coletadas para ensaios de resposta a anticorpos específicos de antígeno, incluindo leite materno13 (quando lactante), secreções mucosas ou lavagens (por exemplo, oral14,15,16, lavagem broncoalveolar13,17,18,19, vaginal20,21,22), e fezes20,23,24,25. As amostras de leite podem ser facilmente coletadas durante a lactação para avaliar a presença de respostas de anticorpos específicos de antígeno. Embora não seja tão abundante quanto para humanos e camundongos, uma grande variedade de reagentes experimentais estão disponíveis para estudos e ensaios específicos de coelhos. Neste artigo, descreveremos e demonstraremos a imunização intranasal e a coleta de leite em coelhos brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus).

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com as políticas da Universidade Duke IACUC.

NOTA: Os materiais necessários são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Sedação de Coelho e Anestesia

  1. Sedar o coelho fêmea (sexualmente maduro; aproximadamente 5-30 meses de idade) administrando acepromazina intramuscularmente (IM) a uma dose de 1 mg/kg. Dependendo do tamanho do animal, use uma seringa de 1 ou 3 mL com uma agulha de 25 G. Os músculos epaxiais são o local preferido da injeção intramuscular.
    NOTA: A acepromazina também pode ser administrada subcutâneamente, mas o IM é preferido pelo laboratório, pois age mais rapidamente e reduz a incidência de lesões cutâneas.
  2. Aguarde de 10 a 15 minutos para permitir que a acepromazina faça efeito.
  3. Anestesiar o coelho com isoflurane colocando o cone do nariz conectado sobre o nariz do animal. Ajuste o vaporizador para até 4% de isoflurane combinado com oxigênio de até 4 litros/minuto. Coelhos têm alta aversão ao isoflurane, por isso a contenção adequada é necessária ao mascarar o animal.
  4. Uma vez totalmente anestesiado, conforme avaliado pelo pináculo, pedal e/ou reflexo palpebral, aplique lubrificante oftálmico em cada olho para evitar a secagem dos olhos e posterior ulceração córnea.
  5. Monitore continuamente os reflexos e a respiração durante a anestesia, e reduza a taxa de isoflurane para 1-2% uma vez que um plano adequado de anestesia tenha sido atingido.

2. Imunização intranasal

  1. Prepare a solução de imunização antes do manuseio de animais.
  2. Sedar o coelho como descrito acima.
  3. Uma vez que o membro do laboratório esteja pronto para administrar a vacina e o coelho esteja em um plano adequado de anestesia, desligue o isoflurane e o oxigênio e remova o cone do nariz.
  4. Coloque o coelho em recumbência dorsal, e apoie o pescoço e a cabeça em um ângulo aproximado de 45° que permite fácil acesso e visualização de ambos os nares pelo membro do laboratório que administra a vacina.
  5. Carregue a pipeta com no máximo 100 μL da solução vacinal e administre rapidamente a solução em cada narina. A pipeta deve ser mantida em um ângulo aproximado de 45°, em ângulo em direção ao aspecto medial da passagem nasal.
    NOTA: O objetivo da imunização é que a solução entre em contato com a membrana mucosa dos nares, de modo que a ponta não deve ser colocada dentro das nares, pois isso pode resultar em abrasão ou irritação dos tecidos mucosos e potencialmente influenciar a imunogenicidade da vacina administrada nasalmente. A vacina deve ser administrada rapidamente e feita da mesma forma na outra nare.
  6. Seguindo a administração em ambas as passagens nasais, mantenha o coelho em recumbência dorsal por 30 segundos para minimizar o vazamento da solução vacinal.
    NOTA: O laboratório normalmente não administrará mais de 100 μL por narina por vez. Se um volume maior for administrado, com um total máximo de 500 μL, a vacina pode ser dada em alíquotas de 100 μL com um período de descanso de 30 segundos entre as imunizações, e administrações adicionais da vacina repetidas, com 30 segundos de descanso entre cada administração, até que o volume total da vacina seja entregue.
  7. Após a imunização, coloque o coelho no ventrum para recuperação e monitore de perto o animal até que ele possa manter a recumbência severa.

3. Coleta de leite

  1. Sedar o coelho lactado como descrito acima.
  2. Limpe a pele sobre a veia marginal da orelha com o cotonete/limpeza de álcool.
  3. Usando uma seringa de 1 mL e agulha de 25 g, administre aproximadamente 1-2 UI de ocitocina por via intravenosa através da veia auditiva marginal para induzir a desapontamento do leite.
    NOTA: Devido ao relaxamento muscular suave, é comum que o coelho urinar ou defecar após a administração da ocitocina.
  4. Após a administração da ocitocina, aplique pressão no local da injeção com o pedaço de gaze.
  5. Enquanto mantém a máscara de anestesia sobre o nariz do coelho, apoie o coelho em seu traseiro.
    NOTA: A coleta de leite também pode ser realizada com o animal em recumbência lateral, mas o laboratório descobre que a coleta é mais fácil quando o coelho é apoiado em sua garupa com um assistente segurando o coelho ereto com a máscara de anestesia.
  6. Abra o tubo estéril para preparar para a coleta de leite e localizar o tecido mamário e as associadas. As são tipicamente cercadas por peles molhadas da enfermagem recente, e o tecido mamário é facilmente palpável quando cheio de leite.
  7. Segure o tecido mamário associado a uma entre o polegar e o indicador e aplique uma pressão suave e massageada no tecido glandular na direção da. Coloque o tubo de coleta sobre a para coletar o leite expresso.
    NOTA: Às vezes pode levar vários minutos para que a ocitocina seja eficaz, e a produção de leite parece variar entre as glândulas mamárias. Se a expressão do leite não for bem sucedida, espere vários minutos ou gire para as glândulas mamárias adicionais. O leite de todas as pode ser coletado no mesmo frasco. Normalmente, vários mililitros de leite podem ser facilmente coletados de um doe lactante.
  8. Após a coleta de leite, desligue o isoflurane e o oxigênio, e permita que o coelho se recupere enquanto é monitorado de perto até que o animal seja capaz de manter a recumbência severa.

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Resultados

Uma visão geral de um desenho típico do estudo de imunização intranasal materna é retratada na Figura 1, incorporando as imunizações, reprodução, kindling, lactação e transferência de anticorpos. Embora não ilustrado, o sangue deve ser coletado antes da imunização inicial para medições de linha de base e durante todo o restante do estudo em intervalos regulares. O sangue é facilmente obtido através da artéria do ouvido central com sedação leve e um agente analgésico t?...

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Discussão

Embora não descrito no protocolo acima, a reprodução bem sucedida dos coelhos é necessária para este modelo materno e para permitir a coleta de leite. Coelhos são facilmente criados por cobertura ao vivo em um ambiente de pesquisa. Recomenda-se que seja transferido para a gaiola do dólar para reprodução, assim como pode ser territorial e agressivo se mantido em sua própria gaiola com o dólar. Se as fêmeas não são receptivas após 15 minutos (como indicado por fugir mordendo, ou vocalizando), a doe deve ser ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer a Divisão de Recursos Animais Laboratoriais da Universidade duke e sua equipe de criação por sua assistência e muito cuidado prestado aos animais. Além disso, os autores gostariam de reconhecer a equipe do PhotoPath dentro do Departamento de Patologia para sua assistência com as partes de áudio e vídeo do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por fundos de pesquisa discricionários do laboratório Staats.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needle (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Mucosal VaccineN/AN/AExperimental Vaccine
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
Pipette TipsVWR53503-290
PipettorVWR89079-962
PromAce (Acepromazine maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-plyCovidien07-839-8871
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needles (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4)Covidien07-891-5815
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL)Falcon14-959-49B

Referências

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